一種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 既往胚胎干細(xì)胞分化中的細(xì)胞分選需要利用胰酶消化細(xì)胞并離心吹打等，造成細(xì) 胞嚴(yán)重?fù)p傷，不利于細(xì)胞移植應(yīng)用。因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞向肝細(xì)胞分化時(shí)，胚胎干細(xì)胞經(jīng)懸浮培 養(yǎng)形成擬胚體(embryonic body，EB)，這相當(dāng)于體內(nèi)胚胎的囊胚，然后擬胚體再貼壁生長并 向肝細(xì)胞方向分化。每個(gè)擬胚體包含大量細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞之間以及其與培養(yǎng)瓶底部緊密 連接，甚至難以分清細(xì)胞界限。如果需要將陽性細(xì)胞分選，就需要用胰酶消化細(xì)胞，使各個(gè) 細(xì)胞之間以及與培養(yǎng)瓶底部之間分離，再用抗體標(biāo)記細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀(FCM)或磁珠分 選將所需要的陽性細(xì)胞分選出來。這種分選方法經(jīng)過胰酶的消化和FCM等機(jī)器分選操作，嚴(yán) 重影響細(xì)胞活力，細(xì)胞生長狀態(tài)明顯變差，很難完成后續(xù)的細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。
[0003] 如何在不影響細(xì)胞活力的前提下，將胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞初步分選出來并在 新的培養(yǎng)系統(tǒng)中再培養(yǎng)，以提高其分化純度，用于后續(xù)的肝細(xì)胞移植是當(dāng)前的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種胚胎干細(xì)胞分化的 肝細(xì)胞的分選方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，包含如下步驟：
[0007] (1)胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC)在擬胚體（embryonic body，EB)液體 培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)開始分化，得到擬胚體；
[0008] (2)將步驟(1)得到的擬胚體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每個(gè)擬胚體以貼壁點(diǎn)為中心向四周輻 射分化生長形成細(xì)胞分化群落;胚胎干細(xì)胞分化至第15d時(shí)，刮取位于細(xì)胞分化群落區(qū)域1 和/或細(xì)胞分化群落區(qū)域2的正常生長狀態(tài)細(xì)胞，將其再次貼壁培養(yǎng)，得到胚胎干細(xì)胞分化 的肝細(xì)胞；
[0009] 步驟(1)中所述的胚胎干細(xì)胞優(yōu)選為BALB/c系小鼠胚胎干細(xì)胞；
[0010] 步驟(2)中所述的區(qū)域1為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落 中心的距離不超過細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離）的1/4;
[0011] 步驟(2)中所述的區(qū)域1優(yōu)選為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化 群落中心的距離不超過細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離)的1/5;
[0012] 步驟(2)中所述的區(qū)域2為細(xì)胞分化群落區(qū)域3之外的區(qū)域；
[0013] 所述的區(qū)域3為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離 為細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離)的3/4;
[0014] 所述的區(qū)域3優(yōu)選為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的 距離為細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離)的4/5;
[0015] 步驟（1)中所述的搖動(dòng)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的目的在于:使細(xì)胞在培養(yǎng)液中處于懸浮 狀態(tài)，避免貼壁，以利于其分化發(fā)育為圓球形的擬胚體；
[0016] 步驟(1)中所述的擬胚體液體培養(yǎng)基優(yōu)選由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成；
[0017] 所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)基;所述的添加物包含如下組分:體積分?jǐn)?shù)為 20 %的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的 青霉素和終濃度為l〇〇yg/mL的鏈霉素；
[0018] 步驟(1)中所述的搖動(dòng)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為培養(yǎng)6天；
[0019] 步驟⑵中所述的貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成；
[0020] 所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)基;所述的添加物包含如下組分:體積分?jǐn)?shù)為 20 %的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的 青霉素和終濃度為l〇〇yg/mL的鏈霉素；
[0021] 步驟(2)中所述的貼壁培養(yǎng)過程中添加肝性生長因子；
[0022]所述的肝性生長因子為EGF、TGF、HGF、0SM、地塞米松、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白中的至少 一種；
[0023] 所述的肝性生長因子加入時(shí)間和用量優(yōu)選為：
[0024] 胚胎干細(xì)胞分化第7天~19天(本發(fā)明中的分化天數(shù)是從胚胎干細(xì)胞首次分化開 始計(jì)），加入終濃度為30ng/mL的EGF和終濃度為30ng/mL的TGF;
[0025] 胚胎干細(xì)胞分化第7天~10天，加入終濃度為20ng/mL的HGF;
[0026] 胚胎干細(xì)胞分化第11~19天，終濃度為40ng/mL的HGF;
[0027] 胚胎干細(xì)胞分化第15~19天，加入終濃度為10ng/mL的0SM、終濃度為10-7Μ的地塞 米松、終濃度為5yg/mL的胰島素和終濃度為5yg/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白；
[0028]胚胎干細(xì)胞擬胚體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)過程中，加入EGF、HGF等肝性生長因子后，細(xì)胞分 化群落外周形成比較均一的細(xì)胞群，說明生長因子的定向誘導(dǎo)作用使擬胚體向單一類型細(xì) 胞分化；
[0029] 本發(fā)明的原理：
[0030] 本發(fā)明是基于對(duì)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化中的每個(gè)胚胎干細(xì)胞分化群落的空間 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，得出的一種新的細(xì)胞分選方法:胚胎干細(xì)胞首先經(jīng)5~6d懸浮發(fā)育為擬胚 體，擬胚體相當(dāng)于體內(nèi)胚胎發(fā)育中的囊胚，然后擬胚體再貼壁，形成細(xì)胞分化群落并進(jìn)一步 向肝細(xì)胞分化，每個(gè)細(xì)胞分化群落一開始大約包含500~600個(gè)細(xì)胞，隨著分化分裂，細(xì)胞數(shù) 量不斷增多并呈分散性生長為圓形細(xì)胞群落，經(jīng)過肝性標(biāo)記物(如白蛋白）免疫熒光檢測， 我們發(fā)現(xiàn)陽性標(biāo)記的肝細(xì)胞處于每個(gè)細(xì)胞分化群落的區(qū)域1和區(qū)域2;本發(fā)明在特定時(shí)期 (胚胎干細(xì)胞分化至第15d)選擇并分選區(qū)域1和區(qū)域2(圖2)的細(xì)胞重新進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，在貼 壁培養(yǎng)過程中，本發(fā)明根據(jù)細(xì)胞分化情況，選擇EGF、TGF、HGF、0SM、地塞米松、胰島素和轉(zhuǎn)鐵 蛋白等作為擬胚體向肝細(xì)胞分化過程中的肝性生長因子，在不同分化階段添加合適的肝性 生長因子，以促進(jìn)肝細(xì)胞分化，整個(gè)分選過程操作簡單、成本低、可明顯減輕細(xì)胞損傷、干細(xì) 胞分化率相較于現(xiàn)有技術(shù)得到大幅度提高，分選后的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可滿足肝細(xì)胞移 植的細(xì)胞純度和細(xì)胞功能要求。
[0031] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0032] (1)本發(fā)明是基于擬胚體細(xì)胞分化群落中肝細(xì)胞的獨(dú)特的空間分布規(guī)律，得出的 一種新的細(xì)胞分選方法。
[0033] (2)本發(fā)明利用物理性的活體細(xì)胞整塊刮取方法，將整片區(qū)域的細(xì)胞整塊刮取，可 很好的保護(hù)單個(gè)細(xì)胞的功能，相比普通的胰酶消化細(xì)胞方法，具有明顯減輕細(xì)胞損傷的優(yōu) 點(diǎn)。
[0034] (3)本發(fā)明在不影響細(xì)胞活力的情況下，經(jīng)過多次整塊刮取細(xì)胞，并重新培養(yǎng)，可 以完全達(dá)到滿足細(xì)胞移植時(shí)的純度(大于80 % )需求。
[0035] (4)本發(fā)明在不同分化階段添加合適的肝性生長因子，以促進(jìn)肝細(xì)胞分化，干細(xì)胞 分化率相較于現(xiàn)有技術(shù)得到大幅度提高。
【附圖說明】
[0036] 圖1是胚胎干細(xì)胞體外向肝細(xì)胞分化的細(xì)胞形態(tài)圖；其中，A:胚胎干細(xì)胞;B:擬胚 體;C:細(xì)胞分化群落。
[0037] 圖2是本發(fā)明細(xì)胞分選過程中區(qū)域1和區(qū)域2的示意圖。
[0038] 圖3是細(xì)胞分選前后，顯微鏡下細(xì)胞分化群落或制得的肝細(xì)胞形態(tài)圖；其中，A:細(xì) 胞分選前細(xì)胞分化群落形態(tài);B:細(xì)胞分選后制得的肝細(xì)胞形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0040]擬胚體液體培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成;基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)基； 添加物包含如下組分:體積分?jǐn)?shù)為20 %的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為 25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和終濃度為100yg/mL的鏈霉素；
[0041 ] 實(shí)施例1
[0042] (1)BALB/c系小鼠胚胎干細(xì)胞(購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)在5% C02培養(yǎng)箱中37 °c條件下在擬胚體液體培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)開始分化，約10h后即可見胚胎干細(xì) 胞形成圓球狀擬胚體并懸浮在培養(yǎng)液中，擬胚體在6d的培養(yǎng)時(shí)間里不斷增大;培養(yǎng)6天后， 得到擬胚體；
[0043] (2)第7天，將步驟（1)得到的擬胚體移至24孔板中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每個(gè)擬胚體以貼 壁點(diǎn)為中心向四周輻射分化生長形成細(xì)胞分化群落；
[0044] 貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成；所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng) 基;所述的添加物包含如下組分:體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙 醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和終濃度為100yg/mL的鏈霉素；
[0045] 貼壁培養(yǎng)過程中，肝性生長因子的加入時(shí)間和用量為：
[0046] 胚胎干細(xì)胞分化第7天~19天，加入終濃度為30ng/mL的EGF和終濃度為30ng/mL的 TGF；
[0047] 胚胎干細(xì)胞分化第7天~10天，加入終濃度為20ng/mL的HGF;
[0048] 胚胎干細(xì)胞分化第11~19天，終濃度為40ng/mL的HGF;
[0049] 胚胎干細(xì)胞分化第15~19天，加入終濃度為10ng/mL的0SM、終濃度為10-7Μ的地塞 米松、終濃度為5yg/mL胰島素和終濃度為5yg/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白；
[0050] (3)胚胎干細(xì)胞分化第15d時(shí)，對(duì)擬胚體細(xì)胞分化群落進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)(免疫熒 光)檢測（第一抗體:兔抗小鼠 AFP單抗(濃度1/100)和綿羊抗小鼠 ALB單抗(濃度1/50);第二 抗體：山羊抗兔IgG/FITC/TMRITC/DAB和鼠抗綿羊IgG/FITC/TMRITC)，具體操作步驟參照免 疫熒光試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書;結(jié)果如下所示：
[0051] 表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記物-白蛋白（ALB)和肝細(xì)胞標(biāo)記物AFP的陽性細(xì)胞的空間分布具備 一定規(guī)律，即:ALB陽性細(xì)胞分布在擬胚體細(xì)胞分化群落的區(qū)域1和區(qū)域2(區(qū)域1位于細(xì)胞分 化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離不超過細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化 群落邊緣至中心距離)的1/4;區(qū)域2為細(xì)胞分化群落區(qū)域3之外的區(qū)域;區(qū)域3為位于細(xì)胞分 化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離為細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落 邊緣至中心距離）的3/4)，二者之間的中間區(qū)域幾乎無陽性細(xì)胞分布。理論上，這符