專利名稱：移植物存儲(chǔ)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的工具組，以及用于存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的工具組的 用途，例如用于移值或植入。本發(fā)明也涉及存儲(chǔ)包括角膜緣上皮細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜內(nèi)皮 細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、表皮細(xì)胞(也就是，皮膚)、或骨髓衍生細(xì)胞的細(xì)胞或組織的 方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及提供角膜緣細(xì)胞移植和提供細(xì)胞存儲(chǔ)培養(yǎng)基的方法。
背景技術(shù)：
角膜起眼睛窗戶的作用，并由三層組成，其中最外層稱為上皮。在角膜的外圍，為 眼睛的半透明部分和白色部分之間的過渡區(qū)域，也稱為角膜緣，角膜干細(xì)胞位于角膜緣上。 這些細(xì)胞可遭受影響角膜的不同類型的疾病和危害，導(dǎo)致稱為角膜緣干細(xì)胞缺陷(limbal stem cell deficiency)的情況。當(dāng)角膜變得不透明時(shí)，這種情況可導(dǎo)致失明。
體外擴(kuò)增人角膜緣上皮細(xì)胞(HLEC)的移植是用于角膜緣干細(xì)胞缺陷(LSCD)的治 療2°_25。HLEC的體外擴(kuò)增原則是從病人(自體移植物)或存活的相關(guān)供體或尸體眼睛(同 種異體移植物)獲取的功能性角膜緣組織的活組織檢查產(chǎn)生未分化的角膜上皮。HLEC可通 過多種擴(kuò)展方案(包括角膜緣移植培養(yǎng)26_29、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2°’26’3°’31、在完整28’29’32’33或上皮 裸露的26’31—35羊膜(AM)上或其它細(xì)胞培養(yǎng)表面進(jìn)行培養(yǎng)2°’26’36_4°、與致死性照射的3T3纖 維母細(xì)胞的共培養(yǎng)2°’22’27’3°和air-lifting23’41)進(jìn)行離體培養(yǎng)。治療LS⑶的備選方法是使 用自體同源的口粘膜上皮層42_45。盡管實(shí)驗(yàn)方案已示出了好的臨床結(jié)果，角膜緣上皮干細(xì)胞 治療仍然面對(duì)有關(guān)外科后勤、組織無菌性、組織運(yùn)輸和組織可用性的挑戰(zhàn)。由于多層上皮細(xì) 胞的工程化需要3-4周的培養(yǎng)周期，并且組織培養(yǎng)易在培養(yǎng)的建立、培養(yǎng)基變化以及在運(yùn) 送到手術(shù)室的期間受微生物污染的影響，治療時(shí)機(jī)選擇可變得復(fù)雜。當(dāng)前，角膜緣上皮干細(xì) 胞治療的臨床應(yīng)用限于具有組織工程化所需的知識(shí)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備的眼科。
目前，角膜緣上皮細(xì)胞的存儲(chǔ)中存在幾個(gè)問題。
首先，角膜緣上皮細(xì)胞目前通常通過在羊膜上培養(yǎng)來存儲(chǔ)，該羊膜已經(jīng)縫合在聚 酯膜載體之上。膜載體與羊膜以及培養(yǎng)的上皮細(xì)胞隨后一起浸入到器官培養(yǎng)基(一般地存 儲(chǔ)在加塞的瓶中)。這種方法所帶來的問題在于它是費(fèi)時(shí)的，并且需要很費(fèi)時(shí)地將羊膜緊固 在膜載體上。此外，一旦膜載體浸入到培養(yǎng)基中，其就不能在不打開加塞的瓶的情況下進(jìn)行 微生物評(píng)估，而打開瓶塞則會(huì)有污染培養(yǎng)基的風(fēng)險(xiǎn)。
第二個(gè)問題是角膜緣上皮細(xì)胞的存儲(chǔ)的機(jī)械性質(zhì)?，F(xiàn)有的用于存儲(chǔ)上皮細(xì)胞的方 法導(dǎo)致載有細(xì)胞的羊膜在培養(yǎng)基內(nèi)自由漂浮。然而，實(shí)際上，如果上皮細(xì)胞被運(yùn)送它們將得 不到保護(hù)。培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞的運(yùn)送是重要的，因?yàn)?，在?shí)踐中其對(duì)于將細(xì)胞存儲(chǔ)在 “眼庫”中然后輸送到完成植入過程的醫(yī)院而言是有效的。此外，培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞所 浸入的培養(yǎng)基的深度可影響細(xì)胞的存儲(chǔ)和發(fā)展。因此，允許已經(jīng)應(yīng)用有細(xì)胞的羊膜在培養(yǎng) 基內(nèi)自由浮動(dòng)可使細(xì)胞處于次優(yōu)狀態(tài)。
在存儲(chǔ)培養(yǎng)角膜緣上皮細(xì)胞中的第三個(gè)問題是它們所存儲(chǔ)的溫度。緊跟穿透性 角膜成形術(shù)的剩余角膜鞏膜供體邊緣(其為用于培養(yǎng)的角膜上皮的工程化的HLEC源47’5°)一般地在31°C到37°C之間的溫度下(歐洲眼庫聯(lián)合目錄，2007)存儲(chǔ)在OC培養(yǎng)基中，或 在4°C下存儲(chǔ)在Optisol-GS52 (Bausch&Lomb，Irvine, CA)。此外，已經(jīng)示出，角膜緣上皮在 Optisol-GS中的存儲(chǔ)在六天后導(dǎo)致95%的基底層細(xì)胞活力53。然而，在這種溫度下需要特 別裝置來存儲(chǔ)外植體。
如上所述，HLEC通過獲得從供體得來的功能性角膜緣組織的活組織檢查而產(chǎn)生。 然而，活組織檢查位點(diǎn)的四周位置在現(xiàn)有技術(shù)中很少報(bào)告。因此先前不知道是否來自某位 置的活組織檢查具有提高的質(zhì)量。
本發(fā)明尋求解決上述問題中的一個(gè)或多個(gè)。
本文的實(shí)施例1首次報(bào)道了用于培養(yǎng)的HLEC的短期眼庫存儲(chǔ)的方法，其在角膜緣 上皮干細(xì)胞治療中是有用的46。在研究中，3周的HLEC培養(yǎng)物從培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到具有器官培養(yǎng) 基(OC)的玻璃容器，并在23°C下存儲(chǔ)一周，同時(shí)保持最初的多層結(jié)構(gòu)和未分化的表型(圖 8)。該方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，角膜緣表型的保持在確定移植時(shí)間中提供彈 性。第二，組織存儲(chǔ)允許時(shí)間以完成存儲(chǔ)培養(yǎng)基的微生物測(cè)試，其可增強(qiáng)離體擴(kuò)增的HLEC 的移植安全性。第三，封閉系統(tǒng)使組織能夠從實(shí)驗(yàn)室運(yùn)送到手術(shù)室和眼庫之間運(yùn)送，以增加 組織的可用性。最后，在室溫下的存儲(chǔ)消除了對(duì)加熱箱的需要。發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種用于存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的工具組，其包括
具有位于其中的開口和包圍開口的外圍壁的框架；以及
用于容納框架和容納液體培養(yǎng)基的可密封容器，可密封容器的一段由彈性部件形 成，以允許通過穿透元件進(jìn)入容器的內(nèi)部并隨后在撤回穿透元件之后形成密封。
方便地，工具組適于存儲(chǔ)用于培養(yǎng)細(xì)胞或組織的基材(substrate)。
優(yōu)選地，基材是平面或弓形基材。
方便地，基材是羊膜、接觸鏡、膠原凝膠或塑料材料，優(yōu)選地其中羊膜位于支撐網(wǎng) 上。
優(yōu)選地，細(xì)胞是角膜緣細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、骨髓衍 生細(xì)胞或表皮細(xì)胞。
方便地，角膜緣細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、表皮細(xì)胞 和骨髓衍生細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞。
有利地，工具組進(jìn)一步包括繞外圍壁周圍布置的伸長(zhǎng)或環(huán)形彈性部件，以固定平 面基材通過框架中的開口。
方便地，外圍壁包含用于容納伸長(zhǎng)或環(huán)形彈性部件的環(huán)形槽。
優(yōu)選地，工具組進(jìn)一步包括至少一個(gè)連接到框架以將框架支撐在培養(yǎng)基中的浮 體。
有利地，浮體連接到外圍壁的外部。
有利地，框架包括用于容納浮體的環(huán)形凹槽。
優(yōu)選地，浮體位于外圍壁周圍，以便當(dāng)框架位于容器內(nèi)、浮體支撐培養(yǎng)基中的框架 時(shí)，浮體位于外圍壁和容器之間。
有利地，浮體的任何部件之間的最大距離形成最大直徑，并且最大直徑是容器最8小直徑的至少80 %，優(yōu)選地至少90 %。
優(yōu)選地，至少一個(gè)浮體是由撞擊吸收材料制成。
有利地，至少一個(gè)浮體由能被穿透元件刺穿的可變型材料制成。
有利地，在浮體中提供間隙，以容納穿透元件。
優(yōu)選地，浮體位于框架上，使得支撐在框架上的平面基材的位置低于液體培養(yǎng)基 的液面小于2mm，優(yōu)選地小于1mm。
有利地，工具組進(jìn)一步包括支撐裝置，該支撐裝置用于保持容器并允許容器相對(duì) 支撐裝置的至少一部分自由旋轉(zhuǎn)。
有利地，支撐裝置包括萬向節(jié)。萬向節(jié)可允許在一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)垂直軸線中旋轉(zhuǎn)。
可備選地，支撐裝置包括用于保持容器的球形內(nèi)殼和包括用于容納內(nèi)殼的球形凹 槽的外殼，其中，內(nèi)殼在外殼內(nèi)旋轉(zhuǎn)。
優(yōu)選地，容器包括可移動(dòng)帽。
有利地，可移動(dòng)帽通過鉸鏈連接到容器。
有利地，彈性部件位于帽中。
優(yōu)選地，框架在空心圓柱中。
有利地，外圍壁包括一個(gè)或多個(gè)用于允許培養(yǎng)基通過的孔徑。
有利地，工具組進(jìn)一步包括培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，培養(yǎng)基是器官培養(yǎng)基。
可備選地，培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基CnT-20。
有利地，培養(yǎng)基包括極限必需培養(yǎng)基。
有利地，培養(yǎng)基是血清培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，培養(yǎng)基包括胎牛血清。
可備選地，培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。
有利地，無血清培養(yǎng)基包括0ptisol-GS或者PAA-Quantum。
可備選地，無血清培養(yǎng)基包括緩沖劑和極限必需培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，緩沖劑包括HEPES (4- (2-羥乙基)哌嗪乙烷-磺酸)，更優(yōu)選地濃度為 25mM。
有利地，極限必需培養(yǎng)基包括氨基酸、鹽、葡萄糖和維生素。
有利地，鹽包括下列成分中的至少一個(gè)氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸二氫鈉和 /或維生素包括葉酸、煙酰胺、核黃素和B-12中的至少一種。
有利地，培養(yǎng)基包括碳酸氫鈉。
有利地，培養(yǎng)基包括抗生素。
優(yōu)選地，抗生素是慶大霉素、萬古霉素、兩性霉素B或其混合物。
有利地，培養(yǎng)基包括至少60%的N-2-羥乙基哌嗪-N'-乙烷-磺酸緩沖的 Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，5 %至15 %的碳酸氫鈉、2 %至10 %的胎牛血清、10至 100mg/ml的慶大霉素、20至300mg/ml的萬古霉素以及0. 1至5mg/ml的兩性霉素B。
方便地，培養(yǎng)基具有10到IOOml的容積。
有利地，容器由塑料材料制成。
方便地，穿透元件是皮下注射針。
優(yōu)選地，工具組進(jìn)一步包括適合基材放置的網(wǎng)，優(yōu)選地，其中網(wǎng)是聚酯網(wǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的用于存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的工具組的 用途。
方便地，使用進(jìn)一步包括在基材上培養(yǎng)細(xì)胞或組織。
有利地，基材是平面或弓形基材。
優(yōu)選地，細(xì)胞外植體位于基材上。
有利地，角膜緣上皮移植存儲(chǔ)在3°C到37°C之間，優(yōu)選地在3°C到30°C之間，優(yōu)選 地在18°C到之間，更優(yōu)選地在20°C到25°C之間，更優(yōu)選地在22°C到之間，更優(yōu)選 地在22°C到23°C之間的溫度，更優(yōu)選地至少一天、二天、三天或四天，更優(yōu)選地至少七天的 時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的方法，包括將細(xì)胞或組織 保持在3°C到37°C之間的溫度下，其中，細(xì)胞或組織包括角膜緣上皮細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜 內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、表皮細(xì)胞或骨髓衍生細(xì)胞。
這允許存儲(chǔ)細(xì)胞而基本上不增加細(xì)胞分化。
優(yōu)選地，角膜緣上皮細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、表皮 細(xì)胞或骨髓衍生細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種存儲(chǔ)角膜緣上皮細(xì)胞的方法，其中，在細(xì)胞分 化中基本上不增加。
優(yōu)選地，角膜緣上皮細(xì)胞是培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，“在細(xì)胞分化中基本上不增加”指的是在存儲(chǔ)結(jié)束時(shí)與在存儲(chǔ) 開始時(shí)一樣，有至少80%、90%、95%或99%的未分化細(xì)胞。
有許多測(cè)試可用來確定是否在細(xì)胞分化中基本上不增加。例如，通過分析細(xì)胞中 不同免疫組織化學(xué)的標(biāo)記來確定。例如標(biāo)記p63、K19和波形蛋白分別可用來指示細(xì)胞未分 化。對(duì)于沒有分化的另一個(gè)測(cè)試是對(duì)于標(biāo)記Κ3的表達(dá)，細(xì)胞呈陰性。另一個(gè)測(cè)試是標(biāo)記 Cx43、K5、Kl和/或整聯(lián)蛋白β 1低的或陰性表達(dá)。
也應(yīng)注意到的是，當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)和分化時(shí)，它們所位于其中的培養(yǎng)基一般地每2 至3天更換，但在本發(fā)明的實(shí)施方案中，這種培養(yǎng)基的更換不發(fā)生。
有利地，該方法包括將細(xì)胞或組織保持在3°C和37°C之間的溫度下。
優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括在兩個(gè)位置之間運(yùn)送角膜緣上皮細(xì)胞的步驟。
有利地，該方法包括將細(xì)胞或組織保持在以下溫度3°C和30°C之間，優(yōu)選地在 18°C和之間，優(yōu)選地在20°C和25°C之間，優(yōu)選地在22°C和之間，優(yōu)選地在22°C或 23 °C。
優(yōu)選地，該方法包括將浸沒在無血清培養(yǎng)基中至少一天的細(xì)胞或組織存儲(chǔ)在18°C 和之間的溫度下。
實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定方面，存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的方法包括將浸沒在無血 清培養(yǎng)基中至少一天的細(xì)胞或組織保持在18°C和之間的溫度下，其中，細(xì)胞或組織包 括角膜緣上皮細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、表皮細(xì)胞或骨髓衍生 細(xì)胞，優(yōu)選培養(yǎng)的細(xì)胞。該方法允許存儲(chǔ)細(xì)胞而基本上不增加細(xì)胞的分化。
有利地，該方法進(jìn)一步包括將細(xì)胞或組織放置在基材上的步驟，優(yōu)選地為平面或 弓形基材。
優(yōu)選地，基材是羊膜、接觸鏡、膠原凝膠或塑料材料。
有利地，基材是羊膜，并且細(xì)胞是上皮細(xì)胞，并且其中細(xì)胞的位置使得上皮側(cè)面向羊膜。
優(yōu)選地，羊膜包括完整的羊膜上皮細(xì)胞。
有利地，該方法進(jìn)一步包括將基材連接到聚酯網(wǎng)的步驟。
優(yōu)選地，細(xì)胞或組織包括角膜緣上皮細(xì)胞并且是從供體眼睛的區(qū)域中獲得的，該 區(qū)域包括從眼睛頂端位置向每一側(cè)張開30°的扇形。
有利地，該區(qū)域包括從眼睛頂端位置向每一側(cè)張開15°的扇形。
有利地，該方法包括將細(xì)胞或組織保持在所述溫度下至少一天，優(yōu)選地至少兩天， 更優(yōu)選地至少三天，更優(yōu)選地至少四天，更優(yōu)選地至少七天。
優(yōu)選地，細(xì)胞或組織浸在液體培養(yǎng)基內(nèi)。
有利地，液體培養(yǎng)基包括極限必需培養(yǎng)基。
有利地，液體培養(yǎng)基是血清培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，液體培養(yǎng)基包括胎牛血清。
可備選地，液體培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。
方便地，無血清培養(yǎng)基包括0ptisol-GS或PAA-Quantum。
可備選地，無血清培養(yǎng)基包括緩沖劑和極限必需培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，緩沖劑包括HEPES (4- (2-羥乙基)哌嗪乙烷-磺酸)，更優(yōu)選地濃度為 25mM。
優(yōu)選地，極限必需培養(yǎng)基包括氨基酸、鹽、葡萄糖和維生素。
方便地，鹽包括氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸二氫鈉中的至少一種，和/或維生 素包括葉酸、煙酰胺、核黃素和B-12中的至少一種。
有利地，液體培養(yǎng)基包括碳酸氫鈉。
方便地，液體培養(yǎng)基包括抗生素。
優(yōu)選地，抗生素是慶大霉素、萬古霉素、兩性霉素B或其混合物。
有利地，液體培養(yǎng)基包括至少60%的N-2-羥乙基哌嗪-N'-乙烷-磺酸緩沖 的Dulbecco改進(jìn)的fegle培養(yǎng)基，5%至15%的碳酸氫鈉、2%至10%的胎牛血清、10至 100mg/ml的慶大霉素、20至300mg/ml的萬古霉素以及0. 1至5mg/ml的兩性霉素B。
方便地，液體培養(yǎng)基的體積在10到IOOml之間。
有利地，該方法進(jìn)一步包括調(diào)整液體培養(yǎng)基上的氣體的成分的步驟。
優(yōu)選地，細(xì)胞或組織存儲(chǔ)至少3天，更優(yōu)選地至少7天，更優(yōu)選地至少2周，更優(yōu)選 地至少3周。
有利地，細(xì)胞或組織存儲(chǔ)在密閉系統(tǒng)中。
有利地，該方法進(jìn)一步包括在存儲(chǔ)之前培養(yǎng)細(xì)胞或組織的步驟。
優(yōu)選地，培養(yǎng)細(xì)胞或組織的步驟包括在下述條件下保存細(xì)胞或組織在35°C和 39°C之間的溫度，優(yōu)選地為37°C ；在一定氣氛下浸入適于細(xì)胞培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中，該氣氛 包含90%和99%之間的氧和10%和之間的二氧化碳，優(yōu)選地95%的氧和5%的二氧化碳。
方便地，該方法使用本發(fā)明的工具組。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種提供角膜緣細(xì)胞外植體的方法，該方法包括 僅從供體眼睛中包括自眼睛頂端位置向每一側(cè)張開30°的扇形的區(qū)域內(nèi)取出角膜緣上皮 細(xì)胞。在這個(gè)方面，供體的眼睛的剩余部分保持在原位置。
優(yōu)選地，該方法包括僅從供體眼睛中包括自眼睛頂端位置的每一側(cè)張開15°的扇 形的區(qū)域內(nèi)取出角膜緣上皮細(xì)胞。
有利地，供體是尸體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包括HEPES緩沖劑和濃度在20mM和30mM之 間，優(yōu)選25mM的極限必需培養(yǎng)基的細(xì)胞存儲(chǔ)培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，細(xì)胞存儲(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)一步包括抗生素，優(yōu)選地為慶大霉素。
在本說明書中，所指的“細(xì)胞”指包括這種細(xì)胞的“組織”。
在本說明書中，用語“培養(yǎng)”用于細(xì)胞和組織中，以說明細(xì)胞或組織已經(jīng)經(jīng)受“離體 擴(kuò)增”，并且用語可互換使用。例如，在角膜緣細(xì)胞外植體中，組織從供體中取出，其中組織 通常僅包括2個(gè)或3個(gè)干細(xì)胞(殘余細(xì)胞是分化細(xì)胞)。外植體在含95%的氧氣和5%的 二氧化碳的環(huán)境下在激素上皮培養(yǎng)基中在37°C下進(jìn)行培養(yǎng)。每隔二天替換培養(yǎng)基。由于干 細(xì)胞的復(fù)制，培養(yǎng)或離體擴(kuò)增過程導(dǎo)致外植體中的未分化細(xì)胞的數(shù)量增加。培養(yǎng)的細(xì)胞通 常缺乏未培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)締組織，并包括很少細(xì)胞層。培養(yǎng)細(xì)胞比直接從供體取得的組織更 適于移植。
角膜緣細(xì)胞可通過參考特定細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核，以及細(xì)胞表面標(biāo)記定性，后者例如 描述在文獻(xiàn)"Schl δ tzer-Schrehardt U.等，Experimental Eye Research,第 81 卷第 247-264頁，2005年9月3日”中。示例性干細(xì)胞標(biāo)記在表1中提供。
表1-人眼睛表面上皮中的干細(xì)胞標(biāo)記的半定量免疫組織化學(xué)定位
權(quán)利要求
1.存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的方法，其包括將細(xì)胞或組織保持在3°C到37°C之間的溫度下，其 中所述細(xì)胞或組織包括角膜緣上皮細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、 表皮細(xì)胞或骨髓衍生細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述角膜緣上皮細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、 視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、表皮細(xì)胞或骨髓衍生細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞。
3.存儲(chǔ)角膜緣上皮細(xì)胞或包含角膜緣上皮細(xì)胞的組織的方法，其中在細(xì)胞分化中基本 上無增加。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述角膜緣上皮細(xì)胞是培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織保持在3°C和37°C之間 的溫度下。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括在兩個(gè)位置之間運(yùn)送所述 角膜緣上皮細(xì)胞或組織的步驟。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其包括將細(xì)胞或組織保持在如下溫度 3°C和30°C之間，優(yōu)選地在18°C和之間，優(yōu)選地在20°C和25°C之間，優(yōu)選地在22°C和 24 V之間，優(yōu)選22 °C或23 °C。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其包括將浸沒在無血清培養(yǎng)基中至少一天 的細(xì)胞或組織存儲(chǔ)在18°C和之間的溫度下。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述細(xì)胞或組織放置在基 材上的步驟，所述基材優(yōu)選地為平面或弓形基材。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述基材是羊膜、接觸鏡、膠原凝膠或塑料材料。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述基材是羊膜，所述細(xì)胞或組織包括上皮細(xì) 胞，并且其中所述細(xì)胞的位置使得上皮側(cè)面向羊膜側(cè)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述基材連接到聚酯網(wǎng) 的步驟。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞或組織包含角膜緣上皮細(xì) 胞并且是從供體眼睛的區(qū)域中獲得的，該區(qū)域包含從眼睛頂端位置向每一側(cè)張開30°的扇 形。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述區(qū)域包含從眼睛頂端位置向每一側(cè)張開 15°的扇形。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織保持在所述溫 度下至少一天，優(yōu)選地至少兩天，更優(yōu)選地至少三天，更優(yōu)選地至少四天，更優(yōu)選地至少七天。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞或組織浸在液體培養(yǎng)基內(nèi)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述液體培養(yǎng)基包含極限必需培養(yǎng)基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述液體培養(yǎng)基是血清培養(yǎng)基。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述液體培養(yǎng)基包含胎牛血清。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述液體培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述無血清培養(yǎng)基包含Optisol-GS或 PAA-Quantum0
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述無血清培養(yǎng)基包含緩沖劑和極限必需培養(yǎng)基。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述緩沖劑包含HEPES(4- (2-羥乙基)-1-哌嗪 乙烷-磺酸)，優(yōu)選地濃度為25mM。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述極限必需培養(yǎng)基包含氨基酸、鹽、葡萄 糖和維生素。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中鹽包含氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸二氫鈉中 的至少一種，和/或維生素包含葉酸、煙酰胺、核黃素和B-12中的至少一種。
26.根據(jù)權(quán)利要求8或16至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體培養(yǎng)基包括碳酸氫鈉。
27.根據(jù)權(quán)利要求8或16至沈中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體培養(yǎng)基包括抗生素。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述抗生素是慶大霉素、萬古霉素、兩性霉素B 或其混合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述液體培養(yǎng)基包含至少60%的N-2-羥乙基 哌嗪-N'-乙烷-磺酸緩沖的Dulbecco改進(jìn)的fegle培養(yǎng)基、5%至15%的碳酸氫鈉、2% 至10%的胎牛血清、10至100mg/ml的慶大霉素、20至300mg/ml的萬古霉素以及0. 1至 5mg/ml的兩性霉素B。
30.根據(jù)權(quán)利要求16至四中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體培養(yǎng)基的體積在10到 IOOml之間。
31.根據(jù)權(quán)利要求16或30所述的方法，其進(jìn)一步包括調(diào)整液體培養(yǎng)基上的氣體的成分 的步驟。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞或組織存儲(chǔ)至少3天，優(yōu)選 地至少7天，更優(yōu)選地至少2周，更優(yōu)選地至少3周。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞或組織存儲(chǔ)在密閉系統(tǒng)中。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括在存儲(chǔ)之前培養(yǎng)所述細(xì)胞 或組織的步驟。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中培養(yǎng)所述細(xì)胞或組織的步驟包括在下述條件下 保持細(xì)胞或組織在35°C和39°C之間的溫度，優(yōu)選地為37°C ；在一定氣氛下浸入適于細(xì)胞 培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中，該氣氛包含90%和99%之間的氧和10%和之間的二氧化碳，優(yōu) 選地95 %的氧和5 %的二氧化碳。
36.用于存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的工具組，其包括具有位于其中的開口和包圍所述開口的外圍壁的框架；以及用于容納所述框架和容納液體培養(yǎng)基的可密封容器，該可密封容器的一段由彈性部件 形成，從而允許通過穿透元件進(jìn)入容器的內(nèi)部并且隨后在撤回穿透元件之后形成密封。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的工具組，所述工具組適于存儲(chǔ)用于培養(yǎng)細(xì)胞或組織的基材。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的工具組，其中所述基材是平面或弓形基材。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的工具組，其中所述基材是羊膜、接觸鏡、膠原凝膠體或塑料材料，優(yōu)選地其中所述羊膜位于支撐網(wǎng)上。
40.根據(jù)權(quán)利要求36至39中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述細(xì)胞或組織包含角膜緣 細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、表皮細(xì)胞或骨髓衍生細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的工具組，其中所述角膜緣細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、 視網(wǎng)膜細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、表皮細(xì)胞和骨髓衍生細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的工具組，其進(jìn)一步包括可繞外圍壁周圍布置 的伸長(zhǎng)或環(huán)形彈性元件，以固定基材通過框架中的開口。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的工具組，其中所述外圍壁含有用于容納該伸長(zhǎng)或環(huán)形彈性 部件的環(huán)形槽。
44.根據(jù)權(quán)利要求36至43所述的工具組，進(jìn)一步包括至少一個(gè)連接到框架以將框架支 撐在培養(yǎng)基中的浮體。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的工具組，其中所述浮體連接到外圍壁的外部。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的工具組，其中所述框架包括用于容納浮體的環(huán)形凹槽。
47.根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述浮體位于外圍壁周圍，以 便當(dāng)框架位于容器內(nèi)、浮體支撐培養(yǎng)基中的框架時(shí)，浮體位于外圍壁和容器之間。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的工具組，其中所述浮體的任何部件之間的最大距離形成最 大直徑，并且該最大直徑是容器最小直徑的至少80%，優(yōu)選地至少90%。
49.根據(jù)權(quán)利要求44至48中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述至少一個(gè)浮體是由撞擊吸 收材料制成。
50.根據(jù)權(quán)利要求44至49中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述至少一個(gè)浮體由能被穿透 元件刺穿的可變形材料制成。
51.根據(jù)權(quán)利要求44至50中任一項(xiàng)所述的工具組，其中在浮體中具有間隙以容納穿透 元件。
52.根據(jù)權(quán)利要求44至51中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述浮體位于框架上，使得支 撐在框架上的基材的位置比液體培養(yǎng)基的液面低小于2mm，優(yōu)選小于1mm。
53.根據(jù)權(quán)利要求36至52中任一項(xiàng)所述的工具組，進(jìn)一步包括支撐裝置，該支撐裝置 用于保持容器并允許容器相對(duì)支撐裝置的至少一部分自由旋轉(zhuǎn)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的工具組，其中所述支撐裝置包括萬向節(jié)。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的工具組，其中所述支撐裝置包括用于保持容器的球形內(nèi)殼 和包括用于容納內(nèi)殼的球形凹槽的外殼，內(nèi)殼可在外殼內(nèi)旋轉(zhuǎn)。
56.根據(jù)權(quán)利要求36至55中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述容器包括可移動(dòng)帽。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的工具組，其中所述可移動(dòng)帽通過鉸鏈連接到容器。
58.根據(jù)權(quán)利要求56或57所述的工具組，其中所述彈性部件位于帽中。
59.根據(jù)權(quán)利要求36至58中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述框架為空心圓柱。
60.根據(jù)權(quán)利要求36至59中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述外圍壁包括一個(gè)或多個(gè)用 于允許培養(yǎng)基通過的孔。
61.根據(jù)權(quán)利要求36至60中任一項(xiàng)所述的工具組，進(jìn)一步包括培養(yǎng)基。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基CnT-20。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基是器官培養(yǎng)基。
64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基包括極限必需培養(yǎng)基。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基是血清培養(yǎng)基。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基包括胎牛血清。
67.根據(jù)權(quán)利要求61或64所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的工具組，其中所述無血清培養(yǎng)基包括=Optisol-GS或者 PAA-Quantum0
69.根據(jù)權(quán)利要求67所述的工具組，其中所述無血清培養(yǎng)基包括緩沖劑和極限必需培養(yǎng)基。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的工具組，其中所述緩沖劑包括HEPES(4- (2-羥乙基)-1-哌 嗪乙烷-磺酸)，優(yōu)選地濃度為25mM。
71.根據(jù)權(quán)利要求69或70所述的工具組，其中所述極限必需培養(yǎng)基包括氨基酸、鹽、葡 萄糖和維生素。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的工具組，其中鹽包括氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸二氫鈉 中的至少一種和/或維生素包括葉酸、煙酰胺、核黃素和B-12中的至少一種。
73.根據(jù)權(quán)利要求61至72中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基包括碳酸氫鈉。
74.根據(jù)權(quán)利要求61至73中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基包括抗生素。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的工具組，其中所述抗生素是慶大霉素、萬古霉素、兩性霉素 B或其混合物。
76.根據(jù)權(quán)利要求61所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基包括至少60%的N-2-羥乙基哌 嗪-N‘-乙烷-磺酸緩沖的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，5 %至15 %的碳酸氫鈉、2 %至 10%的胎牛血清、10至100mg/ml的慶大霉素、20至300mg/ml的萬古霉素以及0. 1至5mg/ ml的兩性霉素B。
77.根據(jù)權(quán)利要求61至76中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述培養(yǎng)基具有10到IOOml 的體積。
78.根據(jù)權(quán)利要求36至77中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述容器由塑性材料制成。
79.根據(jù)權(quán)利要求36至78中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述穿透元件是皮下注射針。
80.根據(jù)權(quán)利要求36至79中任一項(xiàng)所述的工具組，其中所述工具組進(jìn)一步包括適合基 材放置的網(wǎng)，優(yōu)選地其中網(wǎng)是聚酯網(wǎng)。
81.根據(jù)權(quán)利要求36至80中任一項(xiàng)所述的工具組在存儲(chǔ)細(xì)胞或組織中的用途。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的用途，進(jìn)一步包括在基材上培養(yǎng)細(xì)胞或組織。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的用途，其中所述基材是平面或弓形基材。
84.根據(jù)權(quán)利要求82或83所述的用途，其中所述細(xì)胞外植體位于基材上。
85.根據(jù)權(quán)利要求81至84中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述角膜緣上皮移植物存儲(chǔ)在 3 V到37 °C之間，優(yōu)選地在3 V到30 V之間，優(yōu)選地在18 °C到28 V之間，更優(yōu)選地在20 V到 25 °C之間，更優(yōu)選地在22 °C到M V之間，更優(yōu)選地在22 °C到23 °C之間的溫度，更優(yōu)選地至 少一天、二天、三天或四天，更優(yōu)選地至少七天的時(shí)間。
86.根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)的方法，其使用權(quán)利要求36至80中任一項(xiàng)的工具組。
87.提供角膜緣細(xì)胞外植體的方法，該方法包括僅從供體眼睛中包括自眼睛頂端位置向任一側(cè)張開30°的扇形的區(qū)域內(nèi)取出角膜緣上皮細(xì)胞。
88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，該方法包括僅從供體眼睛中包括自眼睛頂端位置向 任一側(cè)15°的扇形的區(qū)域內(nèi)取出角膜緣上皮細(xì)胞。
89.根據(jù)權(quán)利要求87或88所述的方法，其中所述供體是尸體。
90.一種細(xì)胞存儲(chǔ)培養(yǎng)基，其包括HEPES緩沖劑和濃度在20mM和30mM之間，優(yōu)選25mM 的極限必需培養(yǎng)基。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的細(xì)胞存儲(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)一步包括抗生素，優(yōu)選地為慶大霉素。
全文摘要
提供了一種用于存儲(chǔ)細(xì)胞或組織的工具組(1)。該工具組包括具有開口和包圍開口的外圍壁的框架(7)。也提供了一種用于容納框架(7)和容納液體培養(yǎng)基(6)的可密封容器(2)?？擅芊馊萜?2)的一段由彈性部件形成(5)，以允許通過穿透元件進(jìn)入容器(5)的內(nèi)部并且隨后在撤回穿透元件之后形成密封。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102036555SQ200880020735
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2008年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者S·雷德, T·P·烏特姆 申請(qǐng)人:梅丁諾娃公司