本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝素結(jié)合表皮生長因子 (heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)是一個22KD，O-糖基化的蛋白質(zhì)，屬于EGF家族中的一員，對成纖維母細胞、平滑肌細胞和上皮細胞等具有促有絲分裂作用。HB-EGF參與很多生理過程，也跟許多病理過程有關(guān)，如傷口愈合，眼瞼形成，胚胎植入，心臟發(fā)育；也跟許多病理過程有關(guān)，如動脈粥樣硬化，平滑肌增生，腦損傷以及腫瘤發(fā)生。

越來越多的證據(jù)顯示HB-EGF信號通路的異常調(diào)節(jié)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中主要引發(fā)癌癥的機制有促進腫瘤生長、血管生成以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，所以抑制或中和HB-EGF的活性是治療很多癌癥的措施。惡性卵巢癌病人腹水促進細胞增殖能力比良性卵巢腫瘤病人和正常人腹水的促進細胞增殖能力高很多，而且它們的活性僅僅使用EGFR和HB-EGF抗體就能被抑制。惡性卵巢癌病人腹水中的細胞存活率相對于后兩者也大大提高，而且同樣受到HB-EGF抗體的抑制。HB-EGF抗體降低了惡性膠質(zhì)瘤細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖；識別sHB-EGF并對其有高度親和力的抗體Y-142 抑制卵巢癌細胞系SKOV3、乳腺癌細胞系T47D、結(jié)腸癌細胞系SW480中 HB-EGF 誘導(dǎo)的VEGF的產(chǎn)生和血管生成，且抑制效果比EGFR抗體西妥昔單抗和白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197的效果好。

目前研發(fā)和臨床研究中的卵巢癌的靶向治療藥物主要有靶向性受體阻斷劑，腫瘤血管生成抑制劑以及針對卵巢癌、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）和基質(zhì)金屬蛋白酶的單克隆抗體或嵌合抗體，但未有大規(guī)模的臨床應(yīng)用。

此外，臨床實驗證明，HB-EGF的表達水平增高與病人的臨床預(yù)后和抗化療形成密切相關(guān)。HB-EGF有可能調(diào)節(jié)抗細胞凋亡效應(yīng)如ERK-和Akt-信號通路，或促細胞凋亡效應(yīng)JNK- 和 p38-信號通路，從而導(dǎo)致細胞化療抗性的產(chǎn)生。由于HB-EGF的表達和成熟都可以被溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA)的活化特異性調(diào)控，且sHB-EGF作為分泌因子很容易被檢測到，因此HB-EGF被認為是輔助抗LPA治療手段中的生物標志物，目前市場上也有多家公司的ELISA試劑盒可進行HB-EGF的檢測。

目前不管是臨床還是科研用ELISA試劑盒中所用HB-EGF抗體都是源自傳統(tǒng)多克隆和單克隆抗體，或者人鼠嵌合抗體，這些抗體穩(wěn)定性差，生產(chǎn)成本高，對于臨床治療和檢測都有所限制。1993年比利時科學(xué)家首次在Nature報道：駱駝血液中的一種缺失輕鏈的抗體能夠像正常抗體一樣與抗原等靶標高親和力結(jié)合，且不像單鏈抗體（scFV）一樣容易聚集。這種抗體只包含一個重鏈可變區(qū)和兩個常規(guī)CH2，CH3區(qū)，原核表達出來的VHH區(qū)具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和結(jié)合活性，分子量更小，只有正?？贵w的1/10，所以VHH（單域抗體）也稱為Nanobody（納米抗體）。將單域抗體VHH表達在噬菌體表面，經(jīng)過“吸附-洗脫-擴增”過程篩選并富集特異性抗體，這就是噬菌體抗體庫技術(shù)。這是一種極為高效的抗體表達、篩選體系，所以用其篩選生產(chǎn)單域抗體，周期更短，穩(wěn)定性更好，可溶性高，可用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本更低，具有廣闊的前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種針對肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體，同時提供該單域抗體的編碼序列及該單域抗體在制備檢測以及抑制腫瘤的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體（Dab），其VHH鏈包括框架區(qū)FR和互補決定區(qū)CDR，所述框架區(qū)FR包括SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4序列片段；

所述互補決定區(qū)CDR包括SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3的序列片段；

優(yōu)選地，所述的肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體的VHH鏈，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本發(fā)明還提供一種肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體，它是針對肝素結(jié)合表皮生長因子表位的單域抗體，包括具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH鏈。

本發(fā)明還提供了一種DNA分子，它編碼本發(fā)明所述的肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體VHH鏈的蛋白質(zhì)或本發(fā)明所述的肝素結(jié)合表皮生長因子單域抗體的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，所述的DNA分子，具有SEQ ID NO：9的DNA序列。

本發(fā)明還提供一種表達載體，所述載體為能夠表達本發(fā)明所述單域抗體的重組載體

pET28a-Dab，所述載體包含SEQ ID NO：9所示的DNA序列。

本發(fā)明還提供一種宿主細胞，所述細胞含有本發(fā)明所述的表達載體，具有表達本發(fā)明

所述單域抗體的能力。

本發(fā)明還提供了所述的肝素結(jié)合表皮生長因子單域抗體用于檢測肝素結(jié)合表皮生長因子的用途，所述用途為單域抗體在制備檢測肝素結(jié)合表皮生長因子ELISA試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述的肝素結(jié)合表皮生長因子單域抗體用于抑制癌細胞遷移和浸潤的應(yīng)用，以及在制備抑制癌細胞遷移和浸潤的藥物中的應(yīng)用。

所述的序列信息如下：

SEQ ID NO. 1：MKKLLFAIPLVVPFYAAQPAMAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS

SEQ ID NO. 2：MGWVRQAPGKGLEWVSS

SEQ ID NO. 3：YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

SEQ ID NO. 4：WGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLNSAAHYTDIEMNRLGKGAA

SEQ ID NO. 5：GVIFITYD

SEQ ID NO. 6：INTNNGST

SEQ ID NO. 7：ATGGWYGHKRLDSAHLRS

SEQ ID NO. 8：

MKKLLFAIPLVVPFYAAQPAMAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVIFITYDMGWVRQAPGKGLEWVSSINTNNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGGWYGHKRLDSAHLRSWGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLNSAAHYTDIEMNRLGKGAA

SEQ ID NO. 9：

ATGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGTTATCTTTATCACTTACGATATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAAGCATTAATACCAATAACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGACTGGGGGTTGGTATGGGCATAAGAGGCTGGATTCCGCGCACTTGAGGTCTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTCGGCCGCACATTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAG

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：

利用噬菌體篩選技術(shù)篩選得到針對肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體基因序列，將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的單域抗體株。純化得到的單域抗體能夠結(jié)合肝素結(jié)合表皮生長因子，并在體外能夠抑制卵巢癌細胞的遷移和浸潤。該發(fā)明肝素結(jié)合表皮生長因子單域抗體，大小較小，穩(wěn)定性好，容易運輸，體內(nèi)也易于穿透細胞；易于實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，過程耗時短，成本低，操作易行，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為噬菌體單域抗體庫篩選流程圖，其中A為以HB-EGF為靶分子，用噬菌體單域抗體

庫與預(yù)先固定好的靶分子結(jié)合；B洗掉未結(jié)合的噬菌體；C用胰蛋白酶將特異性結(jié)合的噬菌體從靶分子上切割下來；D將洗脫下來的噬菌體擴增后進行下一輪篩選；E按照A、B、C、D進行3輪淘篩，最終富集到與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體并測序獲取核酸序列；圖中，表示噬菌體，表示噬菌體單域抗體庫，表示HB-EGF靶分子，表示與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體。

圖2是用噬菌體的酶聯(lián)免疫法（ELISA）鑒定特異性單個陽性克隆的模式圖；其中1是將HB-EGF偶聯(lián)在酶標板上，2是單域抗體，3是鼠抗Myc抗體，4是山羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記抗體，5是辣根過氧化物酶顯色液TMB；左邊無色圓圈表示未顯色底物，右邊黑色圓圈表示被過氧化物酶催化后顯色。

圖3是表達的HB-EGF單域抗體，經(jīng)Protein L親核層析純化后的SDS-PAGE電泳圖；其中泳道M為蛋白分子標準；泳道1為HB-EGF單域抗體表達菌全菌裂解物；泳道2為未結(jié)合Protein L親和介質(zhì)的流出樣品；泳道3，4，5，6為用平衡緩沖液（20 mM Na₂HPO₄,0.15 M NaCl,pH 7.0）洗滌介質(zhì)流出樣品；泳道7，8為用洗脫緩沖液（0.1 M glycine, pH 2.5）洗脫下來的單域抗體。

圖4是將生物素化的HB-EGF單域抗體用于HB-EGF的ELISA檢測結(jié)果。HB-EGF+DAb表示用HB-EGF作為抗原，單域抗體DAb作為一抗；SKOV3+DAb表示用卵巢癌細胞SKOV3裂解物作為抗原，單域抗體DAb作為一抗；DAb表示不加入抗原直接加入DAb的陰性對照。

圖5為HB-EGF單域抗體對于卵巢癌SKOV3細胞的浸潤抑制試驗結(jié)果；圖中a為對照組（不加試劑），b為實驗組（加入200μL實施例3中純化好的HB-EGF單域抗體（Dab），終濃度為30μg/mL）。

圖6為HB-EGF單域抗體為對于卵巢癌SKOV3細胞的浸潤抑制試驗定量結(jié)果。

圖7為HB-EGF單域抗體對卵巢癌細胞SKOV3的遷移抑制試驗結(jié)果。

圖8為單域抗體對SKOV3細胞劃痕實驗遷移速率的影響折線圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例1：針對肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體篩選

(1)將100μg/mL編碼肝素結(jié)合表皮生長因子氨基酸第63-149位的部分蛋白（P6018，購自于亞諾法生技股份有限公司）用PBS包被在Nunc的免疫管中，4℃放置過夜。

（2）第二天加入5mL 5%脫脂牛奶，室溫封閉2小時；

（3）2小時后加入1mL單域抗體噬菌體展示庫（6001_hDAb，購自于英國Source Biosciences公司），室溫下孵育1小時；

（4）用PBST（含0.05%吐溫20的PBS，SN330-2，購自于南京生興生物技術(shù)有限公司）洗20遍；

（5）加入100μg/mL胰蛋白酶（T1426，購自于sigma公司）室溫孵育1小時，加入的胰蛋白酶溶液需要充滿整個免疫管，獲得與HB-EGF特異性結(jié)合的噬菌體，并感染對數(shù)生長期的大腸桿菌TG1（6001_hDAb，購自于英國Source Biosciences公司），產(chǎn)生并純化噬菌體用于下一輪篩選；

（6）在不斷篩選過程中，陽性克隆不斷富集，從而達到了利用噬菌體展示技術(shù)淘篩抗體庫中HB-EGF特異性單域抗體的目的。

實施例2：用噬菌體的ELISA篩選特異性單陽性克隆

（1）從實施例1中富集的噬菌體克隆中，挑選96個單菌落并接種于含有100μg/mL的氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基（1L TB培養(yǎng)基中含2.3g磷酸二氫鉀，12.52g磷酸氫二鉀，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油）中，至對數(shù)生長期后，加重濃度1mM的IPTG，28℃培養(yǎng)過夜；

（2）培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移到經(jīng)肝素結(jié)合表皮生長因子氨基酸第63-149位的部分蛋白（ P6018，購自于亞諾法生技股份有限公司）包被的ELISA板中（該孔為樣品孔，對照孔是加入PBS替代培養(yǎng)上清），在室溫下放置1小時；

（3）用PBST洗去未結(jié)合抗體，加入一抗mouse anti-myc 9E10 antibody（抗myc鼠抗，購自Santa Cruz生物技術(shù)公司），在室溫下放置1小時；

（4）PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入二抗anti-mouse HRP conjugated secondary antibody(羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記二抗，購自武漢三鷹生物科技有限公司)，室溫下放置1小時；

（5）PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入辣根過氧化物酶底物TMB（購自于KPL公司）反應(yīng)30分鐘，加入鹽酸，于450nm下讀數(shù)。樣品孔OD大于對照孔3倍以上判為陽性克隆。

（6）將陽性克隆在含有100μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)提取質(zhì)粒進行測序。

根據(jù)序列比對軟件Vector NTI及IMGT分析軟件分析基因序列，解析其FR區(qū)域和CDR區(qū)域，并獲得單域抗體VHH鏈氨基酸序列。

實施例3：單域抗體在大腸桿菌的表達純化

（1）將測序分析獲得的單域抗體核苷酸序列克隆至表達載體pET28a（購自于Life Technology公司），形成能夠表達單域抗體的原核表達重組質(zhì)粒pET28a-Dab，并將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌BL21（DE3）（購自于Life Technology公司）中，涂布在含100μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜；

（2）挑選單菌落接種在3mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜；

（3）接種2mL過夜菌種至200mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD值達到0.5，加入IPTG，28℃培養(yǎng)過夜；

（4）離心收菌，菌體破碎，經(jīng)Protein L親和層析柱純化蛋白，用洗脫緩沖液（0.1 M glycine, pH 2.5）洗脫單域抗體。圖3是表達的HB-EGF單域抗體，經(jīng)Protein L親核層析純化后的SDS-PAGE電泳圖，圖3泳道M為蛋白分子標準；泳道1為HB-EGF單域抗體表達菌全菌裂解物；泳道2為未結(jié)合Protein L親和介質(zhì)的流出樣品；泳道3，4，5，6為用平衡緩沖液（20 mM Na₂HPO₄,0.15 M NaCl,pH 7.0）洗滌介質(zhì)流出樣品；泳道7，8為用洗脫緩沖液（0.1 M glycine, pH 2.5）洗脫下來的單域抗體。圖3表明篩選到的HB-EGF單域抗體能夠通過大腸桿菌系統(tǒng)大量表達，并通過L蛋白進行純化，所獲得的單域抗體蛋白的純度大于70%。通過此方法獲得抗體簡單地獲得大量目標抗體，成本低廉。

實施例4：應(yīng)用單域抗體ELISA檢測HB-EGF分析

（1）HB-EGF單域抗體的生物素化：將純化好的單域抗體測定濃度。用DMF將BNHS（H1759，購自于sigma公司）配成1mg/mL溶液，再用0.1mol/L pH9.0的NaHCO₃將單域抗體稀釋成1mg/mL，按BNHS：抗體體積比1：8～1：15震蕩混勻，室溫靜置3～4小時，4℃透析過夜。

（2）將購買的HB-EGF多抗（LS-C166803/44318，Lifespan，美國）包被在酶標板上，再分別加入HB-EGF抗原、卵巢癌SKOV3細胞裂解物及不加任何物質(zhì)作為陰性對照，室溫下放置1小時；

（3）用PBST洗滌，并加入步驟（1）獲得的生物素化HB-EGF單域抗體；

（4）PBST洗去未結(jié)合抗體，加入HRP標記的鏈酶親和素（016-030-084，購自于Jackson ImmunoResearch Laboratiories公司）作為二抗，孵育1小時；

（5）PBST洗滌，加入TMB底物（購自于KPL公司）反應(yīng)30分鐘，加入硫酸，450nm處讀取OD值。

結(jié)果如圖4所示，圖中HB-EGF+DAb表示用HB-EGF作為抗原，單域抗體DAb作為一抗；SKOV3+DAb表示用卵巢癌細胞SKOV3裂解物作為抗原，單域抗體DAb作為一抗；DAb表示不加入抗原直接加入DAb的陰性對照。結(jié)果顯示本發(fā)明純化獲得的單域抗體可以用于ELISA方法檢測HB-EGF抗原以及類似SKOV3細胞裂解物這樣含HB-EGF的樣品中的HB-EGF含量。

實施例5：細胞遷移實驗

（1）制備卵巢癌細胞SKOV3懸液：用PBS（SN330-2，購自于南京生興生物技術(shù)有限公司）清洗SKOV3細胞，吸走PBS，加胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司，美國）消化，用含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基（均購自于Gbico公司）吹打混勻，終止消化，離心吸走上清液，用含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，稀釋相應(yīng)倍數(shù)后，調(diào)整細胞密度至2×10⁵個/mL，使用血球計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞密度至2×10⁵個/mL。

（2）接種細胞：將調(diào)整好后的細胞懸液吹打混勻，各取200μL分別加入實施例3中純化好的HB-EGF單域抗體作為實驗組（終濃度為30μg/mL）及不加試劑作為對照，加入到Transwell小室（購自于Corning公司）中，最后在小室底部加500μL含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基，按照正常細胞培養(yǎng)規(guī)則培養(yǎng)，定期觀察。

（3）結(jié)果統(tǒng)計：用鑷子夾出小室，用棉簽輕輕擦去剩余在上室內(nèi)的貼壁細胞。再用0.1%結(jié)晶紫（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）染色15-20分鐘，用PBS洗3遍。然后取一干凈載玻片，表面滴一滴清水，將Transwell小室放在清水上就可清楚看到小室底膜下室側(cè)附著的細胞，用顯微鏡觀察和拍照，隨機選5-10個視野拍照。最后收集圖片，統(tǒng)計分析。

實驗結(jié)果如圖5，圖6，將Transwell小室下室進行計數(shù)，對于卵巢癌細胞SKOV3，經(jīng)過三次獨立實驗，將對照組(control)和實驗組（DAb）遷移的細胞數(shù)進行百分比對比分析，結(jié)果表明單域抗體處理過的SKOV3細胞透過Transwell小室的數(shù)目明顯減少，表明單域抗體可以顯著降低卵巢細胞SKOV3的浸潤，具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖6是將圖5結(jié)果數(shù)字定量的結(jié)果，可以明顯的看出單域抗體對卵巢癌細胞SKOV3的遷移抑制作用顯著，其差距具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明我們篩選到的HB-EGF抗體能夠顯著地抑制卵巢癌細胞SKOV3的浸潤。

實施例6：細胞劃痕實驗

（1）種板：將T25瓶SKOV3細胞培養(yǎng)和傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2mL PBS清洗，0.5mL胰酶消化，加2mL含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基吹打混勻，146g離心5分鐘，棄上清，加含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5mL到EP管，用槍吸取10μL與細胞計數(shù)板上計數(shù)。每孔種4000個細胞，于V形槽內(nèi)混勻。種到24孔板中，實驗組（DAb）中加入單域抗體至終濃度為100μg/mL，對照組不加單域抗體，正常培養(yǎng)細胞。

（2）劃痕：用10μL白色槍頭盡量垂直于孔表面劃直線，劃兩條直線呈十字狀。劃完開始拍照（0h），以后每過6h就拍一次照，直至劃痕愈合為止。最后采集圖片，統(tǒng)計分析。

SKOV3細胞經(jīng)過處理后，分別在0h，6h，12h，24h，30h和36h采集圖片，經(jīng)過三次獨立實驗后，將各組遷移距離進行統(tǒng)計分析。結(jié)果如圖7，圖8所示，單域抗體處理后的SKOV3細胞較未處理對照組遷移變慢，表明HB-EGF單域抗體一定程度上可以抑制卵巢癌細胞SKOV3的遷移。圖8是圖7結(jié)果數(shù)字定量的結(jié)果，是經(jīng)過三個生物學(xué)重復(fù)后統(tǒng)計匯總分析得到單域抗體對SKOV3細胞劃痕實驗遷移速率的影響折線圖，表明篩選到的HB-EGF抗體能夠抑制腫瘤細胞SKOV3的遷移。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明精神和原理前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇大學(xué)

<120> 一種肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體及其應(yīng)用

<130> 一種肝素結(jié)合表皮生長因子的單域抗體及其應(yīng)用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

35 40 45

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 4

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln

1 5 10 15

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Ala His Tyr Thr Asp

20 25 30

Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys Gly Ala Ala

35 40

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Val Ile Phe Ile Thr Tyr Asp

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ile Asn Thr Asn Asn Gly Ser Thr

1 5

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ala Thr Gly Gly Trp Tyr Gly His Lys Arg Leu Asp Ser Ala His Leu

1 5 10 15

Arg Ser

<210> 8

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Val Ile Phe Ile Thr Tyr Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Thr Asn Asn Gly Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Gly Trp Tyr Gly His Lys Arg

115 120 125

Leu Asp Ser Ala His Leu Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

130 135 140

Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

145 150 155 160

Asn Ser Ala Ala His Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

165 170 175

Gly Ala Ala

<210> 9

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgaaaaaat tattattcgc aattccttta gtggtacctt tctatgcggc ccagccggcc 60

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 120

cgtctctcct gtgcagcctc cggagttatc tttatcactt acgatatggg ctgggtccgc 180

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaagcatta ataccaataa cggtagcaca 240

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 300

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgact 360

gggggttggt atgggcataa gaggctggat tccgcgcact tgaggtcttg gggtcaggga 420

accctggtca ccgtctcgag cgcggccgca gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 480

aattcggccg cacattatac agacatagag atgaaccgac ttggaaaggg ggccgcatag 540