160] 式I和式II化合物的化學(xué)制備在以下實(shí)施例中和通過以下非限制性例舉性合成 路線來描述。
[0161]
[0162] 在以上反應(yīng)路線中，R和f可以非限制性地是例如獨(dú)立地選自由H，Me或烷基組 成的組。
[0163] 落入權(quán)利要求范圍內(nèi)的化合物可以通過下列例舉性反應(yīng)制備。
[0164]
[0165] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠改動本文描述的合成方法，聯(lián)合或不聯(lián)合本文所述的分離 技術(shù)來制備式I和式II的化合物。
[0166] 在一些實(shí)施方案中，以上式I或式II的化合物可以用于系統(tǒng)治療至少一種選自以 下組成的組的適應(yīng)證：前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，脫發(fā)，痤瘡，多毛癥，卵巢囊 月中，多囊卵巢病，性早熟，和年齡相關(guān)的黃斑變性。在一些實(shí)施方案中，式I或式II的化合 物可以用于制備用于系統(tǒng)治療本文所述適應(yīng)證的藥物或組合物。在一些實(shí)施方案中，還提 供了系統(tǒng)治療任一本文所述適應(yīng)證的方法。
[0167] 本文所述的化合物可以是游離形式或其鹽的形式。在一些實(shí)施方案中，本文所述 的化合物可以是藥用鹽形式，其在本領(lǐng)域中是已知的（Berge等，J. Pharm. Sci.(藥物科學(xué) 雜志）1977, 66, 1)。本文所用的藥用鹽包括例如具有母體化合物所需藥理學(xué)活性的鹽（保 留母體化合物的生物效力和/或性質(zhì)并且在生物學(xué)上和/或其它方面不是不合需要的鹽）。 具有一個或多個能夠成鹽的官能團(tuán)的本文所述的化合物可以例如形成藥用鹽。含有一個或 多個堿性官能團(tuán)的化合物可能能夠與例如藥用有機(jī)或無機(jī)酸形成藥用鹽。藥用鹽可以非限 制性地衍生于例如乙酸，己二酸，海藻酸，天門冬氨酸，抗壞血酸，苯甲酸，苯磺酸，丁酸，肉 桂酸，檸檬酸，樟腦酸，樟腦磺酸，環(huán)戊烷丙酸，二乙基乙酸，二葡糖酸，十二烷磺酸，乙磺酸， 甲酸，富馬酸，葡庚糖酸，葡糖酸，甘油磷酸，乙醇酸，半磺酸，庚酸，己酸，氫氯酸，氫溴酸，氫 碘酸，2-羥基乙磺酸，異煙酸，乳酸，蘋果酸，馬來酸，丙二酸，扁桃酸，甲磺酸，2-萘磺酸，萘 二磺酸，對甲苯磺酸，煙酸，硝酸，草酸，雙羥萘酸，膠質(zhì)酸，3-苯基丙酸，磷酸，苦味酸，庚二 酸，特戊酸，丙酸，丙酮酸，水楊酸，琥珀酸，硫酸，氨基磺酸，酒石酸，硫氰酸或十一烷酸。含 有一個或多個酸性官能團(tuán)的化合物可能能夠與例如藥用堿形成藥用鹽，所述藥用堿例如非 限制性地是基于堿金屬或堿土金屬的無機(jī)堿，或諸如伯胺化合物、仲胺化合物、叔胺化合 物、季胺化合物、取代胺、天然存在的取代胺、環(huán)狀胺或堿性離子交換樹脂的有機(jī)堿。藥用鹽 可以非限制性地衍生于例如以下的氫氧化物、碳酸鹽、或碳酸氫鹽：藥用金屬陽離子如銨、 鈉、鉀、鋰、媽、鎂、鐵、鋅、銅、猛或錯、氨、節(jié)星、葡甲胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、 三乙胺、異丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺乙醇、2-二乙基胺乙醇、二 環(huán)己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、海巴明、膽堿、甜菜堿、乙二胺、氨基葡萄糖、葡 糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、普魯卡因、N-乙基哌啶、可可堿、四甲基銨化合 物、四乙基銨化合物、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、嗎啉、N-甲基嗎啉、N-乙基嗎啉、二環(huán) 己基胺、二芐基胺、N, N-二芐基苯乙胺、1-二苯輕甲胺（ephenamine)、N, Ν' -二芐基乙二胺 或聚胺樹脂。在一些實(shí)施方案中，本文所述的化合物可以含有酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)兩者，并 且可以是內(nèi)鹽或兩性離子形式，例如且非限制性地，甜菜堿。本文所述的鹽可以通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備，例如且非限制性地，通過將游離形式與有機(jī)酸或無機(jī)酸或 堿反應(yīng)，或通過從其它鹽進(jìn)行陰離子交換或陽離子交換。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，鹽的制備 可以在分離和純化化合物過程中原位進(jìn)行，或者鹽的制備可以通過單獨(dú)使分離和純化的化 合物反應(yīng)來進(jìn)行。
[0168] 在一些實(shí)施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式（例如，游離形式，鹽， 多晶型物，異構(gòu)形式）可以是溶劑加合物形式，例如溶劑合物形式。溶劑合物含有化學(xué)計(jì)算 或非化學(xué)計(jì)算量的溶劑，該溶劑與化合物或其鹽物理締合。該溶劑可以非限制性地例如是 藥用溶劑。例如，當(dāng)溶劑是水時形成水合物，或當(dāng)溶劑是醇時形成醇化物。
[0169] 在一些實(shí)施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式（例如，游離形式，鹽， 溶劑合物，異構(gòu)形式）可以包括結(jié)晶和無定形形式，例如多晶型物，假多晶型物，構(gòu)象假多 晶型物，無定形形式，或它們的組合。多晶型物包括相同元素組成的化合物的不同晶體堆積 排列。多晶型物通常具有不同的X-射線衍射圖案、紅外光譜圖、熔點(diǎn)、密度、硬度、晶形、光 學(xué)和電學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性和/或溶解性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，包括再結(jié)晶溶劑、結(jié)晶速率 和貯存溫度的各種因素可以導(dǎo)致單一晶型占優(yōu)勢。
[0170] 在一些實(shí)施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式（例如，游離形式，鹽， 溶劑合物，多晶型物）包括異構(gòu)體如幾何異構(gòu)體、基于不對稱碳的光學(xué)異構(gòu)體、立體異構(gòu) 體、互變異構(gòu)體、單個的對映體、單個的非對映體、外消旋物、非對映體混合物、和它們的組 合，并且不限于為了便利目的而圖示的結(jié)構(gòu)式的描述。
[0171] 在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以包括該化合物的鹽，優(yōu)選在藥 學(xué)上或在生理學(xué)上可接受的鹽。藥物制劑將典型地包含一種或多種載體，賦形劑或稀釋劑， 其適于制劑的給藥模式，例如通過注射、吸入、局部給藥、灌洗或適于所選擇治療的其它模 式。適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑或稀釋劑是本領(lǐng)域已知的以這些給藥模式使用的那些。
[0172] 適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物可以通過本領(lǐng)域已知的方法配制，并且它們的給藥模式和劑量 由熟練的專業(yè)人員確定。關(guān)于腸胃外給藥，可以將化合物溶解在無機(jī)水或鹽水或藥用載體 中，所述藥用載體用于非水溶性化合物的給藥，諸如用于維生素K的那些。對于經(jīng)腸給藥， 化合物可以是以片劑、膠囊或溶解在液體形式中施用。片劑或膠囊可以是腸溶的，或者是 緩釋劑型。許多適當(dāng)?shù)膭┬褪且阎?，包括包封待釋放的化合物的聚合物或蛋白微顆粒、 軟膏劑、糊劑、明膠、水凝膠、或可以局部使用以施用化合物的溶液。緩釋貼片或植入物可 以用于提供長時期內(nèi)的釋放。許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)描述在Alfonso Gennaro 的 Remington: the Science&Practice of Pharmacy (雷明頓：藥物科學(xué) & 實(shí)踐），第 20 版， Lippencott Williams&Wilkins, (2000)。用于腸胃外給藥的制劑可以例如含有賦形劑，聚 烷撐二醇如聚乙二醇，植物來源的油，或氫化萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、 丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的釋放。其它潛 在有效的用于調(diào)節(jié)化合物的腸胃外遞送系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒，滲透栗， 可植入輸注系統(tǒng)，和脂質(zhì)體。用于吸入的制劑可以含有賦形劑，例如乳糖，或者可以是含有 例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘膽酸鹽和去氧膽酸鹽的水溶液，或者可以是用于以滴鼻劑或 作為凝膠形式給藥的油性溶液。
[0173] 按照本發(fā)明或用于本發(fā)明的化合物或藥物組合物可以通過醫(yī)療裝置或器具（諸 如植入物、移植物、假體、支架等）施用。此外，植入物可以設(shè)計(jì)成意欲含有和釋放該化合物 或組合物。一個實(shí)例是由聚合物材料制成的適于在一段時期內(nèi)釋放化合物的植入物。
[0174] 按照本發(fā)明的藥物組合物的"有效量"包括治療有效量或預(yù)防有效量。"治療有效 量"是指在所需劑量下和時期內(nèi)有效獲得所需治療結(jié)果（如減小的腫瘤尺寸，增加的壽命或 增加的預(yù)期壽命）的量。化合物的治療有效量可以根據(jù)諸如以下因素改變：受試者的疾病 狀態(tài)，年齡，性別，和重量，和化合物在受試者中引發(fā)所需反應(yīng)的能力。劑量給藥方案可以進(jìn) 行調(diào)整以提供最佳的治療反應(yīng)。治療有效量也是其中化合物的任何毒性或有害作用被治療 有效作用超過的量。"預(yù)防有效量"是指在所需劑量下和時期內(nèi)有效獲得所需預(yù)防結(jié)果（諸 如較小的腫瘤，增加的壽命，增加的預(yù)期壽命或防止前列腺癌向雄激素非依賴性形式進(jìn)展） 的量。典型地，在疾病之前或疾病早期在受試者中使用預(yù)防劑量，因此預(yù)防有效量可以少于 治療有效量。
[0175] 應(yīng)當(dāng)注意，劑量值可以隨將要緩解的病癥的嚴(yán)重性而變化。對于任何具體的受試 者，具體的劑量給藥方案可以隨時間根據(jù)個體需要和施用組合物或監(jiān)督組合物給藥的人的 專業(yè)判斷進(jìn)行調(diào)整。本文列出的劑量范圍僅是例舉性的，并且不限制醫(yī)學(xué)從業(yè)者可以選擇 的劑量范圍。在組合物中活性化合物的量可以按照諸如以下因素而改變：受試者的疾病狀 態(tài)，年齡，性別和重量。劑量給藥方案可以進(jìn)行調(diào)整以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可以施 用單次推注，可以隨時間施用數(shù)個分劑量，或者劑量可以根據(jù)治療情形的緊急情況要求而 成比例的減少或增加。以單位劑量形式配制腸胃外組合物可以是有利的，以便易于給藥和 劑量一致性。
[0176] 在一些實(shí)施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式可以非限制性地例如與 用于至少一種選自以下組成的組的適應(yīng)證的其它治療方法聯(lián)合使用：前列腺癌，乳腺癌，卵 巢癌，子宮內(nèi)膜癌，脫發(fā)，痤瘡，多毛癥，卵巢囊腫，多囊卵巢病，性早熟，和年齡相關(guān)的黃斑 變性。例如，本文所述的化合物和它們所有的不同形式可以與外科手術(shù)、放射（近距放射療 法或外放射）或其它療法（例如HIFU) -起作為新輔助療法（之前）、附屬療法（期間）、 和/或輔助性療法（之后）使用。
[0177] 通常，本發(fā)明的化合物應(yīng)當(dāng)在不導(dǎo)致實(shí)質(zhì)毒性情況下使用。本發(fā)明化合物的毒 性可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定，例如通過在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中測試和確定治療指數(shù)，即 LD50 (50%群體致死劑量）和LD100 (100%群體致死劑量）之間的比率。然而，在一些情況 下，諸如在重病情況下，可能需要施用顯著過量的組合物。本發(fā)明的一些化合物可以在一些 濃度下是有毒性的?？梢允褂玫味ㄑ芯縼頊y定毒性和非毒性濃度?？梢匀缦略u估毒性：使 用不表達(dá)AR的PC3細(xì)胞作為陰性對照，研究具體化合物或組合物對細(xì)胞系的特異性?？梢?使用動物研究來提供證明化合物是否對于其它組織具有任何影響。靶向AR的系統(tǒng)治療將 不大可能對其它組織導(dǎo)致重大問題，因?yàn)榭剐奂に厮幒托奂に夭幻舾芯C合征不是致命的。
[0178] 本文所述的化合物可以施用于受試者。如本文所用，"受試者"可以是人，非人靈 長類，大鼠，小鼠，牛，馬，豬，綿羊，山羊，狗，貓，等。受試者可以被猜測患有癌癥或處于癌 癥（如前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌或子宮內(nèi)膜癌）風(fēng)險下，或被懷疑患有或處于以下疾病風(fēng) 險下：痤瘡，多毛癥，脫發(fā)，良性前列腺肥大，卵巢囊腫，多囊卵巢病，性早熟，或年齡相關(guān)的 黃斑變性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知用于各種癌癥（諸如前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌或子宮 內(nèi)膜癌）的診斷方法和用于痤瘡，多毛癥，脫發(fā)，良性前列腺肥大，卵巢囊腫，多囊卵巢病， 性早熟，或年齡相關(guān)的黃斑變性的診斷方法，和癌癥（諸如前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌或子 宮內(nèi)膜癌）的臨床敘述，痤瘡，多毛癥，脫發(fā)，良性前列腺肥大，卵巢囊腫，多囊卵巢病，性早 熟，或年齡相關(guān)的黃斑變性的診斷和臨床敘述。
[0179] 所用的定義包括雄激素受體（AR)被雄激素進(jìn)行配體依賴性激活，所述雄激素如 用于研究目的的二氫睪酮（DHT)或合成的雄激素（R1881)。AR的非配體依賴性激活是指在 缺乏雄激素（配體）的情況下通過例如用毛喉素（FSK)刺激依賴于cAMP的蛋白激酶（PKA) 途徑而進(jìn)行的AR的反式激活。本發(fā)明的一些化合物和組合物可以抑制FSK和R1881誘導(dǎo) 的ARE-螢光素酶（ARE-Iuc)(參見實(shí)施例1)。這些化合物可以阻斷配體依賴性AR激活和 非配體依賴性AR激活兩者所共有的機(jī)制。這可以包括AR激活中的任何步驟，包括熱休克 蛋白的解離，關(guān)鍵的翻譯后修飾（例如乙?；姿峄?，核易位，蛋白-蛋白相互作用，轉(zhuǎn)錄 復(fù)合物形成，輔阻遏物的釋放，和/或增加的降解。
[0180] 本發(fā)明的一些化合物和組合物可以僅抑制R1881，并且可以干擾配體依賴性激活 特異的機(jī)制（例如，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD)對雄激素的可及性）。除了前列腺癌以外，許多 病癥涉及雄激素軸線（例如，痤瘡，多毛癥，脫發(fā)，良性前列腺肥大）和干擾該機(jī)制的化合物 可以用于治療這些病癥。
[0181] 本發(fā)明的一些化合物和組合物可以僅抑制FSK誘導(dǎo)，并且可以是AR的非配體依賴 性激活的特異性抑制劑。這些化合物和組合物可以干擾事件級聯(lián)或任何可以對AR起作用 的下游作用（例如FSK增加MPK活性，MPK活性對于AR活性具有強(qiáng)力作用），所述事件通 常伴隨FSK和/或PKA活性發(fā)生。實(shí)例可以包括cAMP和/或PKA或其它激酶的抑制劑。
[0182] 本發(fā)明的一些化合物和組合物可以誘導(dǎo)基礎(chǔ)水平的AR活性（無雄激素或刺激PKA 途徑）。
[0183] 本發(fā)明的一些化合物和組合物可以增加R1881或FSK的誘導(dǎo)。這些化合物和組合 物可以刺激AR的轉(zhuǎn)錄或反式激活。
[0184] 本發(fā)明的一些化合物和組合物可以抑制雄激素受體N-末端結(jié)構(gòu)域（AR-NTD)的活 性。白介素-6 (IL-6)還導(dǎo)致在LNCaP細(xì)胞中AR的非配體依賴性激活，并且可以和FSK - 起使用。
[0185] 本發(fā)明的化合物和組合物可以與AR-NTD或反式激活A(yù)R-NTD所需的另一種蛋白質(zhì) 相互作用。
[0186] 在本文中描述了本發(fā)明的各種備選實(shí)施方案和實(shí)施例。這些實(shí)施方案和實(shí)施例是 舉例說明性的，并且不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0187] 一般方法學(xué)
[0188] 細(xì)胞系，雄激素和受體
[0189] 最初將LNCaP細(xì)胞用于所有實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼈兪峭耆只娜饲傲邢侔┘?xì)胞，其中 已經(jīng)表征了 FSK對AR的非配體依賴性激活（Nazareth等1996J. Biol. Chem.(生物化學(xué) 雜志）271，19900-19907 ;和 Sadar 1999J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志）274, 7777-7783)。 LNCaP細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性AR并且分泌前列腺特異性抗原（PSA) (Horoszewicz等1983Cancer Res.(癌癥研究）43,1809-1818)。LNCaP細(xì)胞可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中作為單層培養(yǎng)或者在充 分表征的異種移植物模型中作為腫瘤培養(yǎng)，其在去勢宿主中進(jìn)展為雄激素非依賴性（Sato 等1996J. Steroid Biochem. Mol. Biol.(類固醇生物化學(xué)分子生物學(xué)雜志）58, 139-146 ; Gleave 等 1991Cancer Res.(癌癥研究）51,3753-3761 ;Sato 等 1997Cancer Res.(癌癥研 究）57, 1584-1589 ;和 Sadar 等 2002Μ〇1· Cancer Ther.(分子癌癥治療）1(8)，629-637) 〇 PC3人前列腺癌細(xì)胞不表達(dá)功能性AR (Kaighn等1978Natl. Cancer Inst. Monogr.(癌癥研 究所專論）49, 17-21)并且用于測試化合物對AR的特異性。特異性靶向AR-NTD的小分子應(yīng) 當(dāng)對于PC3細(xì)胞不具備作用。這意味著它們應(yīng)該不改變PC3細(xì)胞的增殖，如果它們特異性 阻斷AR以介導(dǎo)它們的抑制作用的話。使用R1881，因?yàn)樗欠€(wěn)定的并且避免了與不穩(wěn)定的 生理配體二氫睪酮（DHT)相關(guān)的問題?？梢允褂脦追N備選的報(bào)道基因構(gòu)建體來測定報(bào)道分 子的特異性。一些充分表征的已經(jīng)廣泛使用的ARE-驅(qū)動的報(bào)道基因構(gòu)建體有PSA(6. Ikb) 增強(qiáng)/啟動子，其含有幾個ARE并且可由雄激素以及FSK高度誘導(dǎo)（Ueda等2002A J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志）277, 7076-7085)，和ARR3-胸苷激酶（tk)-螢光素酶，其為人工報(bào)道 分子構(gòu)建體，在螢光素酶報(bào)道分子上游含有大鼠probasin AREl和ARE2區(qū)域的三個串聯(lián) 重復(fù)序列（Snoek等1996J. Steroid Biochem. Mol. Biol.(類固醇生物化學(xué)分子生物學(xué)雜 志）59, 243-250)。使用CMV-Iuc (無ARE并且是組成型活性的）來確定化合物對于轉(zhuǎn)錄沒 有一般抑制作用。
[0190] 動物模型
[0191] 一些實(shí)驗(yàn)涉及SCID小鼠的使用。選擇SCID小鼠，因?yàn)槿思?xì)胞系和可移植腫瘤在 免疫缺失動物和SCID小鼠中顯示最佳的接受率（take rate)。所有程序已經(jīng)被不列顛哥 倫比亞大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)并且每年評審。在不能提供適當(dāng)動物護(hù)理的緊急情況下， 將動物隨獸醫(yī)或動物關(guān)愛小組的意思進(jìn)行安樂死。獸醫(yī)負(fù)責(zé)檢查和咨詢。簽署的動物護(hù)理 證明明確指出，"動物護(hù)理委員會已經(jīng)檢查和批準(zhǔn)了將動物用于以上實(shí)驗(yàn)計(jì)劃或教授課程， 并且已經(jīng)被保證涉及的動物將按照加拿大動物護(hù)理委員會出版的Care of Experimental Animals-A Guide for Canada(實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理-加拿大指南）中所含的原則進(jìn)行護(hù)理"。
[0192] 皮下異種移植物
[0193] 將6至8周齡的雄性無胸腺SCID小鼠在腰窩區(qū)域通過27-號針用150 μ I LNCaP 或PC3人前列腺癌細(xì)胞（lx IO6細(xì)胞）的懸浮液皮下接種。在動物處于異氟烷的麻醉下的 同時進(jìn)行接種。腫瘤接受率約為75%。將攜帶IOOmm 3的腫瘤的小鼠隨機(jī)指定為治療組。如 下所述進(jìn)行去勢。在攜帶可觸或可見和至少40mm3的LNCaP皮下腫瘤的小鼠中測量腫瘤體 積（公式：L X W X H X 0. 5236)。每日監(jiān)視動物，并且每5天測量腫瘤。
[0194] 實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間
[0195] 腫瘤體積的評估（不超過1000 mm3)是確定皮下異種移植物實(shí)驗(yàn)終止的標(biāo)準(zhǔn)。
[0196] 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)
[0197] 對于常規(guī)組織學(xué)，在實(shí)驗(yàn)完成后收獲主要器官和異種移植物，并在10 %中性緩沖 福爾馬林中固定，然后包埋到石蠟中。切割固定切片，并用H&E染色。為了測定化合物對異 種移植物中增殖率和細(xì)胞凋亡的可能影響，進(jìn)行Kiso-67免疫染色和TUNEL測定。Kiso-67 免疫染色以0. 5 μ g/ml(l :50)的IgG濃度、對處理的組織切片使用MIB-I單克隆抗體。通 過免疫組織化學(xué)或蛋白質(zhì)印跡分析來測定AR水平。
[0198] 雄激素退出以誘導(dǎo)進(jìn)展
[0199] 通過去勢完成雄激素退出。在異氟烷麻醉下，使用5_垂直切口來輕輕拉出附睪 脂肪墊，其上附有睪丸，從身體去除睪丸。將連接睪丸和血液供給的索帶用縫合線結(jié)扎，然 后切斷。然后將索帶返回至腹腔。使用外科縫合線來閉合切割。為了減輕疼痛，在外科手 術(shù)之前注射丁丙諾啡（0. 05mg/kg)。
[0200] 異種移植物和器官回收
[0201] 將所有異種移植物和主要器官回收用于分析。在通過0)2氣體導(dǎo)致心搏停止而犧 牲后，進(jìn)行回收，并且摘除異種移植物或器官用于免疫組織化學(xué)分析。
[0202] 安樂死
[0203] 使動物通過CO2氣體導(dǎo)致心搏停止而死亡。該方法是由動物護(hù)理委員會設(shè)定的政 策并且是環(huán)境靈敏的、有效的、經(jīng)濟(jì)的和倫理學(xué)上批準(zhǔn)的。
[0204] 化學(xué)合成
[0205] 所有反應(yīng)在火焰干燥的圓底燒瓶中進(jìn)行。該燒瓶裝配有橡膠隔片，并且反應(yīng)在正 氬氣壓下進(jìn)行，除非另外指出。使用不銹鋼注射器轉(zhuǎn)移氣體-和濕氣-敏感性液體。使用 230-400 目硅膠，如 Still 等（Still, W. C.，Kahn, M.，Mitra, A.，J. Org. Chem.(有機(jī)化學(xué)雜 志）1978, 43, 2923)所述進(jìn)行快速柱色譜法。使用用0. 25mm 230-400目硅膠預(yù)包被的鋁板 進(jìn)行薄層色譜法，所述硅膠浸漬有熒光指示劑（254nm)。通過暴露于紫外光和對甲氧基苯甲 醛溶液（1 %對甲氧基苯甲醛，2% H2SO4, 20%乙酸和77%乙醇）接著用加熱槍（~250°C) 加熱（~lmin)，將薄層色譜板顯像。將有機(jī)溶液在BUchi B-114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在~25托 在25-30 °C下濃縮。
[0206] 商購試劑和溶劑如所接收的原樣使用。所有用于提取和色譜法的溶劑是HPLC級。 常態(tài)硅膠（Normal-phase Si gel) Sep paks?購自 Waters, Inc。薄層色譜板是 Kieselgel 6〇F254。所有合成試劑購自加拿大西格瑪奧德里奇（Sigma Aldrich)。
[0207] 質(zhì)子核磁共振（1H NMR)譜在25°C使用Bruker 400以反向探頭記錄，并且Bruker 400光譜儀以δ尺度上的ppm報(bào)告，并且參照在NMR溶劑中殘留的氕（⑶Cl 3: δ 7. 24(CHC13 )，DMS0-d6: δ 2. 50 (DMS0-d5))。數(shù)據(jù)報(bào)道如下：化學(xué)位移[多重性（s =單線，d =雙重線，dd =雙二重峰，ddd=三二重峰（double doublet of doublets), dm=雙多重峰（double multiplet), t =三重線，m =多重線），親合常數(shù)以赫茲表示，積分]。碳-13核磁共振 (13C NMR)譜是使用Bruker 400光譜儀記錄，以δ尺度上的ppm報(bào)道，并且參照溶劑的碳 共振（⑶Cl3: δ 77. 23, DMS0-d6: δ 39. 51)。數(shù)據(jù)報(bào)道如下：化學(xué)位移。氟核磁共振（19F NMR) 譜在25°C使用Bruker 300光譜儀記錄，并且以δ尺度上的ppm報(bào)道。數(shù)據(jù)報(bào)道如下：化 學(xué)位移[多重性（td=三個二重峰（triplet of doublets)),親合常數(shù)以赫茲表示]。
[0208] 實(shí)施例1
[0209] 使用許多篩選的應(yīng)用來鑒定抑制AR NTD活性的活性化合物。初始篩選是基于細(xì) 胞的測定，包括保持在培養(yǎng)物中的LNCaP細(xì)胞。該測定由以下組成：使用雄激素（配體依賴 性）和毛喉素（非配體依賴性）兩者激活A(yù)R，和在粗制提取物存在和不存在下測量LNCaP 細(xì)胞分泌的PSA的水平。PSA是雄激素調(diào)節(jié)的基因，含有幾個充分表征的ARE。PSA基因表 達(dá)的非雄激素依賴性增加在前列腺癌細(xì)胞中通過依賴于AR的機(jī)制發(fā)生。觀察到PNG01-185 提取物阻斷由雄激素和毛喉素兩者誘導(dǎo)的PSA分泌。
[0210] 為了確保PNG 01-185提取物對內(nèi)源性PSA蛋白的抑制作用是在轉(zhuǎn)錄水平上，還 研究了報(bào)道基因構(gòu)建體。通過測量應(yīng)答雄激素的報(bào)道分子，在LNCaP人前列腺癌細(xì)胞中 測量內(nèi)源性AR的激活，所述應(yīng)答雄激素的報(bào)道分子諸如PSA-螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體或 ARR3-螢光素酶報(bào)道分子。作為單層保持的LNCaP細(xì)胞用PSA-螢光素酶轉(zhuǎn)染，并且用于篩 選制備自海洋海綿的粗制提取物以及一些選擇的商購化合物。進(jìn)行PSA-Iuc和ARR3-1UC 兩者的測量，因?yàn)镻SA-Iuc是由雄激素高度誘導(dǎo)的和在缺乏雄激素下由FSK誘導(dǎo)的。使用 R1881 (InM)來介導(dǎo)AR的配體依賴性激活，并且使用FSK (50 μ M)濃度來介導(dǎo)AR的非配體 依賴性激活。觀察到PNG01-185阻斷由R1881和FSK兩者誘導(dǎo)的PSA-螢光素酶活性（圖 1)。對照包括使用不表達(dá)AR的細(xì)胞系和不含有ARE的其它報(bào)道分子的平行實(shí)驗(yàn)。
[0211] PNG 01-185提取物按照圖2所示方案分級，以生成PNG 01-185-17。將每個PNG 01-185-17級分再次檢測它們的ARR3-luc活性，級分3和8顯示至少50%抑制（圖3)。 這些級分接下來測試它們抑制AR NTD的能力。將LNCaP細(xì)胞用GaWDBD-AR1 558的表達(dá) 載體和互補(bǔ)的5XGal4UAS-螢光素酶報(bào)道分子共轉(zhuǎn)染，如圖4所不。該報(bào)道分子被FSK誘 導(dǎo)是GaWDBD-AR 1 558融合蛋白的反式激活的量度（Sadar 1999J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜 志）274, 7777-7783)。以上鑒定的提取物以及一些商購自商業(yè)供應(yīng)商的化合物通過這些測 定篩選。R1881沒有誘導(dǎo)這些測定（結(jié)合AR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD)，所述LBD不存在于 GaWDBD-AR 155i^合體中）并因此只是用作陰性對照。這些研究顯示PNG 01-185-17-8抑 制ARNTD的激活。
[0212] 表3中的下列各項(xiàng)是使用上述測定、顯示活性的來自海綿提取物的化合物或商購 化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0213] 表 3
[0214]
[0215]
[0216] 對于每個顯示劑量應(yīng)答的命中物（hit)測定IC50。將鑒定的提取物用于從天然化 合物庫中分離純化形式的、介導(dǎo)對AR反式激活的抑制作用的化合物（如實(shí)施例2所述），接 著進(jìn)行實(shí)施例3中描述的二次篩選。
[0217] 表4中的下列化合物在上述測定中沒有顯示活性。
[0218] 表 4
[0219]
[0220] 一些活性化合物與BADGE (雙酚A縮水甘油醚）的結(jié)構(gòu)類似性指示它們最有可能 是工業(yè)來源的。推斷收集的海綿從污染的海水中生物累積所述化合物。這是意外事件，因 為不可能這些化合物已經(jīng)在任何其它情形下在生物測定中進(jìn)行篩選過。
[0221] 實(shí)施例2
[0222] 分離來自實(shí)施例1描述的提取物的純化的活性化合物。使用SCUBA，以從 巴布亞新幾內(nèi)亞Loloata島附近的防護(hù)暗礁上巖石底下5M的深度用手收集Geodia lindgreni (Lendenfeld，1903)樣本。將冷凍的海綿（890g)隨后用MeOH徹底提取，觀察到粗 提物在以上實(shí)施例1所述測定中具有活性。通過依序應(yīng)用Sephadex LH20、反相快速柱色譜 法和反相梯度HPLC，生物測定指導(dǎo)的分級提供了純化的樣品PNG01-185-017-2, -5, -6, -7 和_8(圖2)。通過分析NMR和MS數(shù)據(jù)已經(jīng)闡明了結(jié)構(gòu)，它們顯示在以上實(shí)施例1中。
[0223] 生物測定指導(dǎo)的