AcSDKP在角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的應(yīng)用及角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及AcSDKP在角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的應(yīng) 用及角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 角膜緣為角膜和結(jié)膜、鞏膜交界部分，與角膜鑒別的標(biāo)志是Bowman氏膜的終止 處；與結(jié)膜的鑒別標(biāo)志是不含杯狀細(xì)胞，寬約1mm，此處僅有上皮層和基質(zhì)層，其上皮細(xì)胞 層超過10層，排列不規(guī)則，細(xì)胞呈小的圓柱狀，核深染，其深部基底細(xì)胞為一層小圓柱狀或 立方形細(xì)胞，細(xì)胞核為卵圓形，與表面平行.在基底部乳頭形成，形成特殊的"柵欄"樣上皮 結(jié)構(gòu)，其中含有色素和豐富的血管網(wǎng)，并與基底膜聯(lián)系緊密。
[0003] 角膜緣干細(xì)胞是角膜緣細(xì)胞的一個(gè)亞群，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性：生存期長，分化 度低，細(xì)胞周期長，DNA合成期短，具有高度的分化和增殖潛能等。干細(xì)胞分裂產(chǎn)生兩個(gè)子 細(xì)胞，一個(gè)保持母細(xì)胞表型，繼續(xù)成為干細(xì)胞，另一個(gè)演化為具有細(xì)胞功能的上皮細(xì)胞。在 自身更新的組織內(nèi)干細(xì)胞被認(rèn)為是細(xì)胞譜系的起源，同時(shí)也是細(xì)胞增殖和分化的源泉。
[0004] 目前開展的角膜緣干細(xì)胞移植，包括自體或異體角膜緣組織移植和體外培養(yǎng)的角 膜緣干細(xì)胞移植。自體角膜緣組織移植，當(dāng)取供眼角膜緣組織超過2/3周，可導(dǎo)致供眼角膜 緣干細(xì)胞缺陷，繼而引起眼表病變。而且，如果當(dāng)自體眼已處于亞臨床狀態(tài)時(shí)，取材后供眼 眼表病變則會(huì)加重，進(jìn)而引起視力下降。此外，自體角膜緣組織移植不適合雙眼角膜緣病變 的患者。異體角膜緣組織移植存在排斥反應(yīng)。因此，采用體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移植聯(lián) 合穿透性角膜移植治療嚴(yán)重的角膜病變，近年來成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。
[0005] 對于角膜緣干細(xì)胞的原代獲取，目前已有的分離方法主要有兩種：（1)酶消化法。 用胰蛋白酶對用含雙抗PBS漂洗干凈并獲取角膜緣組織進(jìn)行消化，直至細(xì)胞分離出來，過 篩，離心并接種培養(yǎng)。（2)組織塊貼壁法。分別用含雙抗的PBS漂洗干凈人角膜緣組織，目艮 科剪把角膜緣組織剪碎成2X2_3組織塊，用培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。上述兩種 方法的分離出來的細(xì)胞中會(huì)帶有少量成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞在后期培養(yǎng)的過程中會(huì)影響 角膜緣干細(xì)胞的增殖，且其分泌的產(chǎn)物會(huì)促進(jìn)低分度低的角膜緣干細(xì)胞增殖、分化成帶有 細(xì)胞功能的角膜緣上皮細(xì)胞，使得角膜緣干細(xì)胞純度降低。
[0006] 因此，應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)純度大的角膜緣干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供AcSDKP在角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng) 中的應(yīng)用及角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，本發(fā)明提供的方法所得細(xì)胞純度良好。
[0008] 本發(fā)明提供了AcSDKP在制備角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)基中的應(yīng)用。
[0009] N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸（N-acetyl-Seryl-aspartyl-1 ysyl-proline，AcSDKP)是一種具有生理調(diào)控活性的四肽因子。早期研究發(fā)現(xiàn)，AcSDKP能 夠抑制造血干細(xì)胞的增殖。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AcSDKP具有類似血、管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑 (ACEI)的作用。在大鼠模型中，AcSDKP能夠減輕高血壓和心肌梗死后心臟的纖維化。
[0010] 本發(fā)明將其用于角膜緣干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，通過抑制角膜緣組織酶解后所得細(xì) 胞中成纖維細(xì)胞的生長，提高所得角膜緣干細(xì)胞的純度，改善所得角膜緣干細(xì)胞的品質(zhì)。 [0011] 本發(fā)明還提供了角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)基，包括AcSDKP、胎牛血清和基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0012] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明提供的角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)基中AcSDKP的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為〇.〇1 %~10%。
[0013] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)基中AcSDKP的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為 0· 5%~1%〇
[0014] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)基中AcSDKP的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為 0· 5%〇
[0015] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，胎牛血清與基礎(chǔ)培養(yǎng)液的體積比為（10~20):(80~90)。
[0016] 在一些實(shí)施例中，胎牛血清與基礎(chǔ)培養(yǎng)液的體積比為10:90。
[0017] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM液體培養(yǎng)基。
[0018] 本發(fā)明提供的培養(yǎng)基中，以胎牛血清促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的生長，以AcSDKP抑制成 纖維細(xì)胞的生長。因此，采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠具有選擇性的分離角膜緣干細(xì)胞，且 分離培養(yǎng)所得的角膜緣干細(xì)胞的純度和數(shù)量皆較高，且由于成纖維細(xì)胞的生長受到抑制， 角膜緣干細(xì)胞受到成纖維細(xì)胞分泌物的影響較少，干性保持良好。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種角膜緣干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0020] 步驟1 :將胎兒角膜緣組織以胰蛋白酶解；
[0021] 步驟2 :將酶解后的產(chǎn)物以本發(fā)明提供的角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)基培養(yǎng)后，傳代。
[0022] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，胎兒角膜緣干細(xì)胞取自死亡的胎兒。
[0023] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，胎兒為兔、大鼠或人類胎兒。
[0024] 在一些實(shí)施例中，胎兒為人類胎兒。
[0025] 在一些實(shí)施例中，人類胎兒的胎齡為3個(gè)月~7個(gè)月。
[0026] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，胰蛋白酶以PBS溶液配制，pH值為7. 2-7. 4。
[0027] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%。
[0028] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，胰蛋白酶溶液與胎兒角膜緣組織的體積比為1:5。
[0029] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，胰蛋白酶酶解的溫度為37°C，時(shí)間為lOmin~20min。
[0030] 在一些實(shí)施例中，胰蛋白酶酶解的時(shí)間為15min。
[0031 ] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟2所述培養(yǎng)的接種密度為1X105個(gè)/ml。
[0032] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，酶解的終止液為含有FBS的PBS。
[0033] 在一些實(shí)施例中，酶解的終止液中FBS的體積分?jǐn)?shù)為10%。
[0034] 在一些實(shí)施例中，步驟2中所述培養(yǎng)的條件為5%C02、37°C、濕度95%。
[0035] 在一些實(shí)施例中，步驟2中所述培養(yǎng)的時(shí)間為24h。
[0036] 在一些實(shí)施例中，步驟2中所述培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為80 %。
[0037] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，傳代具體為：以胰蛋白酶消化細(xì)胞后，以本發(fā)明提供的角膜 緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0038] 本發(fā)明提供了AcSDKP在角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的應(yīng)用及角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng) 方法，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基中，以胎牛血清促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的生長，以AcSDKP抑制成纖 維細(xì)胞的生長。因此，采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠具有選擇性的分離角膜緣干細(xì)胞，且分 離培養(yǎng)所得的角膜緣干細(xì)胞的純度和數(shù)量皆較高，且由于成纖維細(xì)胞的生長受到抑制，角 膜緣干細(xì)胞受到成纖維細(xì)胞分泌物的影響較少，干性保持良好。實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明提供 的培養(yǎng)基分離角膜緣干細(xì)胞，細(xì)胞中抗體CX43的陽性率為0. 1%，AE5的陽性率為0. 3%， BrdU的陽性率為50. 3%，PCNA的陽性率為17. 8%。該效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 本發(fā)明提供了AcSDKP在角膜緣干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的應(yīng)用及角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng) 方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所 有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。 本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明 技術(shù)。
[0040] 本發(fā)明采用的試劑或儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0041] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0042] 實(shí)施例1
[0043] 培養(yǎng)基：90%DMEM培養(yǎng)基+10%FBS，其中AcSDKP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%。
[0044] 將胎齡為3~7個(gè)月死亡胎兒的眼球于無菌環(huán)境中用含雙抗（青霉素-鏈霉素， 1X)的PBS浸泡3min，再用不含雙抗的PBS沖洗干凈。
[0045] 在手術(shù)顯微鏡下，用組織鑷和角膜剪剪取人角膜緣組織，再用剪刀把組織剪碎成 約1mm3大小的塊狀。
[0046] 根據(jù)組織塊的體積，每1cm2組織塊加入5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶（以 PBS溶液配制，pH值為7. 2-7. 4)，37°C消化15min，每lml消化液加入含10 %FBS的PBS中 止消化，用l〇〇um網(wǎng)篩過濾，lOOOrpm離心5min，棄除上