專利名稱：自體角膜上皮的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自體角膜上皮的制備方法。
背景技術(shù)：
燒傷、化學(xué)燒傷、眼表皮腫瘤、過敏性或放射性損傷、遺傳性眼病、眼表面化膿和其他眼綜合癥可以導(dǎo)致眼角膜上皮細胞脫落，并使眼結(jié)膜覆蓋于眼角膜表面，產(chǎn)生角膜大量新生血管增生、復(fù)發(fā)性翼狀胬肉甚至失明等角膜性疾病。對于這類眼科疾病的治療，一般需要進行手術(shù)切除，但是切除后仍然會復(fù)發(fā)和增生。因而，要從根本上治療此類疾病，必須構(gòu)建眼角膜的組織結(jié)構(gòu)且補充角膜緣的干細胞。
為了解決此類問題，人們發(fā)明了生物工程角膜，它是通過將從胚胎角膜緣組織或者另一側(cè)眼睛的角膜緣獲得的角膜干細胞在體外培養(yǎng)至第三、四代時，構(gòu)建在一個生物支架上而形成。它可用于治療由于各種原因?qū)е碌慕悄p傷或角膜脫落病人的角膜移植。
但是，胚胎角膜緣組織生物工程角膜上皮存在著許多不足第一，由于胚胎角膜緣組織來源于異體，由其制備的角膜上皮會與患者角膜緣中的免疫細胞發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，從而增加了患者的痛苦和手術(shù)失敗的可能性。第二，由于制備角膜采用的生物支架為膠原蛋白、隱形眼鏡或羊膜，使得角膜干細胞和上皮細胞在其表面難以均勻生長，手術(shù)后降解速度緩慢，因而限制了臨床應(yīng)用。第三，角膜緣細胞的生長采用的鼠源性滋養(yǎng)層細胞，具有潛在的非人類來源的傳染；而且采用的胎牛血清培養(yǎng)基，也易于傳染牛的傳染病等，這些潛在的感染源對于患者是一個威脅。
申請?zhí)枮?3150375.6的中國專利申請公開了一種自體角膜上皮及其制備方法，該角膜上皮是將來源于患者自體的角膜上皮干細胞在體外擴增和分化后，接種到纖維蛋白生物支架上進行培養(yǎng)構(gòu)建而成。該組織工程角膜克服了上述缺點，但是當(dāng)雙側(cè)眼角膜部位都出現(xiàn)問題時，自體角膜緣干細胞來源就缺失了。
因而，需要這樣一種新的組織工程自體角膜上皮，它能克服上述非自體角膜的缺點，同時它源于非眼角膜組織，以便在雙側(cè)角膜組織都無法獲得時，仍然能構(gòu)建出可用于移植的自體角膜上皮。另外，最好能有這樣一種組織工程自體角膜上皮的制備方法，該方法既能采用非自體角膜細胞，也可以用自體角膜緣細胞來制備角膜上皮，以使該方法能具有通用性，便于掌握和操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個目的是提供一種組織工程自體角膜上皮的制備方法，該方法可以采用自體的口腔粘膜細胞制備角膜上皮，從而排除了當(dāng)雙側(cè)眼睛都出現(xiàn)問題時對眼角膜緣細胞來源的限制，同時該方法還能用自體的角膜緣細胞制備角膜上皮。
本發(fā)明所提供的組織工程自體角膜上皮的制備方法，包括如下步驟(a)原代培養(yǎng)患者自體的口腔粘膜組織或角膜緣組織的細胞3-15天；(b)對所得細胞進行傳代擴增培養(yǎng)7-30天；以及(c)以纖維蛋白原為支架材料，與傳代培養(yǎng)的細胞一起構(gòu)建成組織工程角膜上皮。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，將所得到的組織工程角膜上皮在37℃，5％CO2下，繼續(xù)培養(yǎng)5-45分鐘，優(yōu)選10-30分鐘，更優(yōu)選20分鐘，再加入1ml DMEM后用于移植。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，用角膜培養(yǎng)液進行細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，所述角膜培養(yǎng)液選自DMEM(Dulbecco改良的最低基礎(chǔ)培養(yǎng)液)或Epilife(購自美國CascadeBiologics公司)，優(yōu)選為Epilife；可選地再添加以角膜培養(yǎng)液總量計的下列物質(zhì)0.1-0.5％(質(zhì)量百分數(shù))的腦垂體提取液、0.1-5ng/ml的上皮生長因子、0.05-0.5μg/ml的氫化可的松、1-20μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白以及1-20μg/ml的胰島素，其中各物質(zhì)的進一步優(yōu)選加量為腦垂體提取液0.3％、上皮生長因子3ng/ml、氫化可的松0.2μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/ml以及胰島素10μg/ml。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，所述培養(yǎng)容器為培養(yǎng)皿、六孔板等，更優(yōu)選為35mm的細胞培養(yǎng)皿。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，步驟(a)所述自體口腔粘膜組織為取自患者自體舌下、面頰內(nèi)側(cè)或舌面等口腔粘膜部位的1-3平方毫米的口腔粘膜組織塊；角膜緣組織為取自患者正常眼角膜緣的1-2平方毫米大小的組織塊。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，在步驟(a)之前，用慶大霉素消毒所述口腔粘膜組織或者所述角膜緣組織，其濃度為50-200mg/ml，優(yōu)選為100mg/ml，再用0.05％的胰酶/EDTA液消化20分鐘后，用DMEM沖洗組織2次，以去除表面的消化酶。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，在步驟(a)中，將組織塊剪碎并均勻分布于培養(yǎng)容器的內(nèi)部表面，加入角膜培養(yǎng)液進行原代培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，優(yōu)選每3天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為4天-12天，優(yōu)選5天-10天，更優(yōu)選7天。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，在步驟(b)中，用角膜培養(yǎng)液在37℃，5％CO2下，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，在細胞達到50％-90％匯集后傳代，優(yōu)選在細胞達到70％匯集后傳代，共培養(yǎng)9天-25天，優(yōu)選12天-20天，再優(yōu)選13天-16天，更優(yōu)選14天。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，在步驟(c)中，以培養(yǎng)容器中待構(gòu)建的體系的總體積為準，先將加量為1-8mg/ml的纖維蛋白原平鋪于培養(yǎng)皿底面，然后再將加量為1-5單位(unit)/ml的人凝血因子、加量為1-5μmol/ml的鈣離子和約20000-80000個已傳代的細胞，在室溫下與鋪好的纖維蛋白原混合均勻，使混合液體在培養(yǎng)容器中的厚度為0.5mm-1.5mm。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮制備方法的一個優(yōu)選方案，在步驟(c)中，以培養(yǎng)容器中待構(gòu)建的體系的總體積為準，先將加量為5mg/ml的人纖維蛋白原平鋪于培養(yǎng)皿底面，然后再將加量為2單位/ml的人凝血因子、加量為2.5μmol/ml的CaCl2和約40000個已傳代的細胞，在20-25℃下與鋪好的人纖維蛋白原混合均勻，使混合液體在培養(yǎng)容器中的厚度為1mm。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮的制備方法的一個優(yōu)選方案，所述纖維蛋白原為人的纖維蛋白原或凍干人纖維蛋白原；所述凝血因子從人或動物血液提取，優(yōu)選為人凝血因子，可選自凝血因子II-XII的任何一種或多種，從動物提取的凝血因子是指非人重組的動物自身的凝血因子，所述動物可以是豬、牛等，優(yōu)選豬。
按照本發(fā)明的組織工程自體角膜上皮的制備方法的一個優(yōu)選方案，所述人的纖維蛋白原按下述方法制備取200ml人血漿，在4℃、3500轉(zhuǎn)/min的條件下離心30分鐘，棄上清液，加10ml注射用水，制成懸濁液，保存?zhèn)溆谩?br> 按照本發(fā)明所述方法制備的組織工程自體角膜上皮，可作為角膜移植用的生物材料，可移植到病人損傷角膜表面，從而修復(fù)和恢復(fù)角膜功能。
本發(fā)明組織工程自體角膜上皮的制備方法以口腔粘膜作為角膜上皮細胞來源，在克服了現(xiàn)有技術(shù)的免疫排斥反應(yīng)、非人類來源的傳染和其生物支架不適于細胞均勻生長、降解慢等缺陷的同時，使得自體角膜的制備不受雙側(cè)角膜上皮缺損的限制，使患者在任何情況下都能得到適合的角膜。此外，該方法也能應(yīng)用角膜緣細胞來制備角膜上皮，而且其效果比現(xiàn)有的方法更佳。這樣，就可以選擇使用角膜緣細胞/口腔粘膜細胞，使操作更加靈活。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明。
圖1A為本發(fā)明以口腔粘膜為細胞來源的成品外觀圖，圖1B為本發(fā)明以角膜緣為細胞來源的成品外觀圖；
圖2A為培養(yǎng)成功的以口腔粘膜為細胞來源的角膜上皮細胞在100倍光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)照片，圖2B為培養(yǎng)成功的以角膜緣為細胞來源的角膜上皮細胞在100倍光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)照片；圖3A、4A、5A、6A和7A是當(dāng)采用口腔粘膜作為細胞來源時，患者術(shù)前的眼角膜情況圖；圖3B、4B、5B、6B和7B是當(dāng)采用口腔粘膜作為細胞來源時，患者術(shù)后的眼角膜情況圖；圖8A、9A、10A、11A是當(dāng)采用眼角膜緣作為細胞來源時，患者術(shù)前的眼角膜情況圖；圖8B、9B、10B、11B是當(dāng)采用眼角膜緣作為細胞來源時，患者術(shù)后的眼角膜情況圖。
具體實施例方式
從正常人的眼角膜或口腔粘膜中分離出干細胞，進行體外培養(yǎng)、增殖和分化，在二到三周內(nèi)使這些細胞增殖數(shù)百萬倍，然后將這些帶有干細胞的上皮細胞種在一種生物膜上，從而長成生物工程角膜，將其移植到角膜損傷病人的病變部位，進行修復(fù)，使病人癥狀減輕、視力恢復(fù)。
在確定取角膜或口腔粘膜組織之前，由具有執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格的醫(yī)務(wù)人員向患者或患者家屬解釋原因，爭得患者或家屬同意，角膜上皮的取材部位由具有執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格的醫(yī)務(wù)人員確定，并按照醫(yī)院規(guī)定的手術(shù)原則取材?；颊哌M行體檢和化驗，包括常規(guī)檢驗、傳染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的檢查。所取的口腔粘膜立即由專業(yè)人員放入無菌容器內(nèi)，并立即冷藏(10℃以下)，然后按規(guī)定的標準操作程序處理。
實施例1口腔粘膜為細胞來源的組織工程自體角膜上皮的制備一、口腔粘膜組織健康細胞的提取和原代培養(yǎng)1.手術(shù)室取材(百級空氣凈化)由專業(yè)醫(yī)生從患者的舌下口腔粘膜取1mm×3mm大小的組織塊。
2.所取組織的保存在送達實驗室運輸過程中，可以將組織塊放入含有保存液的15ml保存管中保存(4℃)，所述保存液含DMEM和10％血清。
3.在超凈工作臺中消毒、清洗，修剪組織取新鮮的組織或者經(jīng)過保存的組織，用含100mg/ml慶大霉素的PBS(磷酸緩沖液)沖洗3次，修剪多余的脂肪和皮下結(jié)締組織。
4.組織消化(Thermo CO2培養(yǎng)箱)將上述組織塊放置于35mm培養(yǎng)皿中，加入濃度為0.05％的胰酶/EDTA液，消化20分鐘，并將組織塊用鑷子提起放入DMEM中沖洗2次，去除表面的消化酶。
5.細胞分離將消化后的組織塊剪碎并均勻分布于35mm的培養(yǎng)皿內(nèi)部表面，加入0.5ml角膜培養(yǎng)液培養(yǎng)，每三天更換培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)5天后收獲細胞。
6.細胞鑒定1)形態(tài)學(xué)采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察。細胞多呈多角型，角為鈍角，細胞呈圓性。細胞外觀透明，細胞緊密聯(lián)結(jié)成單層或多層。為典型正常的口腔粘膜上皮細胞。
2)細胞表型采用Keratin角質(zhì)蛋白3的抗體(美國ICN公司)進行細胞免疫抗原結(jié)合反應(yīng)，鑒定為典型正常的口腔粘膜上皮細胞。
3)致癌性采用裸鼠試驗，見《美國FDA關(guān)于生物制品生產(chǎn)用細胞株鑒定和指控的考慮要點)》，結(jié)果無致癌性。
4)無菌檢測按《中國生物制品規(guī)程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A/B項進行，結(jié)果符合無菌要求。
5)細胞存活率采用臺盼藍(trypan blue)染色法檢查，核染色的細胞為死亡細胞，不著色的細胞為活細胞，計數(shù)總細胞數(shù)和死細胞數(shù)，計算細胞存活率。
細胞存活率＝[(總細胞數(shù)-死細胞數(shù))/總細胞數(shù)]×100％經(jīng)測定，細胞存活率超過80％。
二、細胞培養(yǎng)傳代在細胞中加入Epilife(美國Cascade Biologics公司，編目碼M-EPI-500-CA)，接種入35mm培養(yǎng)皿，在Thermo CO2培養(yǎng)箱，37℃，5％CO2下進行培養(yǎng)，每3天換液1次，在上皮細胞達到70％匯集細胞后傳代，培養(yǎng)14天。
三、構(gòu)建組織工程自體角膜上皮1.制備人纖維蛋白原用200ml血漿在4℃離心，3500轉(zhuǎn)/min，離心30分鐘，棄上清液，加10ml注射用水，制成懸濁液，保存?zhèn)溆谩?br> 2.構(gòu)建角膜上皮采用人的纖維蛋白原為材料，按照濃度為5mg/ml，加入2unit/ml人的凝血因子(購于Sigma公司)和2.5μmol/ml CaCl2，同時加入約40000個左右傳代至第三代的細胞，室溫下混合，立刻倒入35mm的培養(yǎng)皿中，形成0.8mm厚的液體層。將培養(yǎng)皿放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中20分鐘后，加入1ml DMEM培養(yǎng)液即可。
四、使用方法和效果使用前，用不含血清的培養(yǎng)液沖洗三次。在角膜的移植前，需要眼外科醫(yī)生對病人進行360度的環(huán)狀的病變部位切除，將本發(fā)明組織工程自體角膜做四針縫合于環(huán)狀切割部位，用隱形鏡片壓迫，將眼瞼采用兩針縫合，一周后拆除縫線，有新生的角膜上皮形成，角膜的功能和視力得到改善。
產(chǎn)品的儲存和運輸應(yīng)在2℃-10℃、陰涼、干燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的環(huán)境中進行。
本發(fā)明主要應(yīng)用于燒傷，化學(xué)燒傷，眼表皮腫瘤，過敏性、放射性損傷，遺傳性眼病，眼表面化膿和其他眼綜合癥導(dǎo)致的眼角膜上皮細胞脫落，結(jié)膜覆蓋于眼角膜表面而致的失明。
實施例2角膜緣為細胞來源的組織工程自體角膜上皮的制備一、角膜緣組織健康細胞的提取和原代培養(yǎng)1.手術(shù)室取材(百級空氣凈化)由專業(yè)醫(yī)生從患者的另一側(cè)正常眼角膜緣取1mm×1mm大小組織塊。
2.所取組織的保存在送達實驗室運輸過程中，可以將組織塊放入含有保存液的15ml保存管中保存(4℃)，所述保存液含有DMEM和10％血清。
3.在超凈工作臺中消毒、清洗，修剪組織取新鮮的組織或者經(jīng)過保存的組織，用含100mg/ml慶大霉素的PBS沖洗3次，修剪多余的脂肪和皮下結(jié)締組織。
4.組織消化(Thermo CO2培養(yǎng)箱)將上述組織塊放置于35mm培養(yǎng)皿中，加入濃度為0.05％的胰酶/EDTA液，消化20分鐘，并將組織塊用鑷子提起放入DMEM中沖洗2次，去除表面的消化酶。
5.細胞分離將消化后的組織塊剪碎并均勻分布于35mm的培養(yǎng)皿內(nèi)部表面，加入0.5ml角膜培養(yǎng)液培養(yǎng)，每三天更換培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)14天后收獲細胞。
6.細胞鑒定1)形態(tài)學(xué)采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察。細胞多呈多角型，角為鈍角，細胞呈圓性。細胞外觀透明，細胞緊密聯(lián)結(jié)成單層或多層。為典型正常的角膜上皮細胞。
2)細胞表型采用Keratin角質(zhì)蛋白3的抗體(美國ICN公司)進行細胞免疫抗原結(jié)合反應(yīng)，鑒定為典型正常的角膜上皮細胞。
3)致癌性采用裸鼠試驗，見《美國FDA關(guān)于生物制品生產(chǎn)用細胞株鑒定和指控的考慮要點》，結(jié)果無致癌性。
4)無菌檢測按《中國生物制品規(guī)程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A/B項進行，結(jié)果符合無菌要求。
5)細胞存活率采用臺盼藍染色法檢查，核染色的細胞為死亡細胞，不著色的細胞為活細胞，計數(shù)總細胞數(shù)和死細胞數(shù)，計算細胞存活率。
細胞存活率＝[(總細胞數(shù)-死細胞數(shù))/總細胞數(shù)]×100％經(jīng)測定，細胞存活率超過80％。
二、細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)在細胞中加入Epilife，接種入35mm培養(yǎng)皿，在ThermoCO2培養(yǎng)箱，37℃，5％CO2下進行培養(yǎng)，每3天換液1次，在上皮細胞達到70％匯集細胞后傳代，培養(yǎng)14天。
三、構(gòu)建組織工程自體角膜上皮1.制備人纖維蛋白原用200ml血漿在4℃離心，3500轉(zhuǎn)/min，離心30分鐘，棄上清液，加10ml注射用水，制成懸濁液，保存?zhèn)溆谩?br> 2.構(gòu)建角膜上皮采用人的纖維蛋白原為材料，按照濃度為5mg/ml，加入2unit/ml人的凝血因子(購于Sigma公司)和2.5μmol/ml CaCl2，同時加入約40000個左右傳代至第三代的細胞，室內(nèi)溫下混合，立刻倒入35mm的培養(yǎng)皿中，形成1mm厚的液體層。將培養(yǎng)皿放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中20分鐘后，加入1ml DMEM培養(yǎng)液即可。
四、使用方法和效果使用前，用不含血清的培養(yǎng)液沖洗三次。在角膜的移植前，需要眼外科醫(yī)生對病人進行360度的環(huán)狀的病變部位切除，將本發(fā)明組織工程自體角膜做四針縫合于環(huán)狀切割部位，用隱形鏡片壓迫，將眼瞼采用兩針縫合，一周后拆除縫線，有新生的角膜上皮形成，角膜的功能和視力得到改善。
產(chǎn)品的儲存和運輸應(yīng)在2℃-10℃、陰涼、干燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的環(huán)境中進行。
本發(fā)明主要應(yīng)用于燒傷，化學(xué)燒傷，眼表皮腫瘤，過敏性、放射性損傷，遺傳性眼病，眼表面化膿和其他眼綜合癥導(dǎo)致的眼角膜上皮細胞脫落，結(jié)膜覆蓋于眼角膜表面而致的失明。
組織工程自體角膜上皮的臨床報告一、診斷標準角膜緣干細胞缺乏診斷標準角膜緣新生血管生長或角膜上皮結(jié)膜化大于或等于一個象限。
角膜上皮長期缺損診斷標準角膜上皮缺損時間7天以上。
病因診斷1.酸、堿等化學(xué)燒傷及熱燒傷；2.藥物過敏；3.各種原因所致的角膜緣大量淺層新生血管；4.復(fù)發(fā)性翼狀胬肉。
二、納入病例標準1.符合角膜緣干細胞缺乏或角膜上皮長期缺損診斷標準。
2.患者年齡≥12歲，可配合各項檢查。
3.單眼患病，對側(cè)眼無明顯眼病史。
4.簽署知情同意書者。
5.基礎(chǔ)淚液分泌試驗≥5mm(濾紙統(tǒng)一規(guī)格)。
6.裂隙燈檢查角膜及結(jié)膜無明顯感染及免疫性炎癥表現(xiàn)。
角膜新生血管位于上皮下及基質(zhì)淺層(≤1/4角膜厚度)。
瞼球粘連≤2個象限。
瞼裂閉合完全。無眼瞼內(nèi)翻倒睫。
三、取材術(shù)前檢查血、尿常規(guī)，肝、腎功能，澳抗，愛滋病抗體。
取材應(yīng)在正規(guī)手術(shù)室內(nèi)進行。
取材部位舌下口腔粘膜取1mm×1mm大小的組織塊。另一側(cè)正常眼角膜緣取1mm×1mm大小組織塊。
四、實驗室體外培養(yǎng)標本取材后立即置于保存液中，放在2℃-10℃的保溫箱中運輸及保存，于6小時內(nèi)進行培養(yǎng)，以生物組織工程技術(shù)培養(yǎng)自體口腔粘膜/眼角膜緣干細胞，并符合其組織工程自體角膜上皮注冊產(chǎn)品標準。
五、剔除病例標準口腔粘膜/眼角膜緣干細胞培養(yǎng)失敗，培養(yǎng)所得的產(chǎn)品不符合產(chǎn)品標準者。
六、移植手術(shù)1.術(shù)前點用抗生素眼藥水3天，4次/天。
2.手術(shù)應(yīng)在正規(guī)手術(shù)室顯微鏡下進行。
3.角膜上皮刮除范圍應(yīng)大于病變2mm2。
4.移植片與植床應(yīng)貼合緊密，不應(yīng)有積血或積液殘留。
5.以8-0可吸收線間斷縫合固定植片。
6.如有瞼球粘連，應(yīng)將結(jié)膜與角膜組織徹底分離，充分止血并將結(jié)膜后退。
7.術(shù)畢，術(shù)眼涂點必舒眼膏并包扎。
七、術(shù)后處理1.連續(xù)包扎2天，第三天打開點藥。
2.口服抗生素3天，打開包扎后點用點必舒液1周，4次/天?？赏瑫r點用人工淚液，但禁用上皮生長因子。
八、療效評定標準(一)顯效1.角膜新生血管減少在二級(含二級)以上或消失。
2.角膜上皮缺損修復(fù)在二級(含二級)以上或消失。
3.眼部自覺刺激癥狀減輕在二級(含二級)以上或消失。
(二)有效1.角膜新生血管減少在一級或以上。
2.角膜上皮缺損修復(fù)在一級或以上。
3.眼部自覺刺激癥狀減輕在一級或以上。
(三)無效各項指標未達到上述標準者。
顯效、有效的判定標準至少滿足第(1)條加第(2)或第(3)條。九、數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計1.數(shù)據(jù)收集所有入選病例均必須完成病例觀察表，研究者將觀察、檢查結(jié)果及時、準確、完整、規(guī)范、真實地記錄于病歷及病例觀察表中。
全部數(shù)據(jù)錄入數(shù)據(jù)庫并校對后，將數(shù)據(jù)庫交統(tǒng)計分析人員進行統(tǒng)計分析，并提供統(tǒng)計報告，交臨床試驗的主要研究者寫出臨床總結(jié)報告。
2.統(tǒng)計分析根據(jù)數(shù)據(jù)性質(zhì)，對基礎(chǔ)資料數(shù)據(jù)、療效分析(各指標分析)及安全性分析、分別進行統(tǒng)計描述。
計量數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法觀察組內(nèi)前后變化情況采用配對樣本t檢驗。
計數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法采用確切概率法。
等級型數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法觀察組內(nèi)前后變化情況采用符號秩和檢驗。
3.統(tǒng)計軟件所有的統(tǒng)計均利用SAS JMP5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用雙側(cè)檢驗，以P≤0.05作為有統(tǒng)計學(xué)意義。
十、結(jié)論本產(chǎn)品在北京市兩家三甲醫(yī)院進行了臨床研究，共入選16例口腔粘膜為細胞來源的患者和18例角膜緣為細胞來源的患者，經(jīng)六個月觀察后評價其對于角膜上皮長期缺損和角膜緣干細胞缺乏患者的角膜刺激癥、角膜上皮缺損、角膜新生血管以及視力的改善情況，各主要觀察指標的療效如下(一)口腔粘膜為細胞來源1.角膜刺激癥狀明顯改善8例，改善6例，無改善2例，改善率87.5％；2.角膜上皮缺損明顯改善8例，改善4例，無改善4例，改善率75％；3.角膜新生血管明顯改善6例，改善5例，無改善5例，改善率68.75％；4.視力明顯改善2例，改善2例，無改善12例，改善率25％。
總體評價顯效(3)明顯改善+(2)或(1)明顯改善共計6例；有效(3)改善+(2)或(1)明顯改善或改善共計4例；即總體有效10例，總有效率62.5％。
本說明書附圖中3A-7A和3B-7B分別例舉了口腔粘膜為細胞來源的患者術(shù)前和術(shù)后的眼角膜情況圖以作說明，其中圖3A和圖3B來源于患者李××，女，32歲，診斷熱燒傷，病程40天；圖4A和圖4B來源于患者閆××，女，38歲，診斷病毒性角膜炎致角膜上皮糜爛，病程34月；圖5A和圖5B來源于患者張××，男，28歲，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉，病程6月；圖6A和圖6B來源于患者常××，男，26歲，過氧乙酸燒傷，病程30天；圖7A和圖7B來源于患者張××，男，40歲，翼狀胬肉，病程6月。
從圖中可以看出在手術(shù)移植本發(fā)明的組織工程自體角膜后，患者的病情得到了改善。
(二)角膜緣為細胞來源1.角膜刺激癥狀明顯改善8例，改善7例，無改善3例，改善率83.3％；
2.角膜上皮缺損明顯改善8例，改善6例，無改善4例，改善率77.8％；3.角膜新生血管明顯改善6例，改善7例，無改善5例，改善率72.2％；4.視力明顯改善2例，改善3例，無改善13例，改善率27.8％。
總體評價顯效(3)明顯改善+(2)或(1)明顯改善共計6例；有效(3)改善+(2)或(1)明顯改善或改善共計7例；即總體有效13例，總有效率72.2％。
本說明書附圖中8A-11A和8B-11B分別例舉了角膜緣為細胞來源的患者術(shù)前和術(shù)后的眼角膜情況圖以作說明，其中圖8A和圖8B來源于患者史××，男，40歲，診斷血管增生，病程3月；圖9A和圖9B來源于患者馬××，女，28歲，診斷復(fù)發(fā)性翼狀胬肉、血管增生，病程5個月；圖10A和圖10B來源于患者梅××，男，35歲，鐵水燒傷，病程20天；圖11A和圖11B來源于患者尹××，男，46歲，堿燒傷，病程30個月。
從圖中可以看出在手術(shù)移植本發(fā)明的組織工程自體角膜后，患者的病情得到了改善。
權(quán)利要求
1.一種自體角膜上皮的制備方法，包括如下步驟(a)原代培養(yǎng)患者自體的口腔粘膜組織或角膜緣組織的細胞3-15天；(b)對所得細胞進行傳代擴增培養(yǎng)7-30天；以及(c)以纖維蛋白原為支架材料，與傳代培養(yǎng)的細胞一起構(gòu)建成組織工程角膜上皮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所得到的組織工程角膜上皮在37℃，5％CO2下，繼續(xù)培養(yǎng)5-45分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(a)所述自體口腔粘膜組織為取自患者自體舌下、面頰內(nèi)側(cè)或舌面的1-3平方毫米的組織塊；角膜緣組織為取自患者正常眼角膜緣的1-2平方毫米大小的組織塊。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，用角膜培養(yǎng)液進行細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，所述角膜培養(yǎng)液為DMEM或Epilife，或者是添加有以角膜培養(yǎng)液總量計的質(zhì)量百分數(shù)為0.1-0.5％的腦垂體提取液、0.1-5ng/ml的上皮生長因子、0.05-0.5μg/ml的氫化可的松、1-20μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白以及1-20μg/ml的胰島素的DMEM或Epilife。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述角膜培養(yǎng)液為添加有以角膜培養(yǎng)液總量計的質(zhì)量百分數(shù)為0.3％的腦垂體提取液、3ng/ml的上皮生長因子、0.2μg/ml的氫化可的松、10μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白以及10μg/ml的胰島素的DMEM或Epilife。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，在步驟(a)之前，用慶大霉素消毒所述口腔粘膜組織或者所述角膜緣組織，其濃度為50-200mg/ml，再用0.05％的胰酶/EDTA液消化20分鐘后，用DMEM沖洗組織2次。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，將組織塊剪碎并均勻分布于培養(yǎng)容器的內(nèi)部表面，加入角膜培養(yǎng)液進行原代培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為5-10天。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，用角膜培養(yǎng)液在37℃，5％CO2下，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，在細胞達到50％-90％匯集后傳代，培養(yǎng)12-20天。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，以培養(yǎng)容器中待構(gòu)建的體系的總體積為準，先將加量為1-8mg/ml的纖維蛋白原平鋪于培養(yǎng)皿底面，然后再將加量為1-5單位/ml的人凝血因子、加量為1-5μmol/ml的鈣離子和20000-80000個已傳代的細胞，在室溫下與鋪好的纖維蛋白原混合均勻，使所得到的混合液體在培養(yǎng)容器中的厚度為0.5mm-1.5mm。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，先將加量為5mg/ml的人纖維蛋白原平鋪于培養(yǎng)皿底面，然后再將加量為2單位/ml的人凝血因子、加量為2.5μmol/ml的CaCl2和40000個已傳代的細胞，在20-25℃下與鋪好的人纖維蛋白原混合均勻，使混合液體在培養(yǎng)容器中的厚度為1mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種自體角膜上皮的制備方法，包括如下步驟(a)原代培養(yǎng)患者自體的口腔粘膜組織或角膜緣組織的細胞3－15天；(b)對所得細胞進行傳代擴增培養(yǎng)7－30天；(c)以纖維蛋白原為支架材料，與傳代培養(yǎng)的細胞一起構(gòu)建成組織工程角膜上皮。本發(fā)明方法在克服了現(xiàn)有技術(shù)的免疫排斥反應(yīng)、非人類來源的傳染和其生物支架不適于細胞均勻生長、降解慢等缺陷的同時，使得自體角膜的制備不受雙側(cè)角膜上皮缺損的限制，使患者在任何情況下都能得到適合的角膜。
文檔編號C12N5/08GK1916166SQ200610128698
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者韓斌 申請人:北京賽爾泰和生物醫(yī)藥科技有限公司