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一種用于檢測egfr基因t790m突變的探針、引物及試劑盒的制作方法

文檔序號:9392008閱讀:986來源:國知局
一種用于檢測egfr基因t790m突變的探針、引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體地涉及一種表皮生長因子EGFR基因外顯子 20T790M突變檢測的探針、引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類表皮生長因子受體家族(epidermalgrowthfactorreceptorfamily,EGFR 家族)屬于酪氨酸激酶受體家族,也被稱作ffiR家族或erbB家族。EGFR蛋白酪氨酸激酶 功能區(qū)由EGFR基因外顯子18-24編碼,其中外顯子18-20編碼N-Lobe,外顯子21-24編碼 C-Lobe。迄今為止發(fā)現(xiàn)的EGFR突變主要位于外顯子19至21,外顯子20上的T790M突變 是目前較為認(rèn)可的耐藥機制之一,通常是替代的點突變,2369位點上的C突變?yōu)門。因此 在臨床用藥選擇時,除敏感突變外,T790M耐藥基因的檢測也同樣重要。進(jìn)一步的研究亦證 明:NSCLC患者治療前的EGFR基因T790M突變與患者接受吉非替尼治療后的療效呈顯著負(fù) 相關(guān),因此通過檢測EGFR基因T790M突變來準(zhǔn)確地預(yù)測吉非替尼治療NSCLC患者獲得性耐 藥的發(fā)生是臨床實踐中切實可行的實驗診斷方法。
[0003] 目前常用的基因突變檢測方法有測序法和ARMS-PCR方法,這兩種方法均存在一 定的缺陷。測序法靈敏度較低約20%,且操作復(fù)雜,檢測時間較長,假陰性率較高。ARMS-PCR 方法能夠達(dá)到1 %的靈敏度,對于腫瘤組織樣本能夠滿足檢測需求,但是對于取樣方便的血 液樣本,如血漿或者血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞,腫瘤DNA含量往往低于1 %,ARMS-PCR方法不 足以對血液進(jìn)行檢測,局限了臨床醫(yī)生對靶向藥物療效的判斷。此外,在臨床用藥過程中產(chǎn) 生的耐藥性突變,以前的方法由于靈敏度不夠也無法進(jìn)行檢測。因此,從這些低含量樣本中 檢測突變的基因,需要找一種靈敏性高、特異性強、簡便易行、結(jié)果判定簡單的突變檢測方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種高靈敏度檢測EGFR基因T790M突變的試劑盒。
[0005] 在本發(fā)明的一方面,提供一種檢測EGFR基因T790M突變基因突變檢測的引物和探 針,其特異引物與探針包括如下序列:
[0006] 表1EGFR基因T790M突變基因特異性雙引物和探針核苷酸序列
[0007] E-20-VI! -R)(>:CTC'A?'TtXACa.;T(i(:ARrTrATC'ATSRQIDNO: ()i E-2U-RI0:C-八T'ATTGT(下r「(.;TGTTCCCTiGACASfTQIDN(.): 02 E-.?Ji-P-C5:FAM-0\T(.K.、CCTTC(.;GCTG(.TTrrr-BHQ! SHQIDNO: 03 E.-2().-Vli-Bl(K:k:CTCACCTC(.VKCC(.n'GCARCTCAT(;ACCA.-NH2 SRQIDNO: 04 l〈-EX2:W:i: (X'TGAGGTAGGAGAATCGrrTGAAS「:Q!DNO: 05 K-EX23-RI:TGGAGTCTTGCTCTGTTCjC'CTASRQIDNO: 06 K-EX23-m:HEX-GCAGTGACTVGAGATCGTGTCACT-BHQISRQIDNO: 07
[0008] 本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測EGFR基因T790M突變的試劑盒,所述試劑盒 包括:P-T790M混合酶、P-T790M陽性對照和P-T790M反應(yīng)液。反應(yīng)液內(nèi)裝有相應(yīng)的T790M基因突變檢測和內(nèi)控試劑,突變由FAM信號指示,內(nèi)控由HEX(或VIC)信號指示,內(nèi)控作為 結(jié)果判讀的一部分,選擇的檢測區(qū)域是人類EGFR基因相對保守的區(qū)段,約100bp,這樣即便 DNA有降解,內(nèi)控仍然能夠最真實地反應(yīng)T790M基因有效的DNA量。
[0009]表2試劑盒組成
[0010]
[0011] 本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測EGFR基因T790M突變的PCR反應(yīng)擴增體系如 下:
[0012] lOxPCR緩沖液 內(nèi)控上游引物 50-150 內(nèi)控下游引物 50-150UM 內(nèi)控HEX探針 50-150uM 突變上游引物 50-150 突變下游引物 50-150 突變FAM探針 50-150uM Block引物 50-15011M Taq酚 0.2-0.8UL dNTP 15~35rnM MgC!2I50~350mM 補純化水至 65nL
[0013] 本發(fā)明再一方面,提供一種檢測T790M突變的方法(所述方法用于非診斷目的), 所述方法包括以下步驟:
[0014] (1)根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)公布的人類EGFR為野生型基因序列,針對EGFR基因20號外 顯子T790M突變,設(shè)計特異性引物和探針。
[0015] (2)提取血漿檢測樣本中的DNA。
[0016] (3)配制實時熒光PCR擴增反應(yīng)體系。
[0017] (4)根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷檢測結(jié)果:利用特異性引物和熒光探針 進(jìn)行PCR檢測,突變由FAM信號指示,內(nèi)控由HEX(或VIC)信號指示,通過計算ACt的大小 進(jìn)行判斷,
[0018]ACt=CtFAM_CtHEX,ACt小于8為陽性,反之為陰性。
[0019] 本發(fā)明基于ARM-PCR平臺,開發(fā)一種高靈敏度檢測EGFR基因T790M突變的試劑 盒。本試劑盒以血漿DNA為檢測樣本,通過檢測EGFR基因T790M突變,可預(yù)測吉非替尼治 療NSCLC患者獲得性耐藥的發(fā)生,為臨床靶向治療提供依據(jù)。本檢測方法靈敏度高,檢測時 間只需120分鐘即可完成,同時具備了特異性好,準(zhǔn)確率高,價廉快速,操作簡單等優(yōu)點,可 以滿足臨床快速檢測的實際需求。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用了特異性引物和探針技術(shù),可以實現(xiàn)血液樣本 EGFR基因T790M的快速檢測。本發(fā)明:(1)引物設(shè)計上,將引物上SNP位點設(shè)計為G/A兼并 堿基,兼容了所有的效率,提高了擴增效率;⑵靈敏度高,檢測靈敏度可達(dá)2%。;⑶與采用 數(shù)字PCR方法比較,操作簡單,節(jié)約成本,臨床應(yīng)用范圍廣;(4)大反應(yīng)體積血漿樣本檢測, 使血漿樣本DNA上樣量變大,體系更穩(wěn)定,增大了血漿樣本的檢出率;(5)檢測速度快,檢測 過程只需要120分鐘即可完成,耗時僅需數(shù)字PCR的二分之一;(6)本發(fā)明檢測方法能夠檢 測外周血標(biāo)本,從而具有采樣方便,能夠動態(tài)檢測的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1為靈敏度分析試驗結(jié)果PCR圖。
[0022] 圖2為檢測臨床樣本EGFR基因T790M陽性PCR圖之一;
[0023] 圖3為檢測臨床樣本EGFR基因T790M陽性PCR圖之二
[0024] 圖4為檢測臨床樣本EGFR基因T790M陰性PCR圖。
【具體實施方式】
[0025] 以下結(jié)合具體實施例,對本發(fā)明進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解,這些實施例僅用于本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義或說明,本專利所述的科學(xué)術(shù)語與本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員所理解具有相同的含義。
[0026] 實施例1
[0027] 本實施例以細(xì)胞系檢測本發(fā)明體系,以H1975細(xì)胞系突變?yōu)殛栃裕躁幮匝獫{樣 本做對照。利用本發(fā)明實時熒光PCR檢測EGFR基因T790M突變的方法包括如下步驟:
[0028] (1)檢測樣本處理與DNA的提?。?br>[0029] 細(xì)胞系的DNA提取方法如下:加入蛋白酶K和BufferATL,56 °C消化裂解1小 時,加入200mLBufferAL混勻再加入200yL無水乙醇充分混勻,將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2mL離心柱中,6000Xg(8000rpm)離心lmin,加入 500iiLBufferAWl,6000Xg(8000rpm) 離心lmin,小心打開蓋子加入500iiLBufferAW2,6000Xg(8000rpm)離心lmin,空管 離心20000Xg(14000rpm)離心3min,加入lOOuLBufferATE于膜中央,溫育5分鐘, 20000Xg(14000rpm)離心lmin。
[0030] 血漿DNA的提取方法如下:移取4mL樣品加入10mL圓底離心管中,加入1. 8mL BufferQ)L,再加入 50yLProfeinaseKSolution,充分混勾 10s;放入水浴鍋中,63°C消 化15min,快速冷卻至室溫,加入400yLDNATracer,混勻后,再加入3. 3mL預(yù)冷的異丙醇, 上卜顛倒混勾,l〇〇〇〇Xg離心5min;沉淀中加入470yLBufferCDB和10yLProteinase KSolution,搖勻,放入水浴鍋中,63°C消化10min;冷卻至室溫,加入200yL無水乙醇,將 沉淀吹打混勻;將沉淀混合液全部移入吸附柱中,lOOOOXg離心30s,倒掉收集管中的液 體;往DNA吸附柱中加入700yLBufferCWl,10000Xg離心30s,倒掉收集管中的液體;往 DNA吸附柱中加入700yLBufferCW2, 10000Xg離心30s,倒掉收集管中的液體;往DNA吸 附柱中加入700yL無水乙醇,lOOOOXg離心30s,丟棄收集管;換用新的收集管,13000Xg 離心5min,丟棄收集管;將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1. 5mL離心管中,往DNA吸附膜中心滴 加 30-100yLBufferCD
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