專利名稱：Ps-341在制備協(xié)同誘導(dǎo)分化治療白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬的化合物的應(yīng)用，涉及化合物PS-341與維甲酸類藥物在制備聯(lián) 合治療白血病藥物中的應(yīng)用，尤其是涉及化合物PS-341在制備協(xié)同促進(jìn)維甲 酸類藥物誘導(dǎo)分化治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
誘導(dǎo)分化治療是腫瘤化學(xué)治療的一個(gè)重要領(lǐng)域，它應(yīng)用化學(xué)藥物誘導(dǎo)腫瘤 細(xì)胞分化并逆轉(zhuǎn)其增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性表型，使其成為正?；蚪咏５?細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。維甲酸類化合物是被研究和臨床應(yīng)用最為廣 泛的分化誘導(dǎo)劑，其中全反式維甲酸(all-trans retinoid acid, ATRA)是第一個(gè) 成功應(yīng)用于白血病治療的誘導(dǎo)分化藥物，能夠特異性誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞性白 血病(APL)細(xì)胞分化成熟。1988年，上海瑞金醫(yī)院率先應(yīng)用ATRA治療24 例APL， 23例取得完全緩解(CR)。隨后進(jìn)行的一系列大樣本隨機(jī)對(duì)照臨床研 究進(jìn)一步驗(yàn)證了 ATRA治療APL的有效性，明顯降低了化療引發(fā)的出血相關(guān) 死亡率，提高了APL的CR率。
維甲酸對(duì)APL細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，使大多數(shù)患者臨床上得到緩解，但 隨著病人生存期的延長(zhǎng)，維甲酸使用過(guò)程中仍有一些問(wèn)題尚待研究解決，如治 療中維甲酸毒副作用，特別是高白細(xì)胞綜合征及維甲酸綜合征；緩解后單用維 甲酸往往數(shù)月內(nèi)復(fù)發(fā)；治療過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白(CRABP)高表達(dá)及 細(xì)胞色素P450酶促分解代謝使維甲酸治療失效等。因此，尋找高效、低毒的 新型化合物，有效促進(jìn)維甲酸的誘導(dǎo)分化作用，縮短治療進(jìn)程且改善白血病患 者的預(yù)后及解決相關(guān)耐藥問(wèn)題是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。
蛋白酶體抑制劑PS-341 (Bortezomib)，分子式為C19H25BN404，是美國(guó)千 年制藥公司開(kāi)發(fā)的一種二肽硼酸衍生物，商品名為Velcade(萬(wàn)珂)。PS-341作 為一種蛋白酶體抑制劑使用，可強(qiáng)烈而可逆地抑制蛋白酶體的功能，導(dǎo)致一些 本應(yīng)該被清除的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)大量堆積，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。目前，化合物 PS-341通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮的抗腫瘤作用備受矚目，己臨床應(yīng)用于治療復(fù) 發(fā)性、難治性的多發(fā)性骨髓瘤及部分非霍奇金淋巴瘤，對(duì)其它腫瘤的安全性、 有效性評(píng)價(jià)也正在進(jìn)行中。然而，PS-341能否促進(jìn)維甲酸類藥物對(duì)白血病細(xì)胞
的誘導(dǎo)分化作用，從而改善白血病患者的預(yù)后及解決相關(guān)耐藥問(wèn)題等尚未見(jiàn)報(bào) 道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供化合物PS-341在制備協(xié)同促進(jìn)維甲酸類藥物誘導(dǎo)分 化治療白血病的藥物中的應(yīng)用，PS-341 (Bortezomib)是蛋白酶體抑制劑，分 子式為C19H25BN404，化合物PS-341的濃度為lxlO-1G~lxl(r8M，維甲酸的濃 度為lxl{T9~lxl(T5M。
化合物PS-341優(yōu)選的濃度為0.5xl(T8M，維甲酸優(yōu)選的濃度為lxl(T6M。
化合物PS-341對(duì)白血病細(xì)胞無(wú)明顯的誘導(dǎo)分化作用，但它可加速、加強(qiáng) 維甲酸的誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化作用，表現(xiàn)為促進(jìn)維甲酸類藥物對(duì)白血病細(xì)胞的 增殖抑制作用，促進(jìn)白血病細(xì)胞表面分化特異性抗原CDllb的表達(dá)及增加分 葉核的細(xì)胞數(shù)目，縮短獲得CR時(shí)間，有助于減輕維甲酸的毒副作用及降低維 甲酸使用過(guò)程中耐藥問(wèn)題的發(fā)生。
化合物PS-341能夠明顯促進(jìn)維甲酸對(duì)白血病細(xì)胞增殖抑制作用，同時(shí)促 進(jìn)白血病細(xì)胞分化表面特異性抗原CDllb表達(dá)增加，細(xì)胞核質(zhì)比減小，分葉 型核細(xì)胞數(shù)目較維甲酸單用組明顯增多。化合物PS-341促進(jìn)維甲酸誘導(dǎo)白血 病細(xì)胞分化的作用具有明顯的濃度和時(shí)間依賴性。
化合物PS-341在制備協(xié)同促進(jìn)維甲酸在誘導(dǎo)分化治療白血病的藥物中的 應(yīng)用機(jī)制在于作為一種蛋白酶體抑制劑，化合物PS-341通過(guò)抑制蛋白酶體 活性，使維甲酸作用過(guò)程中被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解的維甲酸受體RARa降解 減少，從而提高白血病細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性。
總之，化合物PS-341對(duì)維甲酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化能力的增強(qiáng)作用為該 藥物開(kāi)辟了新的應(yīng)用領(lǐng)域，同時(shí)為進(jìn)一步提高白血病患者的療效，改善耐藥及 相關(guān)預(yù)后情況提供了可能性。


圖1是不同濃度的PS-341與維甲酸合用對(duì)HL60細(xì)胞的增殖抑制作用。
圖2是不同濃度的化合物PS-341與維甲酸合用對(duì)HL60細(xì)胞表面分化抗原 CDllb表達(dá)的影響。
圖3是化合物PS-341與維甲酸合用對(duì)HL60細(xì)胞內(nèi)維甲酸受體RARa蛋白 表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1:
用不同濃度的化合物PS-341 (1x10—1Q~lxlO—7M)分別與維甲酸(lxl(T8 lxl(T6M)共同處理HL60細(xì)胞株，120小時(shí)后，加入5 mg/ml的MTT溶液， 再孵育4小時(shí)，然后吸棄液體加入DMSO將甲瓚完全溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定其 在570nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物PS-341單獨(dú)作用于HL60細(xì)胞， 高濃度的PS-341 (lxl(T8~lxl(T7M)顯著抑制細(xì)胞增殖。但是低濃度的PS-341 (1X10"Q 1><10-8M)單獨(dú)作用，對(duì)HL60細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，但能明顯促進(jìn) 維甲酸的生長(zhǎng)抑制作用，且呈明顯的濃度依賴關(guān)系。結(jié)果參見(jiàn)圖l。
實(shí)施例2:
用不同濃度的化合物PS-341 (lxlO-1Q~lxl(T8M)分別與維甲酸(lxl(T6M) 合用處理HL60細(xì)胞株，在處理后72小時(shí)收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞表面分化特異 性抗原CDllb的表達(dá)。細(xì)胞用冰PBS漂洗3次后用3%BSA在室溫下封閉45 min，然后用CDllb-PE標(biāo)記的單克隆抗體避光孵育30min，經(jīng)PBS洗滌后用 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并用CellQuestPro軟件分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物PS-341 可明顯促進(jìn)維甲酸誘導(dǎo)分化表面特異性抗原CDllb表達(dá)，分化的細(xì)胞隨PS-341 濃度的增大、處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，而PS-341單用無(wú)明顯的誘導(dǎo)分化作用。 結(jié)果參見(jiàn)圖2。
實(shí)施例3:
用不同濃度的化合物PS-341 (lxl(T1() lxlO-8M)分別與維甲酸(lxl(r6M) 合用處理HL60細(xì)胞株，在處理后120小時(shí)收集細(xì)胞，用瑞氏-吉木薩染色法觀 察細(xì)胞核形態(tài)變化。維甲酸作用后，細(xì)胞核質(zhì)比明顯減小，并出現(xiàn)明顯的分葉 型核，而化合物PS-341與維甲酸合用組分葉型核的細(xì)胞數(shù)目較維甲酸單用組
明顯增多。
實(shí)施例4:
將化合物PS-341 (0.5xl(T8M)與維甲酸(lxl(T6M)共同處理HL60細(xì)胞 株，在處理后72小時(shí)收集細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞抽取蛋白質(zhì)，然后 用RARa抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)進(jìn)行Western blot免疫印跡。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，PS-341能部分抑制維甲酸誘導(dǎo)的維甲酸受體RARa的降解，從而增加 HL60細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性。結(jié)果參見(jiàn)圖3。
權(quán)利要求
1.PS-341在制備協(xié)同誘導(dǎo)分化治療白血病藥物中的應(yīng)用，所述PS-341是蛋白酶體抑制劑，該化合物的分子式為C19H25BN4O4，所述應(yīng)用中化合物PS-341的濃度為1×10-10～1×10-8M，維甲酸的濃度為1×10-9～1×10-5M。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征是所述應(yīng)用中化合物PS-341的 濃度為0.5xl(T8M，維甲酸的濃度為lxlO_6M。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征是所述化合物PS-341制備的藥 物與維甲酸類藥物一起應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供化合物PS-341在制備協(xié)同促進(jìn)維甲酸類藥物誘導(dǎo)分化治療白血病的藥物中的應(yīng)用，PS-341(Bortezomib)是蛋白酶體抑制劑，分子式為C₁₉H₂₅BN₄O₄，化合物PS-341的濃度為1×10^-10～1×10^-8M，維甲酸的濃度為1×10^-9～1×10^-5M?；衔颬S-341能夠明顯促進(jìn)維甲酸對(duì)白血病細(xì)胞增殖抑制作用，同時(shí)促進(jìn)白血病細(xì)胞分化表面特異性抗原CD11b表達(dá)增加，細(xì)胞核質(zhì)比減小，分葉型核細(xì)胞數(shù)目較維甲酸單用組明顯增多。化合物PS-341促進(jìn)維甲酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的作用具有明顯的濃度和時(shí)間依賴性，本發(fā)明為化合物PS-341開(kāi)辟了新的藥物應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101336925SQ200810062999
公開(kāi)日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者何俏軍, 偉 呂, 應(yīng)美丹, 方艷芬, 朱迪峰, 波 楊, 沈敬山, 羅沛華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)