一種可用于治療骨轉(zhuǎn)移癌的氧化還原敏感骨靶向膠束的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型葡聚糖（DEX)氧化還原敏感骨靶向膠束的設(shè)計制備及應(yīng)用 方案。
【背景技術(shù)】
[0002] 研究發(fā)現(xiàn)至少50%的癌癥晚期患者會出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生影響 了藥物對腫瘤的治療，增加了患者的疼痛，降低了患者的存活率。由于骨質(zhì)硬度大、血管分 布少、藥物滲透性低等特點，傳統(tǒng)給藥方式很難將藥物有效遞送至骨轉(zhuǎn)移瘤處。如何有效遞 送藥物，是解決骨轉(zhuǎn)移瘤治療難題的關(guān)鍵。骨靶向遞藥系統(tǒng)的提出，為骨轉(zhuǎn)移瘤的治療帶來 了曙光。
[0003] 雙膦酸鹽類（BPs)對骨的HA具有很高的親和力。一旦BPs進(jìn)入體內(nèi)后，BPs就會 被快速從血液循環(huán)中清除而吸附到暴露的骨礦物質(zhì)區(qū)域。阿侖膦酸鈉（ALN)屬于第三代 BPs類藥物，具有很強(qiáng)的親骨性，其結(jié)構(gòu)簡單，可化學(xué)修飾，被廣泛用作遞藥系統(tǒng)中的骨靶向 配體。研究表明，對環(huán)境響應(yīng)的遞藥系統(tǒng)對藥物的可控釋放起到關(guān)鍵作用。二硫鍵是一種 對谷胱甘肽（GSH)敏感的化學(xué)鍵，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)外GSH的含量差別巨大。其中腫瘤細(xì)胞內(nèi) GSH的濃度可達(dá)到2-10mM，而腫瘤細(xì)胞外GSH的濃度約為2-20 μ M，濃度幾乎相差1000倍。 利用二硫鍵連接的遞藥系統(tǒng)可以選擇性的將藥物釋放在GSH含量高的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而在血 液中可以穩(wěn)定存在。
[0004] 葡聚糖（DEX)具有良好的生物相容性和水溶性，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。 基于DEX制備的膠束遞藥系統(tǒng)，因其具有粒徑小、載藥力強(qiáng)等特征已被廣泛研究。最近的研 究還表明基于DEX的膠束在體內(nèi)循環(huán)也具有類似PEG "隱形"的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種可用于治療骨轉(zhuǎn)移癌的氧化還原敏感骨靶向膠束，可以 將更多DOX遞送到骨轉(zhuǎn)移瘤處，同時顯著降低DOX在正常組織的分布，從而有效提高DOX的 抗腫瘤活性，降低其毒副作用，為治療骨轉(zhuǎn)移癌遞藥系統(tǒng)的開發(fā)提供新思路。
[0006] -種可用于治療骨轉(zhuǎn)移癌的氧化還原敏感骨靶向膠束，其特征是以阿侖膦酸 鈉（ALN)為骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖（DEX (5K))為親水材料，以十四胺（M) 為疏水材料，以3, 3二硫二丙酸（DPC)為交聯(lián)劑合成MA-DEX(5K)-ALN，以阿霉素（DOX)為 模型藥物，制備出兼有主動骨靶向及對腫瘤細(xì)胞微環(huán)境有特異性響應(yīng)的納米膠束DOXO MA-DEX w-ALN。
[0007] 具體制備方法如下：
[0008] (1)二硫二丙酸-阿侖膦酸鈉（DPC-ALN)的合成方法
[0009] ①在 20mL 的 1，4 二氧六環(huán)中加入 2. 4mmol 的 DPC 501. lmg，4. 8mmol 的 EDCI 916. 8mg，攪拌30min，然后加入5. Ommol的NHS 575. 2mg以及150 μ L的TEA，繼續(xù)攪拌活化 3h ;②在20mL的蒸餾水中加入I. 2mmol的ALN 325. 6mg，充分溶解后，分三批次緩慢滴加入 上述反應(yīng)液，在反應(yīng)過程中，緩慢滴加0. 2M NaOH使反應(yīng)液的pH值穩(wěn)定維持在7. O左右，2 小時后繼續(xù)滴加0. 2M NaOH使pH調(diào)成9. 0,繼續(xù)反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑，固體用大 量二氯甲烷反復(fù)潤洗三次，甲醇潤洗三次，得產(chǎn)物；
[0010] (2)二硫二丙酸-十四胺（DPC-M)的合成方法
[0011]在 20mL 的 1，4 二氧六環(huán)中加入 2. 4mmol 的 DPC 500mg，4. 8mmol 的 EDCI 916. 8mg， 攪拌30min，然后加入5. Ommol的NHS 575. 2mg以及150 μ L的TEA，繼續(xù)攪拌活化3h，隨后 在反應(yīng)液中加入I. 3_〇1的M 217. 6mg，室溫反應(yīng)12h，TLC監(jiān)測反應(yīng)，結(jié)束反應(yīng)后，過柱分 離，其中展開劑以體積比計為：二氯甲烷：甲醇=10:1 ;
[0012] (3)葡聚糖(5K)-3, 3二硫二丙酸-十四胺（DEXw-DPC-MA)的合成方法
[0013] 稱取一定量的DPC-MA、EDCI、NHS和TEA依次溶于30mL的DMSO中，充分溶解后加 入一定量的DEX w，室溫反應(yīng)12h，結(jié)束反應(yīng)后，過濾反應(yīng)液，得淡黃色澄清液體，濾液用大 量二氯甲烷沉淀，并反復(fù)用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇潤洗沉淀三次，最后將沉淀溶于少量蒸 餾水中透析凍干，即得DEX (5K)-DPC-OA ;
[0014] (4)十四胺-3, 3二硫二丙酸-葡聚糖teK)-3, 3二硫二丙酸-阿侖膦酸鈉 (ma-dpc-dex(5K)-dpc-aln)的合成方法
[0015] 稱取一定量的DPC-ALN、EDCI、NHS和TEA依次溶于40mL的DMSO中，充分 溶解后加入一定量的DEX eK) -DPC-M，油浴60 °C反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后透析凍干即得 MA-DPC-DEX(5K)-DPC-ALN，縮寫為 MA-DEX(5K)-ALN ;
[0016] (5)MA-DEXw-ALN載阿霉素（DOX)膠束的制備
[0017] 稱取3mg DOX · HCl于4mL DMSO中，再加入3 μ L的TEA，在60°C油浴中避光磁力 攪拌Ih使其充分溶解，加 IOmg的MA-DEX(5K)-ALN于制備液中，持續(xù)攪拌2h后緩慢滴加蒸餾 水32mL，繼續(xù)攪拌12h ;將上述混合液裝入分子截留量為2000的透析袋中，透析48h，每6h 換一次水，透析后冷凍干燥得聚合物載藥膠束。
[0018] 本發(fā)明骨靶向膠束D0X_V-DEX(5K) -ALN對DOX具有較高的載藥量與包封率，可明顯 增加 DOX對羥基磷灰石（HA)的吸附量，將更多的DOX遞送至骨轉(zhuǎn)移瘤處，從而使DOX在腫 瘤組織富集，增加 DOX對骨轉(zhuǎn)移癌的治療作用，減輕腫瘤對骨的破壞作用；同時降低DOX在 正常組織的分布，提高DOX的療效，降低毒副作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1是DOX及D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束治療荷瘤裸鼠后腫瘤體積的變化圖。裸鼠 脛骨骨髓腔注射A549細(xì)胞造模，尾靜脈給藥。A :普通相機(jī)觀察荷瘤裸鼠腫瘤體積；B :測 量荷瘤裸鼠腫瘤體積變化；C :各給藥組腫瘤體積抑制率。η = 3, ?土S，*P〈0. 05, VS DOX ; #P〈0. 05,VS Control。
[0020] 圖2是DOX及D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束治療荷瘤裸鼠后裸鼠體重的變化曲線圖。 裸鼠脛骨骨髓腔注射A549細(xì)胞造模，尾靜脈給藥。η = 3,〒:tS, *P〈0. 05, VS D0X。
[0021 ] 圖3是DOX及D0X0MA-DEX (5K) -ALN膠束治療荷瘤裸鼠后荷瘤裸鼠右后肢 Micro-CT重建（A)及矢狀位圖像（B);荷瘤裸鼠右后肢Micro-CT數(shù)據(jù)分析（C和D)。BV/ TV 為骨體積 / 組織體積。η = 3, J士S，*Ρ〈0· 05, VS D0X。
[0022] 具體實施方法
[0023] D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究
[0024] 1目的：通過體內(nèi)外實驗，評價D0X_V-DEX(5K)-ALN膠束的抗腫瘤活性。
[0025] 2研究方法：
[0026] 2. 1包封率及載藥量測定
[0027] 應(yīng)用熒光分光光度法測定DOX濃度，激發(fā)波長為470nm，發(fā)射波長為597nm，用DMSO 作為溶媒配制100 μ g/mL DOX標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后分別稀釋為0. 1、1.0、2.0、5.0、10. 0、15. 0、 25. 0 μ g/mL，熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對濃度進(jìn)行線性擬合，得到檢測 DOX 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 y = 20. 118x-15. 352, R2= 0. 9976。其中 DOX 在 0. 1-25 μ g/mL 范圍內(nèi)，熒光光度值與濃度具有良好的線性關(guān)系。
[0028] 稱取Img的載藥膠束D0X_V-DEXeK)-ALN溶解于3mLDMS0中，測定DOX熒光強(qiáng)度， 每個樣品測定三次。載藥量以及包封率由以下公式計算：
[0029] 載藥量=(膠束中藥物量/膠束的量）X 100%
[0030] 包封率=(膠束中包封的藥物量/制備膠束投入的藥物總量）X 100%
[0031] 2. 2評價D0X_V-DEX(5K)-ALN膠束與HA的吸附動力學(xué)
[0032] 精密稱取Img的DOX和D0X_V-DEX(5K)-ALN膠束溶解于IOmL的PBS中，測定溶液 的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)。然后分別加入IOOmg的HA攪拌，在5、15、30和60min時，樣品于 5000rmp離心10min，吸取上清液分別測定吸光度值。
[0033] 吸附率=[(測前-測后）/測前]X100%
[0034] 2. 3評價DOX@MA-DEXw-ALN膠束的體外細(xì)胞毒性
[0035] 利用MTT法測定DOX以及DOX_V-DEXw-ALN膠束對A549細(xì)胞、PC-3細(xì)胞、 MDA-MB-231細(xì)胞及MDA-MB-231/ADR細(xì)胞的毒性作用。取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用0. 25% 的胰蛋白酶消化，接種于96孔板（細(xì)胞濃度IXioVmL,接種體積200 yL)。置于孵箱 (37°C )中培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液。分別將DOX和D0X@MA-DEX(5K)-ALN膠束溶于無血清的培 養(yǎng)液中，以不加藥物為陰性對照組。膠束折合DOX的濃度分別為0. 08、0. 8、8. O和40.0 μ g/ mL，每孔加入200 μ L藥物溶液，孵育24h。每孔加入20 μ L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培 養(yǎng)液，每孔加入200 μ L的DMSO。將培養(yǎng)板置于搖床振搖lOmin，酶標(biāo)儀490nm處測定吸光 度值。細(xì)胞生存率％ =(給藥后的吸光度值/陰性對照的吸光度值）X 100