一種lak細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是設(shè)及一種LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] LAK細(xì)胞即淋己因子激活的殺傷細(xì)胞，其是將外周血淋己細(xì)胞在體外經(jīng)淋己因子 白介素-2 (比-2)激活3~5天而擴(kuò)增為具有廣譜抗瘤作用的一種殺傷細(xì)胞。 陽003]細(xì)胞治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的有一種腫瘤治療方法，它一般作為手術(shù)、放 化療的輔助手段，延長患者的壽命，清除體內(nèi)手術(shù)后殘余的癌細(xì)胞。細(xì)胞治療主要包括LAK 細(xì)胞治療、CTL細(xì)胞治療、CIK細(xì)胞治療W及NK細(xì)胞治療等。LAK細(xì)胞培養(yǎng)成本相對較低， 且細(xì)胞容易誘導(dǎo)和擴(kuò)增，已成為臨床免疫細(xì)胞治療的主要細(xì)胞。
[0004] 然而，臨床上采用LAK細(xì)胞治療腫瘤時，需LAK細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)達(dá)到1〇1°數(shù)量級左 右，而普通的LAK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法擴(kuò)增的數(shù)量有限，很難達(dá)到臨床回輸?shù)囊螅煌瑫r所誘 導(dǎo)培養(yǎng)的LAK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞亞群數(shù)量有限，殺傷祀細(xì)胞的能力較差。因此，必需尋找用 另一種能增強(qiáng)LAK細(xì)胞的增殖活性，最好同時能增強(qiáng)LAK細(xì)胞的殺傷能力的免疫細(xì)胞培養(yǎng) 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法 能夠顯著提高LAK細(xì)胞的數(shù)量。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，使得所述方法能夠 顯著增加LAK細(xì)胞中效應(yīng)細(xì)胞亞群的數(shù)量，增強(qiáng)LAK細(xì)胞的殺傷能力。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] 一種LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括：
[0009] 步驟1、從外周血分離出單個核細(xì)胞，同時制備膠原支備用；
[0010] 步驟2、將步驟1膠原支架平鋪到細(xì)胞培養(yǎng)容器中，然后用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸單 個核細(xì)胞并接種到平鋪有膠原支架的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，同時補(bǔ)加IL-2、比-15W及0KT-3細(xì) 胞因子進(jìn)行培養(yǎng)，定期補(bǔ)充疫細(xì)胞培養(yǎng)基和各細(xì)胞因子。
[0011] 本發(fā)明主要引入了細(xì)胞=維培養(yǎng)的技術(shù)思維來解決現(xiàn)有免疫細(xì)胞LAK細(xì)胞的技 術(shù)問題，=維培養(yǎng)是指將具有=維結(jié)構(gòu)的載體與各種不同的種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)， 使細(xì)胞能夠在載體的=維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成=維的細(xì)胞載體復(fù)合物。
[0012] 單層細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往 和體內(nèi)情況不相符；動物實驗雖在體內(nèi)進(jìn)行，但體內(nèi)多種因素制約W及體內(nèi)和外界環(huán)境相 互影響而不能觀察到研究者最為關(guān)屯、的中間過程。因此，現(xiàn)有技術(shù)提出了=維細(xì)胞培養(yǎng)技 術(shù)模擬體內(nèi)的微環(huán)境，填補(bǔ)了單層細(xì)胞培養(yǎng)和動物實驗的鴻溝，主要用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理論 研究。而本發(fā)明針對現(xiàn)有LAK細(xì)胞培養(yǎng)方式的缺點(diǎn)，將膠原支架引入LAK細(xì)胞的培養(yǎng)中， 利用膠原支架進(jìn)行LAK細(xì)胞的=維培養(yǎng)，同時配合適宜的細(xì)胞因子，由此促進(jìn)LAK細(xì)胞的增 殖，W及增加了其中效應(yīng)細(xì)胞亞群的數(shù)量，增加了殺傷活性。
[0013] 在本發(fā)明中，所述外周血分離出單個核細(xì)胞可參照本領(lǐng)域已有的分離方法，本發(fā) 明優(yōu)選為：
[0014] 外周血離屯、收集下層血細(xì)胞加生理鹽水稀釋，加入淋己分離液后離屯、，棄上層液 體，加水生理鹽水洗涂，再次離屯、后去上清，獲得單個核細(xì)胞。
[0015] 更進(jìn)一步優(yōu)選為：
[0016] 將外周血在400-500g離屯、力下離屯、5-lOmin，離屯、結(jié)束后將下層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 50血離屯、管中，加入兩倍體積的生理鹽水進(jìn)行稀釋。
[0017] 另取一支新的sepmate離屯、管（購自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己細(xì)胞分 離液（購自STEMCE化公司）12ml，將稀釋后的血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到sepmate離屯、管，600-800g離 屯、15-20minD
[001引離屯、后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進(jìn)行洗嫌1次，離屯、，得到PBMCd陽019] 作為優(yōu)選，制備膠原支架具體為： 陽020] 將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，消毒后，用免疫細(xì)胞培養(yǎng) 基浸泡，置于4°C冰箱待用。
[002U更優(yōu)選為，將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，利用紫外線照 射膠原支架材料，同時用75 %的酒精浸泡支架材料20-60分鐘進(jìn)行消毒，用免疫細(xì)胞培養(yǎng) 基浸泡2-4小時，置于4°C冰箱待用。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基為X-VIVO15培養(yǎng)液。
[0023] 作為優(yōu)選，步驟2所述進(jìn)行培養(yǎng)為在37°C、5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)14天。
[0024] 作為優(yōu)選，步驟2所述IL-2因子濃度為100-500U/ml，具體可W選擇100、200、 250、300、350、400、450 或 500U/ml。
[0025] 作為優(yōu)選，步驟2所述比-15因子濃度為10-100yg/ml，具體可W選擇10、20、30、 40、50、60、70、80、90 或 100yg/ml。
[0026] 作為優(yōu)選，步驟2所述0KT-3因子濃度為10-100yg/ml，具體可W選擇10、20、30、 40、50、60、70、80、90 或 100yg/ml。
[0027] 作為優(yōu)選，步驟2所述接種的接種密度為1X106-2XIO6個細(xì)胞/ml。
[0028] W本發(fā)明所述方法進(jìn)行LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，相對于現(xiàn)有的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，本發(fā) 明能夠?qū)AK細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增到400XIO6左右，較現(xiàn)有技術(shù)中的LAK細(xì)胞量60X10 6左右極 顯著提高了LAK細(xì)胞數(shù)量，而且同時可W提高LAK細(xì)胞中效應(yīng)細(xì)胞亞群的數(shù)量，增強(qiáng)LAK細(xì) 胞的殺傷能力。
[0029] 由W上技術(shù)方案可知，本發(fā)明在LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)引入了膠原支架進(jìn)行=維培 養(yǎng)，同時配合細(xì)胞因子的加入，由此解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法擴(kuò)增的數(shù)量有限、效應(yīng)細(xì)胞亞群數(shù) 量低、細(xì)胞殺傷活性不高的問題，滿足臨床上對于LAK細(xì)胞的需求。
【附圖說明】
[0030] 圖1所示為本發(fā)明方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的LAK細(xì)胞和現(xiàn)有方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的LAK細(xì)胞的增 殖曲線圖；
[0031] 圖2所示為本發(fā)明方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的LAK細(xì)胞亞群流式檢測結(jié)果，Al表示CD3+亞 群細(xì)胞的流式檢測圖，A2表示CD3+CD4+亞群的流式檢測圖，A3表示CD3+CD8+亞群的流式 檢測圖，A4表示CD3+CD56+亞群的流式檢測圖；
[0032] 圖3所示為現(xiàn)有技術(shù)方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的LAK細(xì)胞亞群流式檢測結(jié)果，Al表示CD3+亞 群細(xì)胞的流式檢測圖，A2表示CD3+CD4+亞群的流式檢測圖，A3表示CD3+CD8+亞群的流式 檢測圖，A4表示CD3+CD56+亞群的流式檢測圖。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明實施例公開了一種LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借鑒本 文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例 進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品及方 法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0034] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培 養(yǎng)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0035] 實施例1:本發(fā)明所述誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
[0036] 1、膠原支架材料的制備
[0037] 將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，利用紫外線照射膠原支架 材料，同時用75%的酒精浸泡支架材料20-60分鐘進(jìn)行消毒，用X-VIVO15培養(yǎng)液浸泡3小 時，置于4°C冰箱待用。
[0038]2、外周血來源的PBMC的制備
[0039] 將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到離屯、管中，400-500g離屯、5-lOmin，離屯、結(jié)束后將下 層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50血離屯、管中，加入兩倍體積的生理鹽水進(jìn)行稀釋。
[0040] 另取一支新的sepmate離屯、管（購自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己細(xì)胞分 離液（購自STEMCE化公司）12ml，將稀釋后的血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到sepmate離屯、管，600-800g離 屯、15-20min。
[0041] 離屯、后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進(jìn)行洗涂1次，離屯、，得到PBMC。 陽0創(chuàng) 3、PBMC在膠原支架上誘導(dǎo)成LAK細(xì)胞
[0043] 將膠原支架平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底；用X-VIVO15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1. 5XIO6/ ml的密度接種在鋪有膠原支架的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，同時補(bǔ)加300U/ml的a-2,50iig/ml的 比-15和60yg/ml的0KT-3,在37°C、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期在倒置顯微鏡下 觀察細(xì)胞的狀態(tài)，每隔1-2天對細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)液狂-VIVO15培養(yǎng)基和各細(xì)胞因子），培養(yǎng)14 天后，收集LAK細(xì)胞。 W44] 現(xiàn)有技術(shù)：同實施例1，區(qū)別在于未平鋪膠原支架。
[0045] 實施例2:本發(fā)明所述誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
[0046] 1、膠原支架材料的制備
[0047] 將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，利用紫外線照射膠原支架 材料，同時用75%的酒精浸泡支架材料20-60分鐘進(jìn)行消毒，用X-VIVO15培養(yǎng)液浸泡2小 時，置于4°C冰箱待用。 W4引 2、外周血來源的PBMC的制備 W例將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到離屯、管中，400-500g離屯、5-lOmin，離屯、結(jié)束后將下 層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50血離屯、管中，加入兩倍體積的生理鹽水進(jìn)行稀釋。
[(K)加]另取一支新的sepmate離屯、管（購自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己細(xì)胞分離液（購自STEMCE化公司）12ml，將稀釋后的血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到sepmate離屯、管，600-800g離 屯、15-20min。
[0051] 離屯、后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進(jìn)行洗涂1次，離屯、，得到PBMC。 陽05引 3、PBMC在膠原支架上誘導(dǎo)成LAK細(xì)胞
[0053] 將膠原支架平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底；用X-VIVO15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1Xl〇6/ml /ml的密度接種在鋪有膠原支架的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，同時補(bǔ)加50