紫檀芪在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種紫檀芪的應(yīng)用，具體涉及紫檀芪在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo) 肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是多藥耐藥腫瘤，多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期且藥物療效差，尋找低毒、有效、 安全的抗腫瘤藥物是治療肝癌的關(guān)鍵（盧創(chuàng)新，周云，薛飛，王文玉，李曉燕，郭志松.槲皮 素抑制肝癌IfepG2細(xì)胞的增殖及促凋亡機(jī)制的研究.中華實(shí)用診斷與治療雜志.）。近些年 來(lái)，因?yàn)橐恍┨烊坏目鼓[瘤藥物效果顯著且?guī)缀鯚o(wú)不良反應(yīng)。因此人們?cè)絹?lái)越重視這些物 質(zhì)在抗腫瘤方面的研究和應(yīng)用（王寧，楊陽(yáng)，段維勛，梁振興，李?lèi)偅鹫駮裕?紫檀 芪對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞系增殖及凋亡的影響.中華臨床醫(yī)師雜志.）。
[0003] 細(xì)胞凋亡是一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡方式，它是生物體最重要的生理和病理現(xiàn)象之 一，是在基因調(diào)控下，由于內(nèi)外環(huán)境改變或死亡信號(hào)觸發(fā)引起的細(xì)胞程序性死亡。目前有兩 大類(lèi)最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族：一類(lèi)叫做抑制凋亡因子，如Bcl-2 ;另一類(lèi)叫做 促進(jìn)凋亡因子，如Bax, Fas, Cycs和Caspase3。在細(xì)胞凋亡時(shí)，Bcl-2家族中的促凋亡蛋白 成員（如Bax)發(fā)生蛋白質(zhì)的加工修飾，易位到線粒體的外膜上，引起細(xì)胞色素 C(Cycs) 和caspase等其他促凋亡因子的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而平時(shí)被隔離在線粒體等細(xì)胞器內(nèi) 的該家族的抑制凋亡蛋白成員（如Bcl-2)則抑制Cycs和caspase等促凋亡因子的釋放， 具有抑制細(xì)胞凋亡的功能（付永鋒，樊廷俊.Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡.生物化學(xué)與生物 物理學(xué)報(bào).）。另外，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)是腫瘤細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞 的Fas/FasL表達(dá)可以誘導(dǎo)其凋亡（孫麟，陳喬爾.Fas/FasL凋亡系統(tǒng)與腫瘤免疫逃逸研究 進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述.）。而Caspase-3是Caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細(xì)胞 凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子。它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志（岳原亦，張揚(yáng)，張一 奇.Caspase家族與細(xì)胞凋亡.中國(guó)醫(yī)療前沿.）。陳陽(yáng)等（陳陽(yáng)，趙秋宇，宋囡，賈連群.丹 參酮II A誘導(dǎo)人肝癌H印G2細(xì)胞凋亡的機(jī)制.中國(guó)老年學(xué)雜志.）研究發(fā)現(xiàn)丹參酮II A通 過(guò)上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)等方式誘導(dǎo)肝癌H印G2細(xì)胞凋亡。謝曉東等（謝曉 東，吳熒熒，黃文斯，劉慶，王穎，朱海濤，等.澳洲茄邊堿對(duì)肝癌ifepG2細(xì)胞增殖及凋 亡的影響.江蘇醫(yī)藥.）研究發(fā)現(xiàn)澳洲前邊堿能夠通過(guò)上調(diào)Bax和Caspase3,下調(diào)Bcl-2基 因的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌IfepG2細(xì)胞凋亡。
[0004] 紫檀芪（Pterostilbene，PTE)廣泛存在于多種小漿果和紅酒中，是植物在受到 外來(lái)侵害時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素，屬于抗體性物質(zhì)。與白藜蘆醇（Resveratrol，RES) 都屬于芪類(lèi)化合物，RES苯環(huán)上3, 5羥基的氫原子被甲基替換則成為紫檀芪。值得一提 的是，紫檀芪的多種生物活性都優(yōu)于或至少不低于RES且具有良好的安全性（焦峰，黃海 進(jìn).紫檀芪對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制.西南國(guó)防醫(yī)藥.）。研究發(fā)現(xiàn)， PTE 對(duì)乳腺癌（Nikhil K，Sharan S，Chakraborty A，Bodipati N，Peddinti R, Roy P. Role of isothiocyanate conjugate of pterostilbene on the inhibition of MCF_7cell proliferation and tumor growth in Ehrlich ascitic cell induced tumor bearing mice.Exp Cell Res 2014;320(2):311-328·)、肺癌（Yang Y，Yan X，Duan W，Yan J，Yi WjLiang Zjetal. Pterostilbene exerts antitumor activity via the Notchlsignaling pathway in human lung adenocarcinoma cells.PLos One 2013 ;8 (5):e62652.)、 前 列腺癌（Lin VC，Tsai YC，Lin JN，F(xiàn)an LL，Pan MH，Ho CT，etal. Activation of AMPK by pterostilbene suppresses lipogenesis and cell cycle progression in p53positive and negative human prostate cancer cells. J Agric Food Chem 2012 ； 60(25) :6399-6407.)、食管癌等多種惡性腫瘤均有抑制作用，但其對(duì)治療肝癌的研究尚無(wú) 明確報(bào)道。本發(fā)明以體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討紫檀芪對(duì)HepG2細(xì)胞 增殖及凋亡的影響，進(jìn)而為臨床藥物治療肝癌提供新靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 目前，治療肝癌的有效方法多以化療、放療為主，但其毒副作用較大。因此，研制和 開(kāi)發(fā)新型高效低毒的抗癌藥物已經(jīng)成為治療和攻克癌癥的新希望。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0007] 紫檀芪在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用，具體涉及紫 檀苗在制備通過(guò)上調(diào)Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因，下調(diào)Bcl-2基因進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞 增殖和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述肝癌細(xì)胞為人肝癌H印G2細(xì)胞。
[0009] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述紫檀芪在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡 藥物中應(yīng)用的有效濃度為20~140 μ mol/L。
[0010] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述紫檀芪在制備抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡 藥物中應(yīng)用的有效濃度為80 μ mol/L。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案是對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)不同濃度紫 檀芪對(duì)H印G2細(xì)胞活力的影響；倒置顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紫檀芪處理后H印G2細(xì)胞的 凋亡情況；實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)紫檀芪處理后Bax、Bcl_2、Fas、Cycs (細(xì) 胞色素C)和Caspase3基因mRNA和蛋白表達(dá)情況。
[0012] 本發(fā)明探討了紫檀芪（PTE)對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制，本發(fā) 明研究結(jié)果顯示，紫檀苗能夠使Bax, Fas, Cycs和Caspase3基因的表達(dá)上調(diào)和Bcl-2基因 的表達(dá)下調(diào)。此外，通過(guò)線粒體跨膜電位的變化和上調(diào)Fas和Caspase3基因的表達(dá)，可以推 斷出紫檀芪可能通過(guò)線粒體途徑和死亡受體途徑雙重機(jī)制介導(dǎo)誘導(dǎo)肝癌IfepG2細(xì)胞凋亡。
[0013] 1.細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制
[0014] !1印62細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%的胎牛血清、10011^/1鏈霉素和1\1051]/1青霉素的完 全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱環(huán)境為37°C、5% CO2、飽和濕度。紫檀芪先用DMSO溶解，然后再用完全培 養(yǎng)基稀釋?zhuān)闷渥龊罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0015] 2.紫檀芪對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響
[0016] 用不同濃度紫檀芪（20~140 μ mol/L)分別處理H印G2細(xì)胞24, 48, 72h后，用酶 標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值（OD)，并計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率和IC50值。經(jīng)測(cè)定，細(xì) 胞增殖出現(xiàn)抑制效應(yīng)且呈劑量時(shí)間依賴(lài)性，紫檀芪作用HepG2細(xì)胞48h的最佳藥物濃度為 80 μ mol/L，IC50 值為 80. 068 μ mol/L。
[0017] 3.細(xì)胞形態(tài)觀察
[0018] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2細(xì)胞，分別加入終濃度為0, 40, 80, 120 μ mol/L的紫檀芪培 養(yǎng)48h后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變并拍照。用200 μ L吖啶橙（0. 5 μ g/ μ L)在 室溫條件下孵育3~5min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的變化并拍照。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)紫檀 芪作用后的細(xì)胞呈明顯凋亡狀態(tài)，出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。
[0019] 4.紫檀芪對(duì)肝癌!fepG2細(xì)胞凋亡的作用
[0020] 不同濃度紫檀芪（0, 40, 80, 120 μL?οΙ/L)處理H印G2細(xì)胞48h后，AnnexinV-FITC/ PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及統(tǒng)計(jì)分析。紫檀芪能夠誘導(dǎo)肝癌IfepG2細(xì)胞凋亡，且隨著藥物 濃度的不斷增大，細(xì)胞早期凋亡率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在80 μ mol/L和120 μ mol/L 時(shí)變化顯著。當(dāng)紫檀芪濃度達(dá)到80 μ mol/L時(shí)細(xì)胞早期凋亡率最大，為（15. 61 ±0.71) % (Ρ〈0· 05) 〇
[0021] 5.紫檀芪對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞線粒體膜電位（△ Ψπι)的作用
[0022] 不同濃度紫檀芪（0, 40, 80, 120 μ mol/L)處理H印G2細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 紫檀芪對(duì)IfepG2細(xì)胞線粒體膜電位（△ Ψπι)的影響及統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組的H印G2細(xì)胞線粒 體膜電位為294. 15 ±20. 35,當(dāng)藥物濃度達(dá)到80 μ mol/L和120 μ mol/L時(shí)，線粒體膜電位明 顯下降為165. 39±11. 35和103. 22±8. 72(P〈0. 01)，且變化極顯著。
[0023]