專利名稱：用受體復(fù)合物三維模型篩選人白細胞介素-6的超激動劑、拮抗劑和超拮抗劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用三維模型篩選人白細胞介素-6(以下簡稱為hIL-6或IL-6)的超激動劑、拮抗劑和超拮抗劑的方法。
已知Genetec公司的WO92/21029教導(dǎo)了確定同生長激素和配體有相似結(jié)構(gòu)構(gòu)象的激動劑或拮抗劑的方法。這些潛在的激動劑和拮抗劑與激素受體相接觸會形成一個三元復(fù)合物，該復(fù)合物包含一分子潛在的激動劑或拮抗劑和兩分子被激動或拮抗的這樣的激素受體。配體分子誘導(dǎo)受體二聚化是由于配體有兩個不同的作用位點(位點1和位點2)，通過這兩個位點的誘變而產(chǎn)生激動劑或拮抗劑是可能的。
已知類似白細胞介素-6的細胞因子組中的配體，如制癌蛋白M(OSM)，白血病抑制因子(LIF)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和白細胞介素11(IL-11)誘導(dǎo)含膜分子gp130的受體復(fù)合物的形成。在此受體復(fù)合物中，這些細胞因子各自的特異受體和膜分子gp130總是共同元件。因此可以推斷位點1和位點2結(jié)合此類激素的兩種不同分子位點1結(jié)合特異受體，位點2結(jié)合gp130。鑒別所述兩個位點是可能的，從以下可以更清楚地看到這一點，即構(gòu)建基于人生長激素(hGH)受體序列和所研究的激素受體序列之間的功能相似性的三維模型。通過構(gòu)建攜帶野生型和突變型激素的絲狀噬菌體文庫(如M13)可分離到就野生型而論對特異受體(超激動劑或超拮抗劑)有更大親和力的突變體。
按照本發(fā)明，本發(fā)明所采用的與WO92/21029所采用的三維模型(如IL-6的)之間的差異導(dǎo)致鑒別出螺旋A和C的不同殘基作為位點2成員。實際上，按照本發(fā)明，就構(gòu)建IL-6模型而言，用不同細胞因子的結(jié)構(gòu)而不是生長激素結(jié)構(gòu)為模板。
人白細胞介素-6分子模型構(gòu)建如下，從文獻數(shù)據(jù)可知，人IL-6表現(xiàn)出與粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的氨基酸序列的相似性。以用X-射線晶體學(xué)測定的牛粒細胞集落刺激因子(bG-CSF)三維結(jié)構(gòu)為模板研究人IL-6殘基16到184的三維模型。首先，對比人IL-6與bG-CSF的氨基酸序列?；谘芑木€性排列，利用電腦化的相互作用圖表儀(Unit)中的分子模型構(gòu)建程序，將bG-CSF三維結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基用人IL-6對應(yīng)的殘基取代。排列對比過程中的缺失或插入(表明IL-6分子中不同的局部結(jié)構(gòu))的調(diào)整由分子模型構(gòu)建程序提供的選擇完成。
建立于bG-CSF結(jié)構(gòu)之上的這種IL-6三維模型使得能夠確定人IL-6及其兩個受體間相互作用的兩上位點低親和力受體gp80(位點1)和高親和力信號傳導(dǎo)受體gp130(位點2)。下述步驟用以確定這兩個位點。從序列對比可知，造血受體家族所有成員相互聯(lián)系，因為它們都有一個結(jié)構(gòu)域，即細胞因子結(jié)合域。序列的這種相似性也表明包括gp80和gp130這兩個IL-6受體在內(nèi)的眾多受體相應(yīng)部位很可能有結(jié)構(gòu)相似性。結(jié)合這些受體的細胞因子都有(或預(yù)計有)四螺旋束的相似結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果，有力支持了生物活性復(fù)合物中細胞因子及其受體通過細胞因子結(jié)合域相互作用必定是非常類似的(盡管不完全相同)這一觀點。
鑒于用X-射線晶體學(xué)確定了這些受體復(fù)合物(生長激素和生長激素二聚化受體的胞外域的復(fù)合物，即GHbp)之一的三維結(jié)構(gòu)，我們的bG-CSF基礎(chǔ)上建成的人IL-6的模型允許我們鑒別IL-6與其兩個受體gp80(位點1)和gp130(位點2)間相互作用的潛在位點。按照本發(fā)明，此任務(wù)已經(jīng)通過構(gòu)建gp80和gp130的結(jié)構(gòu)模型完成，模型構(gòu)建是基于用生長激素受體X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)和用我們的G-CSF基礎(chǔ)上建立的人IL-6模型代替這種復(fù)合物中生長激素所達成的一致性(見

圖1)。
如上所述，已知IL-6是一個184個氨基酸的多肽，屬于螺旋細胞因子類。它是多種細胞產(chǎn)生的多功能細胞因子。它作為諸如免疫系統(tǒng)細胞、肝細胞、腎細胞、造血干細胞、角質(zhì)形成細胞和神經(jīng)元等多種細胞系的分化和生長因子。
IL-6超激動劑的產(chǎn)生允許使用比許多嚴重疾病治療中所需的野生型IL-6劑量低的治療劑量。實際上，在治療乳腺癌、白血病、傳染病或與骨髓祖細胞失常有關(guān)的疾病中，IL-6有重要作用，并且應(yīng)用前景可觀。
另外，IL-6超激動劑可用于骨髓移植和基因治療中造血祖細胞離體擴增方案中。
另一方面，人IL-6拮抗劑和超拮抗劑可抑制眾多以IL-6過量為特征的疾病中IL-6的作用。這些疾病有慢性自體免疫疾病、骨髓瘤/漿細胞瘤、絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥和癌性惡骨質(zhì)。
按照本發(fā)明，篩選IL-6的超激動劑、拮抗劑和超拮抗劑包括以下步驟——比較中粒細胞集落刺激因子(bG-CSF)和所說激素的氨基酸序列。
——在上述比較基礎(chǔ)上，構(gòu)建IL-6三維模型，可通過該模型鑒別分別構(gòu)成與特異受體相互作用的位點(位點1)和與gp130相互作用的位點(位點2)的殘基。
為篩選IL-6超激動劑，按照本發(fā)明的方法還包括下述其它的操作步驟——建立一系列包含下述IL-6野生型殘基突變的噬菌體文庫(以與絲狀噬菌體蛋白融合產(chǎn)物的形式存在)螺旋ASer22，Glu23，Asp26，Arg30，Leu33，Ser37，Arg40，Glu42；環(huán)ABSer52，Ser53，Ala56，Leu57，Glu59.Asn60，Leu62，Leu64，Pro65，Lys66，Met67，Ala68，Glu69，Lys70，Asp71，Phe74，Gln75，Ser76；螺旋DHis164，Leu165，Arg168，Ser169，Lys171，Glu172，Phe173，Gln175，Ser176，Ser177，Leu178，Arg179，Ala180，Leu181，Arg182，Gln183，Met184；
——從屬于各個噬菌體文庫并表達IL-6變體的噬菌體混合群中篩選出比野生型白細胞介素與特異受體有更大親和力的噬菌體；和——通過測序從所選噬菌體粒子抽提的DNA來鑒別最佳受體結(jié)合氨基酸序列。
在這種情況下，可產(chǎn)生一系列以與M13pIII蛋白的融合產(chǎn)物存在的含IL-6的所說野生型殘基的變體的噬菌體文庫。
篩選本發(fā)明的IL-6拮抗劑的方法除上述建立人IL-6蛋白及其受體鏈的分子模型構(gòu)建操作外還包括下述操作步驟——用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)誘變鑒別為形成與gp130作用的位點的殘基(Arg30，Tyr31，Gly35，Ser37，Ala38，Ser118，Lys120，Val121，Gln124，Phe125，Gln127，Lys128和Lys129)；——評價以上產(chǎn)生的變體的生物學(xué)活性和與特異IL-6受體的親和力，用以鑒別與特異受體有正常親和力而生物學(xué)活性降低或喪失的白細胞介素6變體；和——評價上述作為拮抗劑的野生型IL-6變體在人細胞系上的生物學(xué)活性。
通過將決定拮抗活性的氨基酸序列的突變(以上鑒別的)和決定與IL-6特異受體增加的親和力的氨基酸突變相結(jié)合，可能獲得IL-6超拮抗劑。
在獲得白細胞介素6的拮抗劑或超拮抗劑的方法中，可以用選自聚合酶鏈反應(yīng)、引物延伸、寡核苷酸定向誘變和這些方法的組合的分子生物學(xué)技術(shù)完成以上鑒別的殘基的突變。
本發(fā)明不限于篩選IL-6的超激動劑、拮抗劑或超拮抗劑的方法。相反，它涉及可由所述篩選方法獲得的分子，即涉及除了具有下列三種取代Gln175Ile/Ser176 Arg/Gln183Ala的稱作IL-6IRA的分子外的hIL-6超激動劑；除了具有下述取代的三種分子外的hIL-6的拮抗齊Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Va1121Asp(DFRD)Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Phe/Va1121Asp(DFFD)Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Leu/Va1121Asp(DFLD)；和除了具有下列7種取代Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Va1121Asp/Gln175Ile/Ser176Arg/Gln183Ala的稱作Sant1的分子外的hIL-6的超拮抗劑。
至此已完成了該發(fā)明主題的一般性描述。現(xiàn)在將借助下列實施例給出本發(fā)明特定實施方案的詳細描述，以期能更好地了解其目的、特征、優(yōu)點及其應(yīng)用方法。
圖1表示說明用于鑒別人白細胞介素6的位點1和位點2的方案。
圖2表示按照本發(fā)明的三種超拮抗劑即Sant3、Sant4、Sant5隨濃度增加相對于拮抗劑Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118 Arg/Val121Asp(圖中用單字母碼表示)的效價的增加。
保藏大腸桿菌K12(被質(zhì)粒pHenΔhIL-6轉(zhuǎn)化，此質(zhì)粒從限制酶SalI識別位點到限制酶NotI識別位點含有編碼野生型人IL-6氨基酸序列的核苷酸序列)已于1993年6月10日在The National Col-lection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)(Aberdeen，Scotland，UK)保藏，保藏號為NCIMB 40563。實施例1使用本發(fā)明的方法通過AB環(huán)中氨基酸殘基突變篩選IL-6的超激動劑實驗方案包括構(gòu)建在噬菌體M13pIII蛋白的后157個氨基酸之前并在運載合成蛋白到壁膜間隙的PelB的序列之后包含hIL-6全部編碼區(qū)(SEQ ID NO1)的雜合基因。
此構(gòu)建體使得可獲得在其表面上表現(xiàn)出正確折疊的噬菌體粒子和有生物學(xué)活性的人白細胞介素-6。
構(gòu)建了包括IL-6的Asp71，Phe74，Gln75和Ser76殘基突變的噬菌體文庫，這些噬菌體從WO95/00852中描述的變體IL-6IRA(有如下取代Gln175Ile/Ser176Arg/Gln183Ala)開始構(gòu)建，比野生型hIL-6對受體的親和力大5倍左右以與絲狀噬菌體M13pIII蛋白的融合產(chǎn)物形式存在。此文庫采用引物延伸技術(shù)構(gòu)建。突變寡核苷酸(其序列是SEQ ID NO2)是一個95個核苷酸的IL-6 DFQS。引物IL-6 DFQS向編碼71位氨基酸(野生型為Asp)、74位(野生型為Phe)、75位(野生型為Gln)和76位(野生型為Ser)密碼子引入。寡核苷酸IL-6 AB引物(其序列是SEQ ID NO3)用作引物延伸反應(yīng)的引物。這兩上寡核苷酸在體外退火，退火的寡核苷酸用作引物延伸反應(yīng)的底物。然后將由此獲得的雙鏈DNA片段消化并連接到質(zhì)粒pHenΔhIL-6上，以便用突變的序列代替野生型序列。將連接產(chǎn)物插入到細菌中，產(chǎn)生大約三百萬獨立的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化的細菌用M13K07輔助噬菌體轉(zhuǎn)染以構(gòu)建噬菌體文庫(噬菌粒文庫)。
在shrIL-6R和shrgp130存在下，用抗shrIl-6R的單克隆抗體包覆的磁珠溫育來篩選文庫。然后將在pH3.6下洗脫的噬菌粒群在細菌中擴增。經(jīng)篩選——擴增四個循環(huán)后，對隨機篩選列的噬菌粒突變區(qū)測序。在適宜的細菌株壁膜間隙產(chǎn)生相應(yīng)的突變IL-6蛋白，測定其結(jié)合IL-6特異受體的能力。表1表明用按照本發(fā)明的方法篩選到IL-6的變體是可能的，所述變體是在螺旋D和A-B區(qū)均有突變的分子，具有額外增加的對特異受體的親和力。
表1包括A-B區(qū)71、74、75、76位殘基上額外突變的白細胞介素6-IRA變體的受體結(jié)合特性位 點 71 74 75 76 受體結(jié)合(％)野生型 AspPheGlnSer100％IL-6IRA AspPheGlnSer450％噬菌粒D3-3AspTyrPheIle2350％噬菌粒D4-1AspTyrTyrVal2750％噬菌粒D3-7AspPheTyrIle2770％噬菌粒D4-19 AspPheTyrSer1800％
噬菌粒D4-20AspPheTyrLys4200％噬菌粒D3-16AspPheTyrLeu1450％噬菌粒D4-17AspPhePheIle2430％實施例2使用本發(fā)明的方法獲得IL-6的超拮抗劑如WO95/00852中所述，四突變Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Val121Asp(DFRD)賦予拮抗性質(zhì)。運用分子生物學(xué)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)使上述四突變與能夠增強特異受體結(jié)合能力的突變(例1中所述)相結(jié)合。更具體地說噬菌體D3-7(例1所述)的螺旋D和AB區(qū)的超結(jié)合突變產(chǎn)生突變蛋白Sant3；噬菌體D3-3(例1所述)的螺旋D和AB區(qū)的超結(jié)合突變產(chǎn)生突變蛋白Sant4；噬菌體D4-20(例1所述)的螺旋D和AB區(qū)的超結(jié)合突變產(chǎn)生突變蛋白Sant5。
突變蛋白有9個(Sant3和Sant5)或10個(Sant4)氨基酸取代，測定其結(jié)合特異IL-6受體的能力和在人肝癌細胞及骨髓瘤細胞上拮抗IL-6生物學(xué)活性的能力。表2和圖2表示DFRD、Sant3、Sant4、Sant5結(jié)合特異受體的特性，以及抑制50％IL-6生物學(xué)活性所需的突變體的濃度(以每毫升培養(yǎng)物中突變體的納克數(shù)表示)。(用每毫升培養(yǎng)物4納克野生型IL-6刺激肝細胞，用每毫升培養(yǎng)物0.1納克IL-6刺激骨髓瘤細胞，因為后者對野生型IL-6更為敏感)。
表2作為突變拮抗劑的特異IL-6受體結(jié)合能力的函數(shù)的，對肝癌細胞和骨髓瘤細胞中野生型白細胞介素-6的生物學(xué)活性的抑制作用受 體 50％抑制IL-6 活性拮抗劑結(jié)合 肝癌細胞骨髓瘤細胞(野生型的百分數(shù)) Hep3B XG-1DFRD 97％ 164ng/ml190.0ng/mlSant32800％ 2.4ng/ml1.85ng/mlSant42000％ 2.7ng/ml3.90ng/mlSant54500％ 2.3ng/ml2.45ng/ml從表中可看出，引入例1所述的氨基酸取代立即增加了親代突變體DFRD的特異受體結(jié)合能力，并降低了抑制所測試的兩種細胞系中野生型IL-6生物學(xué)活性50％所需的量。因此產(chǎn)生了非常有效的且作用力強的IL-6的超拮抗劑。
序列表一般信息(i)申請人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIAMOLECOLARE P.ANGELETTI S.p.A.
(ii)發(fā)明的名稱用受體復(fù)合物三維模型篩選人白細胞介素-6的超激動劑、拮抗劑和超拮抗劑的方法(iii)序列數(shù)目3(iv)通訊地址(A)地址S0cieta Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra，39(C)城市羅馬(D)國家意大利(E)郵政編碼I-00186(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5”軟盤1.44兆字節(jié)(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS Rev 6.22(D)軟件Microsoft Word 6.0(viii)律師信息(A)姓名DICERBO，Mario(Dr.)(B)登記號(C)卷號RM/X88471/PC-DC(ix)電訊信息(A)電話06/6785941(B)傳真06/6794692(C)電傳612287 ROPAT(1)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度555個堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假定的否(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(A)合成細菌產(chǎn)生(ix)特征(A)名稱IL-6cDNA(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO1CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA 48Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg1 5 10 15CAG CCS CTC ACG AGC TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC 96Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile20 25 30CTC GAC GGC ATC TCA GCC TTA AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC 144Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn35 40 45ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT 192Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu50 55 60CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG 240Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu65 70 75 80GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA 288Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val85 90 95TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC 336Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala100 105 110AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA 384Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys115 120 125AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT 432Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn130 135 140GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC 480Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp145 150 155 160ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG AGA TCT TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC 528Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser165 170 175AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG TAG 555Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met180(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度95個堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假定的否(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)(vii)直接來源
(A)合成寡核苷酸合成儀(ix)特征(A)名稱DFQS(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO2GTGAGAGCTC CAAAGAGGCA CTGGCAGAAA ACAACCTGAA CCTTCCAAAG ATGGCTGAAA 60AANNSGGATG CNNSNNSNNS GGATTCAATG AGGAG95(3)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度72個堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假定的否(iv)反義是(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(A)合成寡核苷酸合成儀(ix)特性(A)名稱AB引物(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述SEQ ID NO3GGCCTCTAGA TATACCTCAA ACTCCAAAAG ACCAGTGATG ATTTTCACCA GGCAAGTCTC 60CTCATTGAAT CC 7權(quán)利要求
1.一種篩選IL-6的超激動劑、拮抗劑和超拮抗劑的方法，該方法包括以下步驟——比較牛粒細胞集落刺激因子(bG-CSF)和所述激素的氨基酸序列；和——在上述比較的基礎(chǔ)上構(gòu)建所述激素的三維模型，可通過該模型鑒別分別構(gòu)成與特異受體相互作用的位點(位點1)和與gp130相互作用的位點(位點2)的殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的篩選IL-6超激動劑的方法，該方法還包括下述步驟——建立一系列包含下述IL-6野生型殘基的突變、以與絲狀噬菌體蛋白融合產(chǎn)物形式存在的噬菌體文庫Ser22，Glu23，Asp26，Arg30，Leu33，Ser37，Arg40，Glu42，Ser52，Ser53，ALa56，Leu57，Glu59，Asn60，Leu62，Leu64，Pro65，Lys66，Met67，Ala68，Glu69，Lys70，Asp71，Phe74，Gln75，Ser76，His164，Leu165，Arg168，Ser169，Lys171，，Glu172，Phe173，Gln175，Ser176，Ser177，Leu178，Arg179，Ala180，Leu181，Arg182，Gln183，Met184；——從表達型IL-6變體的混合噬菌體群中篩選出比野生型白細胞介素與特異受體有更大親和力的噬菌體；和——通過對從所選噬菌粒子抽提的DNA序列測序來鑒別結(jié)合受體的最佳氨基酸序列，其中不包括具有三取代Gln175 Ile/Ser 176 Arg/Gln 183 Ala的hIL-6分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的篩選白細胞介素6超激動劑的方法，該方法包括構(gòu)建一系列包括白細胞介素6的所說野生型殘基突變、以與M13pIII蛋白的融合產(chǎn)物形式存在的噬菌體文庫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的篩選IL-6拮抗劑的方法，該方法還包括以下步驟——用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，突變權(quán)利要求1中鑒別為形成與gp130作用的位點的殘基(Arg30，Tyr31，Gly35，Ser37，Ala38，Ser118，Lys120，Val121，Gln124，Phe125，Gln127，Lys128和Lys129)；——評價以上產(chǎn)生的突變體的生物學(xué)活性和與特異IL-6受體的親和力，以鑒別與特異受體有正常親和力而生物學(xué)活性降低或喪失的IL-6變體，和——評價作為野生型IL-6拮抗劑的上述變體的生物學(xué)活性，其中不包括具有下述取代的三種hIL-6分子Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Val121AspTyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Phe/Val121AspTyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Leu/Val121Asp
5.根據(jù)權(quán)利要求2到4的篩選IL-6超拮抗劑的方法，將上述對拮抗活性起決定作用的氨基酸序列突變和對增強與IL-6特異受體親和力起決定作用的氨基酸序列突變相結(jié)合，其中不包括具有以下7取代的hIL-6分子Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Vall21Asp/Gln175Ile/Ser176Arg/Gln183Ala。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的篩選IL-6拮抗劑和超拮抗劑的方法，其中用選自聚合酶鏈反應(yīng)、引物延伸、寡核苷酸定向誘變和這些方法的組合的分子生物學(xué)技術(shù)完成以上鑒別的殘基的突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的IL-6的突變體，所述突變體表現(xiàn)出對特異受體增加的親和力，并含有以下突變谷氨酰胺175異亮氨酸、絲氨酸176精氨酸、谷氨酸183丙氨酸以及在苯丙氨酸74、谷氨酰胺75和絲氨酸76殘基上的多取代。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的IL-6突變體，所述突變體表現(xiàn)出對特異受體增加的親和力并包括選自以下的突變——谷氨酰胺75酪氨酸，絲氨酸76異亮氨酸，谷氨酰胺175異亮氨酸，絲氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸；——苯丙氨酸74酪氨酸，谷氨酰胺75苯丙氨酸、絲氨酸76異亮氨酸，谷氨酰胺175異亮氨酸，絲氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸；和——谷氨酰胺75酪氨酸，絲氨酸76賴氨酸，谷氨酰胺175異亮氨酸，絲氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸，所說突變體表現(xiàn)出對特異受體親和力分別增加27.7倍，23.5倍和42倍。
9.可從權(quán)利要求4到6的方法獲得的具有殘基31，35，74，75，76，118，121，175，176，183同時取代的人IL-6突變體，其拮抗特性與對受體的較大的親和力結(jié)合，在低劑量下具有超拮抗劑作用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的人IL-6突變體，其具有選自以下的突變——酪氨酸31天冬氨酸，甘氨酸35苯丙氨酸，絲氨酸118精氨酸，纈氨酸121天冬氨酸，谷氨酰胺75酪氨酸，絲氨酸76異亮氨酸，谷氨酰胺175異亮氨酸，絲氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸；——酪氨酸31天冬氨酸，甘氨酸35苯丙氨酸，絲氨酸118精氨酸，纈氨酸121天冬氨酸，苯丙氨酸74酪氨酸，谷氨酰胺75苯丙氨酸，絲氨酸76異亮氨酸，谷氨酰胺175異亮氨酸，絲氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸；以及——酪氨酸31天冬氨酸，甘氨酸35苯丙氨酸，絲氨酸118精氨酸，纈氨酸121天冬氨酸，谷氨酰胺75酪氨酸，絲氨酸76賴氨酸，谷氨酰胺175異亮氨酸，絲氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸，所述突變體能抑制野生型IL-6對包括其生長為IL-6依賴性的骨髓瘤細胞在內(nèi)的敏感性人細胞的生物學(xué)活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求7或8的超拮抗劑在用于制備治療人血小板減少癥的藥物上及在骨髓移植和基因治療的人造血祖細胞離體擴增中的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的IL-6突變體在制備用于治療以IL-6過量產(chǎn)生為特征的疾病——特別是多發(fā)性骨髓瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和全身性紅斑狼瘡——的藥物中的用途。
全文摘要
已知類似白細胞介素6(IL-6)的細胞因子組的配體(即制癌蛋白M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和白細胞介素11(IL 11)可誘導(dǎo)含膜分子gp130的受體復(fù)合物的形成。本發(fā)明涉及篩選IL-6的超激動劑、拮抗劑和超拮抗劑的方法。該方法包括以下步驟——比較牛粒細胞集落刺激因子(bG-CSF)和所述激素的氨基酸序列——在上述比較的基礎(chǔ)上，構(gòu)建IL-6三維模型，可通過該模型鑒別分別構(gòu)成與特異受體相互作用的位點(位點1)和與gp130相互作用的位點(位點2)的殘基。本發(fā)明可用于鑒別人IL-6中這些位點并分離對受體有更大親和力(超激動劑或超拮抗劑)或與gp130親和力減少或喪失(拮抗劑或超拮抗劑)的所述野生型激素的變體。附圖表示了用于鑒別人IL-6位點1和位點2的方案。本發(fā)明也描述了白細胞介素-6的具體超激動劑或超拮抗劑的獲得方法和超拮抗劑作為野生型白細胞介素依賴性人骨髓瘤細胞生長的低劑量抑制劑的用途。
文檔編號A61K48/00GK1140456SQ95191575
公開日1997年1月15日 申請日期1995年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月14日
發(fā)明者G·希利博托, R·薩維諾, A·拉姆, C·托尼亞逖 申請人:布·安格萊荻公司分子生物學(xué)研究所