一種誘導(dǎo)3t3-l1前脂肪細(xì)胞分化的試劑組合及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是一種促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的組合物及其在前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]前脂肪細(xì)胞是一類具有向脂肪細(xì)胞分化潛力的特異性的前體細(xì)胞，由多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞分化生成。脂肪細(xì)胞是白色脂肪組織(WAT)的主要成分，其本身不能增殖，主要通過前脂肪細(xì)胞在各種激素作用下誘導(dǎo)而成。在開始向脂肪細(xì)胞分化前，前脂肪細(xì)胞形態(tài)上類似成纖維細(xì)胞，呈長梭形。開始分化后，前脂肪細(xì)胞逐漸變圓，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)甘油三脂的含量逐漸上升，細(xì)胞骨架蛋白等的含量下降。細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)脂滴，前脂肪細(xì)胞逐漸向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
[0003]動(dòng)物的前脂肪細(xì)胞作為肥胖疾病和糖尿病疾病研究的細(xì)胞模型，常用于體外篩選治療上述兩種疾病的藥物。3T3-L1前脂肪細(xì)胞是Green和Kehinde于1974年從Swiss 3T3小鼠19天的胚胎中分離出的一種具有分化潛力的細(xì)胞株，能在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下分化為成熟的脂肪細(xì)胞。目前，該細(xì)胞株已作為體外研究脂肪代謝調(diào)控的最常用的細(xì)胞模型之一，廣泛地應(yīng)用于脂肪代謝疾病和新藥開發(fā)等領(lǐng)域的科學(xué)研究中。
[0004]經(jīng)典“激素雞尾酒法”被大量運(yùn)用于前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化中，其主要成分僅含有IBMX、地塞米松和胰島素。在胰島素、地塞米松和IBMX的刺激下，可通過增加細(xì)胞內(nèi)第二信使一cAMP的濃度，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。
[0005]三磷酸腺苷除了作為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的重要能量物質(zhì)。在細(xì)胞外還可以作為信號(hào)分子，與P 2 (腺嘌呤核苷酸)受體結(jié)合參與跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮其多種生理功能。其在癌癥治療、炎癥控制上有著廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]
本發(fā)明的目的在于提供一種試劑組合可顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞3T3 -LI分化，具體是是促進(jìn)自體前脂肪細(xì)胞分化及脂滴形成的組合物及其應(yīng)用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案:
配方成分:
A誘導(dǎo)分化液:
(I)三磷酸腺苷終濃度 0μΜ，50μΜ，ΙΟΟμΜ, 150μΜ 和 200μΜ。
[0008](2)地塞米松終濃度?μΜ。
[0009](3)胰島素終濃度850ηΜ。
[0010](4) IBMX終濃度 0.25 ηΜ。
[0011]B維持培養(yǎng)液:
(I)三磷酸腺苷終濃度 ΟμΜ，50μΜ，ΙΟΟμΜ, 150μΜ 和 200μΜ。
[0012](2)胰島素終濃度850nM。
[0013]三磷酸腺苷是各種活細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種高能磷酸化合物。在體內(nèi)組織細(xì)胞中作為一切生命活動(dòng)所需能量的直接來源，儲(chǔ)存和傳遞化學(xué)能，當(dāng)體內(nèi)吸收、分泌、肌肉收縮及進(jìn)行生化合成反應(yīng)需要能量時(shí)，三磷酸腺苷即分解成二磷酸腺苷及磷酸基，同時(shí)釋放能量。三磷酸腺苷亦能作為一種輔酶，增強(qiáng)細(xì)胞的代謝活性，參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核苷酸的合成和代謝。在細(xì)胞外與P2受體特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能。
[0014]在體外實(shí)驗(yàn)中，小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1作為常用實(shí)驗(yàn)材料，常通過經(jīng)典的“激素雞尾酒法”將其誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞。成熟的脂肪細(xì)胞與前脂肪細(xì)胞相比，形態(tài)變大變圓，通過染色可以看見明顯的脂滴。在分化過程中加入本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)在一定濃度情況下可以顯著促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的分化。在已有關(guān)于三磷酸腺苷的報(bào)道中未見其對前脂肪細(xì)胞分化顯著影響的報(bào)道。本發(fā)明可以有效促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化，對加快前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化有很好的運(yùn)用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1為人工誘導(dǎo)3T3- LI前脂肪細(xì)胞分化過程示意圖。
[0016]圖2為不同濃度三磷酸腺苷對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響(油紅O染色)。
[0017]圖3為三磷酸腺苷對3T3 -LI脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響(尼羅紅染色)。
[0018]圖4為Image-pro Plus6.0圖像處理軟件對3T3- LI脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)、脂滴總面積、脂滴平均面積、脂滴直徑、數(shù)量等指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0019]圖5為3T3 -LI脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴平均直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0020]圖6為3T3 -LI脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴平均面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本實(shí)施例用到的各種實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器:
超凈工作臺(tái)(Thermo，美國)、酶標(biāo)儀(Thermo，美國)、冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國)、高壓滅菌鍋:(Tomy，日本)、細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)、倒置顯微鏡(Olympus 1X71，日本)、移液槍(Eppendorf，德國)、電子天平(賽多利斯公司，美國)、去離子水系統(tǒng)(Mi I Ipore，美國)。
[0022]實(shí)驗(yàn)試劑:
胎牛血清(Gibco，美國)、DMEM /High Glucose 培養(yǎng)基(Hyclone，美國)、IBMX(Sigma，美國)、地塞米松(Sigma，美國)、胰島素(Sigma，美國)、三磷酸腺苷(sigma，美國)、Na0H溶液、油紅O染料0、？83 0^10加，美國)、尼羅紅染料(Lonza，美國)、10%多聚甲醛、75%酒精、超純水、濾紙、48孔板(Coring，美國)、0.25%胰酶(Hyclone，美國)、無水異丙醇、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Coring，美國)、Hepes緩沖劑(Sigma，美國)。
[0023]實(shí)施例1:所需各種試劑的配制:
(I)胰島素溶液配制:
將1mg胰島素干粉溶解于0.02M HCl溶液，得到1.7mM胰島素溶液；取0.1ml 1.7mM溶液加入0.9ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液中成170μΜ胰島素溶液。
[0024](2)地塞米松溶液配制: 取地塞米松干粉3.925mg溶解于Iml無水乙醇中，得到1mM地塞米松；取0.1ml1mM的地塞米松加入0.9ml PBS中成為ImM的地塞米松溶液。
[0025](3) IBMX 溶液配制:
將5.56mg IBMX干粉溶解于0.5ml的KOH (0.5M)溶液中，得到50mM IBMX溶液。
[0026](4)完全培養(yǎng)液配制:
取DMEM(High Glucose)培養(yǎng)液一瓶500ml，加入胎牛血清(FBS) 55ml以及1.38gHepes緩沖劑，用lmol/L NaOH溶液調(diào)pH=至7。用0.22 μ m的微孔過濾器除菌，裝入500ml培養(yǎng)液瓶。
[0027](5)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液: