0U/ml的比-2,10yg/ml的 比-15和lOOiig/ml的0KT-3,在37°C、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期在倒置顯微鏡下 觀察細(xì)胞的狀態(tài)，每隔1-2天對細(xì)胞進(jìn)行補液狂-VIVO15培養(yǎng)基和各細(xì)胞因子），培養(yǎng)14 天后，收集LAK細(xì)胞。
[0054] 實施例3:本發(fā)明所述誘導(dǎo)培養(yǎng)方法 陽OW] 1、膠原支架材料的制備
[0056] 將膠原材料裁制成IcmXIcmXImm大小即為膠原支架，利用紫外線照射膠原支架 材料，同時用75%的酒精浸泡支架材料20-60分鐘進(jìn)行消毒，用X-VIVO15培養(yǎng)液浸泡4小 時，置于4°C冰箱待用。
[0057] 2、外周血來源的PBMC的制備 陽化引將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到離屯、管中，400-500g離屯、5-lOmin，離屯、結(jié)束后將下 層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50血離屯、管中，加入兩倍體積的生理鹽水進(jìn)行稀釋。
[0059] 另取一支新的sepmate離屯、管（購自STEMCE化公司），加入Ficoll淋己細(xì)胞分 離液（購自STEMCE化公司）12ml，將稀釋后的血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到sepmate離屯、管，600-800g離 屯、15-20min。 W60] 離屯、后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進(jìn)行洗涂1次，離屯、，得到PBMC。
[0061] 3、PBMC在膠原支架上誘導(dǎo)成LAK細(xì)胞
[0062] 將膠原支架平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底；用X-VIVO15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照2X1〇6/ ml的密度接種在鋪有膠原支架的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，同時補加lOOU/ml的比-2,100yg/ml的 比-15和10yg/ml的0KT-3,在37°C、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期在倒置顯微鏡下 觀察細(xì)胞的狀態(tài)，每隔1-2天對細(xì)胞進(jìn)行補液狂-VIVO15培養(yǎng)基和各細(xì)胞因子），培養(yǎng)14 天后，收集LAK細(xì)胞。 陽06引實施例4 :LAK細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測
[0064] 現(xiàn)有技術(shù)：同實施例1，區(qū)別在于未平鋪膠原支架。 W65] 將實施例1方法和現(xiàn)有方法誘導(dǎo)擴增的LAK細(xì)胞分別進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。由圖 1可知，第1天的細(xì)胞數(shù)相同，分別用本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，從第7天開 始，本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的LAK細(xì)胞數(shù)明顯要多于現(xiàn)有技術(shù)，尤其是培養(yǎng)14天后。此外， 將實施例2-3的CIK細(xì)胞進(jìn)行相同檢測，結(jié)果顯示從培養(yǎng)的第8天起本發(fā)明的培養(yǎng)的LAK 細(xì)胞數(shù)開始呈指數(shù)級的速度多于現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的LAK細(xì)胞數(shù)量。
[0066] 實施例5 :LAK細(xì)胞的殺傷活性檢測
[0067] 現(xiàn)有技術(shù)：同實施例1，區(qū)別在于未平鋪膠原支架。
[0068] 將實施例I方法和現(xiàn)有方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行殺傷活性檢測，本實施例中使用 的細(xì)胞裂解液為9%hitonX-100,購自PROMEGA;底物液為SunstrateMix,購自PROMEGA; 終止液為IMaceticacid。
[0069] I)鋪板時各實驗孔和對照設(shè)置如下：
[0070] 實驗孔：按效祀比40:1、20:1和10:1進(jìn)行祀細(xì)胞化562)和效應(yīng)細(xì)胞（LAK細(xì)胞） 的鋪板。其中，LAK細(xì)胞的濃度分別為4Xl〇6/mL，2Xl〇6/mL，1Xl〇6/mL，每孔100yL，每組 3個復(fù)孔；K562濃度為1X105/血，每孔100yL，每組3個復(fù)孔。
[0071] 效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔：4XioVmL, 2XioVmL,IXioVmU每孔100化，每組3個復(fù) 孔，每孔加入IOOyL培養(yǎng)基。
[0072] 祀細(xì)胞最大釋放孔：1XIOVmL的祀細(xì)胞，每孔100化，每組3個復(fù)孔，每孔加入 100yL培養(yǎng)基，于37°C、5 %二氧化碳培養(yǎng)箱解育前45min每孔加入20yL細(xì)胞裂解液。
[0073] 祀細(xì)胞自然釋放孔：1XIOVmL的祀細(xì)胞，每孔100化，每組3個復(fù)孔，每孔加入 IOOyL培養(yǎng)基。
[0074] 培養(yǎng)液空白對照：每孔200yL培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔。 陽0巧]體積糾正對照：每孔200yL培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔，于37°C、5 %二氧化碳培養(yǎng)箱 解育前45min每孔加入20yL細(xì)胞裂解液。
[0076] 2)鋪板后將培養(yǎng)板250g離屯、4min，置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱解育地。在培 養(yǎng)結(jié)束前45min，取出培養(yǎng)板，在祀細(xì)胞最大釋放組和體積糾正組每孔加入20yL細(xì)胞裂解 液，250g離屯、4min，繼續(xù)培養(yǎng)45min后取出。
[0077] 3)進(jìn)行LDH(乳酸脫氨酶）測定，具體步驟如下：250g離屯、4min，每孔吸出50yL 上清轉(zhuǎn)移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50y以室溫避光解育30min。每孔加入 50yL終止液，用振蕩器將色素顆粒打散，測定490波長處的吸光度值。
[0078] 4)試驗組、祀細(xì)胞LDH自然釋放組和效應(yīng)細(xì)胞LDH自然釋放組的吸光度均值減去 培養(yǎng)液空白對照組吸光度值均值，獲得校正值。祀細(xì)胞LDH最大釋放組的吸光度均值減去 體積糾正組吸光度值均值，獲得校正值。
[0079] 殺傷活性按如下公式計算：
[0080] 活性=(A-E-T) / 燈max-T)X100 %
[0081] A:試驗組吸光度值校正值；
[0082] E:效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔吸光度值校正值；
[008引 T:祀細(xì)胞自然釋放孔吸光度值校正值；
[0084]Tmax:祀細(xì)胞最大釋放組吸光度值校正值。
[00財結(jié)果見表1。
[0086] 表1LAK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性檢測
[0087]

[008引由上表可知，本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的LAK細(xì)胞對K562的殺傷活性均顯著高于現(xiàn)有 方法誘導(dǎo)的LAK細(xì)胞的殺傷活性。
[0089] 實施例6 :LAK細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞亞群數(shù)量檢測
[0090] 流式細(xì)胞檢測步驟：
[0091] 從培養(yǎng)后的細(xì)胞中取1XIO6個LAK細(xì)胞，250g離屯、5min去上清；用含10%FBS的 PBS溶液清洗2次；避光加入CD3、CD4、CD8和CD56抗體2. 5yL室溫解育30min;用含10% FBS的PBS溶液清洗2次；用SOOmLRPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并過濾，然后濾液上流式細(xì) 胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2和圖3。 陽09引培養(yǎng)14天后收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，結(jié)果如圖2和圖3所示，本發(fā)明所述方法中LAK細(xì)胞CD3+CD8+的比例為73. 4%，而現(xiàn)有技術(shù)中的此細(xì)胞亞群比例為43. 7% ;本發(fā)明所 述方法中LAK細(xì)胞CD3+CD4+的比例為68. 2 %，而現(xiàn)有技術(shù)中的此細(xì)胞亞群比例為34. 1 %; 本發(fā)明所述方法中LAK細(xì)胞CD3的比例為76 %，而現(xiàn)有技術(shù)中的此細(xì)胞亞群比例為46. 2 %; 本發(fā)明所述方法中LAK細(xì)胞CD3+CD56+的比例為22. 7 %，而現(xiàn)有技術(shù)中的此細(xì)胞亞群比例 為11. 6%。各種細(xì)胞亞群檢測結(jié)果均表明本發(fā)明所述方法能夠顯著提高LAK細(xì)胞中細(xì)胞亞 群數(shù)量。
[0093] 此外，將實施例2-3的CIK細(xì)胞進(jìn)行相同檢測，結(jié)果顯示本發(fā)明的培養(yǎng)的LAK細(xì)胞 在上述各細(xì)胞亞群中的比例同樣顯著高于現(xiàn)有技術(shù)。
[0094] W上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對 于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進(jìn)行 若干改進(jìn)和修飾，運些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于，包括： 步驟1、從外周血分離出單個核細(xì)胞，同時制備膠原支架備用； 步驟2、將步驟1膠原支架平鋪到細(xì)胞培養(yǎng)容器中，然后用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸單個核 細(xì)胞并接種到平鋪有膠原支架的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，同時補加IL-2、IL-15以及0KT-3細(xì)胞因 子進(jìn)行培養(yǎng)，定期補充疫細(xì)胞培養(yǎng)基和各細(xì)胞因子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，從外周血分離出單個核細(xì)胞具體為： 外周血離心收集下層血細(xì)胞加生理鹽水稀釋，加入淋巴分離液后離心，棄上層液體，加 水生理鹽水洗滌，再次離心后去上清，獲得單個核細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，制備膠原支架具體為： 將膠原材料裁制成lcmX lcmX 1mm大小即為膠原支架，消毒后，用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基浸 泡，置于4°C冰箱待用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，制備膠原支架具體為： 將膠原材料裁制成lcmX lcmX 1mm大小即為膠原支架，利用紫外線照射膠原支架材 料，同時用75%的酒精浸泡支架材料20-60分鐘進(jìn)行消毒，用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基浸泡2-4小 時，置于4°C冰箱待用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述方法，其特征在于，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)基為X-VIVO15培 養(yǎng)液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述進(jìn)行培養(yǎng)為在37°C、5%二氧化 碳的環(huán)境中培養(yǎng)14天。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述IL-2因子濃度為100-500U/ml。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述IL-15因子濃度為10-100μg/ ml〇9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述ΟΚΤ-3因子濃度為10-100 μg/ ml〇10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述接種的接種密度為 1Χ106-2Χ106個細(xì)胞/ml。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。本發(fā)明所述方法從外周血分離出單個核細(xì)胞，同時制備膠原支架并用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基平衡，備用；將膠原支架平鋪到細(xì)胞培養(yǎng)容器中，然后用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基重懸單個核細(xì)胞并接種到平鋪有膠原支架的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，同時補加IL-2、IL-15以及OKT-3因子進(jìn)行培養(yǎng)，定期補液。本發(fā)明在LAK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)引入了膠原支架進(jìn)行三維培養(yǎng)，同時配合細(xì)胞因子的加入，由此解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法擴增的數(shù)量有限、效應(yīng)細(xì)胞亞群數(shù)量低、細(xì)胞殺傷活性不高的問題，滿足臨床上對于LAK細(xì)胞的需求。
【IPC分類】C12N5/0783
【公開號】CN105296424
【申請?zhí)枴緾N201510894822
【發(fā)明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 羅二梅
【申請人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年12月7日