一種基于鏈置換放大和DNAzyme放大的檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于鏈置換放大和DNAzyme放大的檢測 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化DNA甲基化，在調(diào)芐基因表達和發(fā)育方面起關(guān)鍵作用。異常的 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性導(dǎo)致異常的DNA甲基化，這與許多類型的疾病如癌癥密切相關(guān)。顯然， DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性被認為是一種潛在的癌癥生物標志物和癌癥治療中的藥物作用靶點。 因此，發(fā)展一種靈敏、選擇性的方法用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析和其抑制劑（抗甲基化 藥物）的篩選對于早期癌癥診斷和治療至關(guān)重要。
[0003] 用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測的傳統(tǒng)方法包括凝膠電泳、高效液相色譜和放射性 標記法。盡管這些方法已經(jīng)很好的建立，但大多數(shù)存在耗時、費力或需要放射性試劑等缺 點。為了克服這些缺陷，現(xiàn)有技術(shù)開發(fā)了新的方法包括熒光、比色、化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)方法 用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測。在這些方法中，熒光方法由于簡單、靈敏的特點受到廣泛的 關(guān)注。除了基于碳納米材料的異相方法，目前建立了許多熒光方法用于均相分析檢測DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性。LiJun等發(fā)展了一種基于發(fā)夾熒光DNA探針的簡單熒光方法，然而，由 于目標物和信號比為1:1，該方法的靈敏度相對較低，檢測限為0.8U/mL。為了提高檢測靈 敏度，許多信號放大策略包括DNAzyme放大、切割酶輔助的DNA循環(huán)反應(yīng)和外切酶III輔助 的DNA循環(huán)反應(yīng)，被應(yīng)用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測分析中。相比于發(fā)夾熒光DNA探針 為基礎(chǔ)的方法，這些方法的靈敏度提高了約一個數(shù)量級。然而為了滿足生物研究和臨床診 斷的發(fā)展需求，靈敏度需要進一步的改善。因此，仍然迫切需要發(fā)展一種靈敏的策略方法用 于分析DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，基于鏈置換放大和DNAzyme放大，發(fā)明人通過研 究，提供了一種雙放大熒光策略用于靈敏檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性。具體為：設(shè)計一種三功 能雙鏈DNA (dsDNA)探針，包括用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別的甲基化位點、用于合成DNAzyme 的8 - 17 DNAzyme互補序列、用于切割酶切割的切割位點。首先，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性 地識別和催化該三功能雙鏈探針發(fā)生甲基化，形成甲基化的dsDNA。隨后，Hpall限制性內(nèi) 切酶特異性地切割殘余的未甲基化的dsDNA。接下來，甲基化的dsDNA觸發(fā)鏈置換放大和 DNAzyme放大反應(yīng)，實現(xiàn)雙放大。
[0005] 具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：
[0006] 1、一種檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于，通過鏈置換反應(yīng)放大和 DNAzyme放大DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的識別信號；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用使得限制性內(nèi)切酶無法切 割探針序列，探針序列通過切割酶依賴的鏈置換反應(yīng)擴增出DNAzyme，進行信號一級放大； DNAzyme催化分子信標裂分釋放熒光信號，并重新釋放DNAzyme，進行信號的二級放大；缺 少DNA甲基轉(zhuǎn)移酶時，探針序列被限制性內(nèi)切酶切割，無法進行切割酶依賴的鏈置換反應(yīng)。
[0007] 具體的，所述方法包括如下步驟：
[0008] (1)制備用于進行鏈置換反應(yīng)的三功能雙鏈DNA(dsDNA)探針，探針包括雜交雙 鏈部分和懸垂單鏈部分，雜交雙鏈部分含有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別位點，和包含該位點的限 制性內(nèi)切酶的識別位點，垂懸單鏈部分包括鏈置換反應(yīng)切割酶識別的切割位點、用于合成 DNAzyme的DNAzyme互補序列；
[0009] (2)加入步驟（1)探針所對應(yīng)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶孵育，然后加入步驟（1)探針所對 應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行反應(yīng)；
[0010] (3)對步驟（2)反應(yīng)獲得體系進行酶滅活，然后進行切割酶依賴的鏈置換反應(yīng)，擴 增DNAzyme;
[0011] (4)加入DNAzyme識別的分子信標，進行信號檢測。
[0012] 其中，步驟⑴中，三功能雙鏈DNA(dsDNA)探針被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別催化后，無 法被對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶識別，因而可以引發(fā)鏈置換的聚合反應(yīng)；當DNA甲基轉(zhuǎn)移酶不存 在時，三功能雙鏈DNA(dsDNA)探針被對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶識別切割，切割后的片段無法引 發(fā)鏈置換的聚合和切割反應(yīng)，不能產(chǎn)生DNAzyme，無法產(chǎn)生增強的熒光信號。
[0013] 優(yōu)選的，三功能雙鏈DNA (dsDNA)探針由兩條單鏈P1和P2退火形成，P1序列對應(yīng) 三功能雙鏈DNA (dsDNA)探針的雜交雙鏈部分序列，P1為包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別位點的 單鏈，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別位點區(qū)域可被限制性內(nèi)切酶識別，P2序列按3' -5'順序依次為 P1互補序列、鏈置換反應(yīng)切割酶識別的切割位點、用于合成DNAzyme的DNAzyme互補序列。
[0014] 優(yōu)選的，三功能雙鏈DNA (dsDNA)探針的雜交雙鏈部分中P1的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識 別位點與3'端間的區(qū)域為2-7個堿基的抑制區(qū)域（或稱封閉區(qū)域、保護區(qū)域）；最優(yōu)選的， 抑制區(qū)域的堿基為5個。
[0015] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知曉抑制區(qū)域（或稱封閉區(qū)域、保護區(qū)域）的含義，其為雙鏈 DNA寡核苷酸上酶的識別位點與末端間的堿基，以保護酶的有效作用。
[0016] 優(yōu)選的，分子信標為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標，其兩端分別標記有焚光基團和猝 滅基團，與DNAzyme雜交，從而引發(fā)自身二級裂分，釋放焚光信號。
[0017] 在具體方案中，特別優(yōu)選的，P1序列為SEQIDN0:1所示，P2序列為SEQIDN0:2 所示。
[0018] 優(yōu)選所檢測的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶為M.SssI，所對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶為Hpall;限制性 內(nèi)切酶Hpall，識別序列Y-CCGG-3' ;M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶，識別序列Y-CG-3'。當識 別序列5' -CCGG-3'中3'端胞嘧啶被甲基化后可抑制限制性內(nèi)切酶Hpall的切割；而未 被甲基化時，限制性內(nèi)切酶Hpall可切割識別序列。
[0019] 更為優(yōu)選的，分子信標的序列為SEQIDN0:4所示。
[0020] 2、一種利用上述檢測方法進行DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑/拮抗劑篩選的方法，其 特征在于：在步驟（2)中，在加入DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶之前，加入不同濃度的候選抑制劑，進行 孵育。
[0021] 3、一種檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的試劑盒，其特征在于，包括：
[0022] 用于進行鏈置換反應(yīng)的三功能雙鏈DNA(dsDNA)探針，探針包括雜交雙鏈部分和 懸垂單鏈部分，雜交雙鏈部分含有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別位點，和包含該位點的限制性內(nèi)切 酶的識別位點，垂懸單鏈部分包括鏈置換反應(yīng)切割酶識別的切割位點、用于合成DNAzyme 的DNAzyme互補序列；
[0023] 可識別DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別位點區(qū)域的限制性內(nèi)切酶；
[0024] 鏈置換反應(yīng)體系，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶、切割酶、擴增原料 dNTPs；
[0025] 分子信標，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，與 DNAzyme雜交，引發(fā)自身二級裂分，釋放焚光信號。
[0026] 優(yōu)選的，三功能雙鏈DNA(dsDNA)探針由兩條單鏈P1和P2退火形成，P1序列對應(yīng) 三功能雙鏈DNA(dsDNA)探針的雜交雙鏈部分序列，P1為包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別位點的 單鏈，且限制性內(nèi)切酶的識別位點包含DNA甲基轉(zhuǎn)移酶識別位點位點，P2序列按3' -5' 順序依次為P1互補序列、鏈置換反應(yīng)切割酶識別的切割位點、用于合成DNAzyme的DNAzyme 互補序列。
[0027] 特別優(yōu)選的，P1序列為SEQIDNO: 1所示，P2序列為SEQIDN0:2所示。
[0028] 優(yōu)選所檢測的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶為M.SssI，所對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶為Hpall。
[0029] 更為優(yōu)選的，分子信標的序列為SEQIDN0:4所示。
[0030]本發(fā)明取得了以下有益效果：
[0031] (1)基于鏈置換放大和DNAzyme放大的雙放大策略，本發(fā)明所述方法可以實現(xiàn)高 靈敏檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，檢測限為0. 0082U/mL，檢測限低于現(xiàn)有報道的大多數(shù)檢 測限；
[0032] (2)本發(fā)明所述方法基于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的特異位點識別，因而本發(fā)明所述方法 具有良好的選擇性和特異性，并且甚至能檢測復(fù)雜生物基質(zhì)中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；
[0033] (3)通過使用兩種抗癌藥物5-氮雜胞苷和5-氮雜-2'-脫氧胞苷用于評估DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用，結(jié)果表明本發(fā)明所述方法在研究抗癌藥物對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性 的抑制影響和篩選DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑方面具有廣泛的應(yīng)用，因而在早期癌癥診斷和治 療中具有潛在的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0034] 圖1.基于鏈置換放大和DNAzyme放大的雙放大熒光策略用于靈敏檢測M. SssI甲 基轉(zhuǎn)移酶活性的原理。
[0035] 圖2. (A)不同條件下，M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶檢測策略的熒光發(fā)射光譜：(a) dsDNA+MB、（b)HpaII+dsDNA+MB、（c)M.SssI+HpaII+dsDNA+MB。（B)聚丙烯酰胺凝膠電泳表 征分析M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶：1-3 條帶分別是dsDNA、M.SssI+Hpall+dsDNA和Hpall+dsDNA。