誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的培養(yǎng)基和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分 化的培養(yǎng)基和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 角膜上皮細胞層位于角膜外表面，由4~5層非角化鱗狀上皮細胞組成，在維持眼 表穩(wěn)態(tài)以及角膜透明度中發(fā)揮重要作用。健全的角膜上皮細胞是角膜抵御外界各種有害因 素損傷的重要條件。結(jié)構(gòu)與功能健全的角膜緣干細胞是角膜上皮細胞再生的主要來源，多 種致病因素如眼外傷、手術(shù)創(chuàng)傷、炎癥、藥物毒性均可造成角膜緣損傷，造成角膜緣干細胞 功能障礙，導(dǎo)致上皮細胞缺失，從而導(dǎo)致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危險。因此，通 過體外培養(yǎng)獲得大量用于角膜修復(fù)的上皮細胞這一難題亟待解決。
[0003] 臨床研究表明，通過體外培養(yǎng)自體角膜緣干細胞作為角膜上皮修復(fù)的種子細胞 取得了良好療效。角膜緣干細胞同其它干細胞一樣具有分化程度低、細胞周期長、高度增 殖潛能、自我更新能力和應(yīng)激增殖等特征，并且研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的角膜緣干細胞可能會 失去部分抗原性，有利于臨床移植。也有研究表明，通過建立角膜上皮細胞系（corneal epithelialcellline)能夠長期穩(wěn)定地為不同研究目的提供所需的細胞，如上皮的增殖、 分化、眼科用藥的測試、角膜疾病新的治療方法的開發(fā)等等。
[0004] 但是，自體角膜緣干細胞體外連續(xù)培養(yǎng)所要求的培養(yǎng)液成分復(fù)雜，細胞不穩(wěn)定易 分化，細胞不能持續(xù)擴增，細胞表型發(fā)生改變，所以每次移植都要在患者或其家屬的正常角 膜上取下部分角膜緣組織進行體外培養(yǎng)，操作繁瑣，且給患者帶來二次痛苦，并且有研究者 發(fā)現(xiàn)當取供眼角膜緣組織大于三分之二時，將造成健眼的眼表疾病和視力不可逆的下降， 使得大多數(shù)患者難以接受。因此，非常有必要尋找新的自體和異體移植的細胞來源。
[0005] 臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs)具有的低污染、來源充足、增殖旺盛等優(yōu)點，并且， 臍帶間充質(zhì)干細胞不受任何倫理及法理限制，因而吸引了眾多的研究者。但是，體外誘導(dǎo) hUC-MSCs向角膜上皮細胞分化十分困難。
[0006] 因此，建立體外誘導(dǎo)hUC-MSCs向角膜上皮細胞分化的有效方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮 細胞分化的培養(yǎng)基和方法，本發(fā)明提供的誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠和誘導(dǎo)方法能夠成功將hUC-MSCs 誘導(dǎo)分化為角膜上皮細胞，誘導(dǎo)分化率可達26 %。
[0008] 本發(fā)明提供的誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培 養(yǎng)液、表皮生長因子和胰島素。
[0009] 表皮生長因子（EGF)能夠促進表皮細胞的分裂，胰島素能夠促進細胞對葡萄糖、 氨基酸的代謝，提高細胞的生長狀態(tài)。本發(fā)明在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加表皮生長因子和胰島素， 從而提高hUC-MSCs向角膜上皮細胞分化的百分率。實驗表明，添加表皮生長因子和胰島素 的實驗組hUC-MSCs向角膜上皮細胞的分化率可達26%，而不添加表皮生長因子或胰島素 的對照組分化率僅為5. 47%。說明通過添加EGF和胰島素能夠顯著提高hUC-MSCs向角膜 細胞分化的效率。
[0010] 在本發(fā)明的實施例中，表皮生長因子與胰島素的質(zhì)量比為（5~25) : (5000~ 25000)〇
[0011] 在一些實施例中，表皮生長因子與胰島素的質(zhì)量比為2:3000~3:2000。
[0012] 在其中一個實施例中，表皮生長因子與胰島素的質(zhì)量比為1:1000。
[0013] 在本發(fā)明的實施例中，表皮生長因子的含量為5ng/mL~25yg/mL;胰島素的含量 為 5ng/mL~25yg/mL〇
[0014] 在一些實施例中，表皮生長因子的含量為5ng/mL;胰島素的含量為5yg/mL。
[0015] 在一些實施例中，表皮生長因子的含量為lOng/mL;胰島素的含量為10yg/mL。
[0016] 在一些實施例中，表皮生長因子的含量為lOng/mL;胰島素的含量為15yg/mL。
[0017] 在一些實施例中，表皮生長因子的含量為15ng/mL;胰島素的含量為10yg/mL。
[0018] 在一些實施例中，表皮生長因子的含量為25ng/mL;胰島素的含量為25yg/mL。
[0019] 在本發(fā)明的實施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為人干細胞無血清培養(yǎng)基和角朊細胞無血清培 養(yǎng)基，人干細胞無血清培養(yǎng)基和角朊細胞無血清培養(yǎng)基的體積比為（50~60) : (44~50)。
[0020] 在一些實施例中，人干細胞無血清培養(yǎng)基和角朊細胞無血清培養(yǎng)基的體積比為 55:45。
[0021] 本發(fā)明所用的人干細胞無血清培養(yǎng)基和角朊細胞無血清培養(yǎng)基可為自制也可為 購買獲得，本發(fā)明對此不做限定，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。其中，人干細胞無血 清培養(yǎng)基適宜培養(yǎng)干細胞，本發(fā)明采用的人干細胞無血清培養(yǎng)基為LonzaUltra⑶LTURE?。 角朊細胞無血清培養(yǎng)基適宜培養(yǎng)上皮細胞，本發(fā)明采用的角朊細胞無血清培養(yǎng)基為KSFM 培養(yǎng)液。本發(fā)明采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液皆不含有異源血清，降低了動物源血清給人體帶來的風 險。
[0022] 在本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基中還包括青霉素和鏈霉素。
[0023] 在一些實施例中，青霉素的含量為100U/mL，鏈霉素的含量為100U/mL。
[0024] 本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的方法，將臍帶間充 質(zhì)干細胞與羊膜上皮細胞共培養(yǎng)；培養(yǎng)的培養(yǎng)基為本發(fā)明提供的培養(yǎng)基。
[0025] 在本發(fā)明的實施例中，共培養(yǎng)為間接共培養(yǎng)。
[0026] 細胞共培養(yǎng)技術(shù)是將兩種或兩種以上的細胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中的技術(shù)，由于 其具有更好的反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點，因此被應(yīng)用于現(xiàn)代細胞研究中。間接共培養(yǎng)體系即將 2中或2中以上的細胞分貝接種于不同的載體上，然后將這兩種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境中， 是不同種類的細胞共用同一種培養(yǎng)體系而不直接接觸。間接共培養(yǎng)可采用transwell小 室。
[0027] 本發(fā)明通過實驗表明，將臍帶間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮細胞共培養(yǎng)，7天后臍帶間 充質(zhì)干細胞部分呈分化趨勢，細胞呈散在分布，經(jīng)檢測，hUC-MSCs分化為角膜上皮細胞的分 化率可達26%。而沒有進行共培養(yǎng)的且不添加生長因子的對比例中hUC-MSCs的分化率為 2. 7%;采用本發(fā)明提供培養(yǎng)基而不進行共培養(yǎng)的對比例中hUC-MSCs的分化率為7. 95%; 培養(yǎng)基中不添加生長因子但采用共培養(yǎng)的對比例中，hUC-MSCs的分化率為5. 47%?？梢姡?本發(fā)明提供的方法能夠?qū)UC-MSCs向角膜上皮細胞分化的百分率提高近10倍，該效果具 有顯著性差異（P〈〇.〇l)。
[0028] 本發(fā)明提供的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、表皮生長因子和胰島素。
[0029] 在本發(fā)明的實施例中，臍帶間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮細胞的個數(shù)比為（1~ 1. 5) : (4 ~6)〇
[0030] 在本發(fā)明的實施例中，臍帶間充質(zhì)干細胞為第3~5代；所述羊膜上皮細胞為第2 代。
[0031] 在本發(fā)明的實施例中，臍帶間充質(zhì)干細胞的原代分離方法為組織塊培養(yǎng)法；羊膜 上皮細胞的原代分離方法為酶消化法。
[0032] 具體的，hUC-MSCs的原代分離方法包括以下步驟：
[0033] 步驟1 :將臍帶用含有l(wèi)OOU/mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素的PBS緩沖液漂洗2次， 以體積分數(shù)為75%的乙醇水溶液浸泡Imin~2min后，去除臍帶外膜和血管；
[0034] 步驟2:以人干細胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%C02、37°C、濕度95%;第 5~7天半量換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12~14天后全量換液去掉組織塊，收集細胞傳代培養(yǎng)。
[0035] 具體的，羊膜上皮細胞的原代分離方法包括以下步驟：
[0036] 步驟1 :將羊膜用含有l(wèi)OOU/mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素的PBS緩沖液漂洗2次 后，破碎，以質(zhì)量分數(shù)為〇. 25 %胰蛋白酶消化；
[0037] 步驟2 :以膠原酶II和Dnas酶消化后，培養(yǎng)。
[0038] 膠原酶II的濃度為2. 5g/L;Dnas酶的濃度為0? 05g/L;消化的條件為37 °C， 200rpm震蕩，時間為15min~30min。
[0039] 培養(yǎng)的培養(yǎng)液為包含表皮生長因子的角朊細胞無血清培養(yǎng)基；其中表皮生長因子 的濃度為lOng/mL~15ng/mL。
[0040] 培養(yǎng)的接種密度為IXIO7個/L。
[0041] 培養(yǎng)的條件為5%C02、37°C、濕度95%培養(yǎng)2h后，去除未貼壁的細胞后繼續(xù)培養(yǎng) 24小時。
[0042] 在本發(fā)明的實施例中，共培養(yǎng)的時間為7天。
[0043] 本發(fā)明提供了誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的培養(yǎng)基和方法，本發(fā) 明在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加表皮生長因子和胰島素，從而提高hUC-MSCs向角膜上皮細胞分化 的百分率。并且，該培養(yǎng)液中不含有異源血清，降低了風險。而本發(fā)明提供的方法將臍帶間