一種煙草小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及煙草小孢子培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種煙草小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及煙草小孢子培養(yǎng)方法，具體涉及一種特 異性針對(duì)煙草小孢子培養(yǎng)的要求、誘導(dǎo)效率高、培養(yǎng)效果好的煙草小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及煙 草小孢子培養(yǎng)方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草在植物分類(lèi)學(xué)上屬于雙子葉植物綱、管花目、茄科、煙屬，為一年生或有限多 年生草本植物，其基部稍木質(zhì)化，花序頂生，圓錐狀，多花，蒴果卵狀或矩圓狀，長(zhǎng)約等于宿 存萼，夏秋季開(kāi)花結(jié)果。一般把煙屬分為3個(gè)亞屬，即黃花煙亞屬、普通煙亞屬和碧冬煙亞 屬，共計(jì)66個(gè)種。目前可直接利用的栽培種有普通煙草種和黃花煙草種，其它為野生種。
[0003] 煙草原產(chǎn)南美洲，大量考古發(fā)現(xiàn)證明，人類(lèi)尚處于原始社會(huì)時(shí)，美洲印第安人就開(kāi) 始種植煙草，16世紀(jì)中葉煙草傳入中國(guó)，并在中國(guó)迅速發(fā)展，在我國(guó)南北各省區(qū)廣為栽培， 在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有很高的價(jià)值?，F(xiàn)在我國(guó)烤煙種植面積、總產(chǎn)量和總銷(xiāo)售額均居于世 界首位，占據(jù)了全球1/3的卷煙市場(chǎng)、全球1/3的卷煙產(chǎn)量和全球1/3的煙葉產(chǎn)量，是名副其 實(shí)的煙草大國(guó)。煙草是我國(guó)稅收貢獻(xiàn)率最高的產(chǎn)業(yè)之一，連續(xù)20年貢獻(xiàn)近一成國(guó)家財(cái)政，煙 草業(yè)作為第一大經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)的地位難以動(dòng)搖，不僅可以推動(dòng)農(nóng)業(yè)發(fā)展，提高農(nóng)民生活質(zhì)量，而 且還能促進(jìn)就業(yè)，增加地方和國(guó)家財(cái)政收入，創(chuàng)造大量外匯。大力提高煙草育種技術(shù)、發(fā)展 煙草產(chǎn)業(yè)對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的意義。
[0004] 20世紀(jì)50年代初，我國(guó)的煙草品種選育工作就已經(jīng)開(kāi)始，先后選育出了紅花大金 元，云煙87、85、202和中煙98等烤煙品種，并大面積推廣種植，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)育成的烤煙品 種種植面積已占全國(guó)烤煙種植面積的大半。白肋煙品種的選育也取得了較為顯著的成效， 鄂煙1號(hào)等6個(gè)白肋煙品種已通過(guò)全國(guó)審定，并逐步在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，改變了我國(guó)白肋煙 種植品種單一的問(wèn)題。
[0005] 然而，我國(guó)在煙草育種研究方面和生產(chǎn)應(yīng)用中仍存在基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱、優(yōu)質(zhì)高 香氣低危害品種缺乏、地方特色品種少等諸多嚴(yán)峻問(wèn)題。常規(guī)煙草育種周期長(zhǎng)，盲目性大， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足煙葉生產(chǎn)的需要。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，單倍體育種技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于煙 草育種研究，煙草小孢子培養(yǎng)是單倍體技術(shù)最重要的操作手段。通過(guò)對(duì)煙草小孢子離體培 養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體或雙單倍體植株從而迅速獲得煙草純合系的煙草小孢子培養(yǎng)育種技術(shù)不但 可以縮短煙草的育種周期、加快煙草的育種進(jìn)程，而且所獲得的純合系很有可能結(jié)合雙親 的優(yōu)點(diǎn)，獲得更加優(yōu)良的新種質(zhì)，因而煙草小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究具有十分重要的理論意 義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 煙草小孢子培養(yǎng)技術(shù)雖取得很大的成功，但在理論和應(yīng)用上仍存在一些問(wèn)題。目 前煙草小孢子胚狀體或愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率還比較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到小孢子培養(yǎng)育種 的產(chǎn)業(yè)化要求。因此，加快煙草小孢子培養(yǎng)機(jī)理研究，開(kāi)發(fā)出小孢子愈傷誘導(dǎo)率和分化率更 高的培養(yǎng)基和小孢子培養(yǎng)方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明是針對(duì)目前煙草小孢子培養(yǎng)中小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率和分化低的現(xiàn)狀，提 供了一種煙草小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及煙草小孢子培養(yǎng)方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的： 一種煙草小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于按每升蒸餾水中由以下物質(zhì)配制而成:KN03 900~1100mg/L，NH4N〇3 900~1100mg/L，KH2P〇4 270~330mg/L，Ca(N〇3)2_4H20 330~ 360mg/L，KCl 60~70mg/L，Na2-EDTA 72~78mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 54~58mg/L，MnS〇4.4H20 4.0 ~5.0mg/L，ZnS〇4.7H2〇2.1~2.3mg/L，H3B〇3 2.3~2.7mg/L，KIl.l~1.3mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.02~0.03mg/L，CoC1.6H2〇 0.02~0.03mg/L，NaMo〇4.2H2〇 0.2~0.3mg/L，AgN03 18~ 2011^/1^，肌醇90~11011^/1^，維生素1310.09~0.1111^/1^，維生素136 0.09~0.1111^/1^，煙酸 0.45~0.55mg/L，維生素 C 20~24ymol/L，胰島素 2.3~2.7mg/L，葉酸 0.18~0.22mg/L， 甘氨酸1.8~2.2mg/L，脯氨酸0.3~0.4mg/L，絲氨酸0.55~0.65mg/L，甲基磺酸乙酯 0.45~0.55mg/L，蔗糖 18~22g/L，果糖 15~20g/L，椰乳23~27g/L，瓊脂 7~8g/L;2,4-D 0 · 5~0 · 7mg/L，NAA 0 · 45~0 · 55mg/L，復(fù)酞核酸0 · 25~0 · 35mg/L，活性炭 0 · 25~0 · 35g/L， 煙草提取液35~45g/L，甘露醇25~35g/L，水解蛋白0.25~0.35g/L。
[0009] 所述的煙草小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于按每升蒸餾水中含有以下物質(zhì)配制的 最佳含量為：KN〇3 1000mg/L，NH4N03 1000mg/L，KH2P〇4 300mg/L，Ca(N〇3)2.4H2〇 345mg/L， KC1 65mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，F(xiàn)eS〇4_7H20 56mg/L，MnS〇4_4H20 4.5mg/L，ZnS〇4_7H20 2.2mg/L，H3B03 2.5mg/L，KI 1.2mg/L，CuS〇4.5H20 0.025mg/L，CoC1.6H2〇 0.025mg/L， NaMo〇4.2H2〇 0.25mg/L，AgN〇3 19mg/L，肌醇 100mg/L，維生素 B1 0.1mg/L，維生素 B6 0.1mg/L，煙酸 0.5mg/L，維生素 C 22ymol/L，胰島素 2.5mg/L，葉酸 0.2mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸0.35mg/L，絲氨酸0.6mg/L，甲基磺酸乙酯0.5mg/L，鹿糖20g/L，果糖 17.5g/L，椰乳25g/L，瓊脂 7.5g/L;2,4-D 0.6mg/L，NAA 0.5mg/L，復(fù)酞核酸0.3mg/L，活性 炭0.3g/L，煙草提取液40g/L，甘露醇30g/L，水解蛋白0.3g/L。
[0010] 所述的培養(yǎng)基配方的配制pH值為:5.4~5.8，最佳配制pH值為5.6。
[0011] -種煙草小孢子培養(yǎng)方法，其特征在于按如下步驟操作： (1) 花藥取材與低溫預(yù)處理 在大田常規(guī)栽培的煙草正常開(kāi)花季節(jié)，上午9點(diǎn)~11點(diǎn)采集生長(zhǎng)正常的花藥處于單核 后期或二核早期的煙草植株的花蕾，將采集的花蕾分別裝入自封袋中，置于4°C冰箱低溫預(yù) 處理2d; (2) 培養(yǎng)基的滅菌 將權(quán)利要求1、2和3所述的培養(yǎng)基配制好后分裝于200ml的三角瓶中，每瓶盛40ml~ 60ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa高壓蒸汽條件下滅菌20min，自然冷 卻凝固； (3) 消毒與花粉提取 取出低溫預(yù)冷處理后的花蕾，剝出花藥裝入干凈的燒杯，然后用75%的酒精滅菌30s， 0.1%升汞+2滴吐溫-80消毒8min，無(wú)菌水沖洗4~6次后碾碎花蕾，無(wú)菌環(huán)境下過(guò)濾除去花藥 組織碎片，然后將濾液分裝于已滅菌的離心管，蓋上離心管蓋，封口膜密封，轉(zhuǎn)入離心機(jī)內(nèi) 離心，使得花粉沉淀下來(lái)； (4 )花粉接種與變溫誘導(dǎo) 將離心管轉(zhuǎn)入無(wú)菌環(huán)境下，倒掉上清，將花粉沉淀取出，接種于權(quán)利要求1、2和3所述的 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，然后將接種花粉后的培養(yǎng)基置于溫度23~25°C的環(huán)境下暗培養(yǎng)1.5~2.5d， 然后轉(zhuǎn)入37~39 °C高溫、黑暗條件下熱激處理2~3d，然后轉(zhuǎn)入溫度為26~28°C、濕度為75% ~80%黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出花粉愈傷； (5) 愈傷分化與繼代培養(yǎng) 待花粉愈傷長(zhǎng)至直徑2cm后，轉(zhuǎn)接入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，愈傷逐漸分化出綠 苗，將苗長(zhǎng)高于5cm的綠苗帶根切下，轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基上繼代壯苗； (6) 煉苗與移栽 待試管苗長(zhǎng)到3~5葉齡時(shí)，將三角瓶封口膜打開(kāi)煉苗，7~10d后將試管苗從三角瓶中 取出，將根部清洗干凈，移栽入溫室內(nèi)，遮蔭處理一周后常規(guī)大田栽培。
[0012] 所述步驟（1)中采集花蕾大小合適的花蕾方法為:采集生長(zhǎng)正常的花冠與花萼等 長(zhǎng)或花冠略長(zhǎng)于花萼的花蕾。
[0013] 所述步驟(3)中過(guò)濾除去組織碎片的方法為：用滅菌過(guò)的孔徑為60-80目的網(wǎng)篩勺 過(guò)濾，棄濾渣;所述獲得花粉沉淀的離心參數(shù)設(shè)置為:離心機(jī)轉(zhuǎn)速為10000~11000轉(zhuǎn)/分，離 心時(shí)間為20分鐘。
[0014] 所述步驟(5)中分化培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度25~27°C、濕度為70%~80%、光照強(qiáng) 度2000~25001UX、光周期12h光/12h暗；所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度27~29°C、濕度 為75%~80%、光照強(qiáng)度2500~30001ux、光周期12h光/12h暗。
[0015]所述步驟（5)中繼代培養(yǎng)基的配方為:KN〇3 100mg/L，NH4N03 85mg/L，CaCl2_2H20 8.8mg/L，MgS〇4.7H20 7.5mg/L，KH2P〇4 3.5mg/L，MnS〇4.4H20 0.5mg/L，H3B03 0.2mg/L，F(xiàn)eS〇4 ?7H20 27.8mg/L，Na2-EDTA 37.3mg/L，蔗糖 10g/L，瓊脂 6.5g/L，多效唑 1.5mg/L，pH值 5.6〇
[0016] 本發(fā)明所述的煙草小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及煙草小孢子培養(yǎng)方法特異性針對(duì)煙草小 孢子培養(yǎng)的要求，誘導(dǎo)效率高，培養(yǎng)效果好，大大加快了煙草小孢子培養(yǎng)育種進(jìn)程。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，而非限制本發(fā)明。
[0018] 實(shí)施例1 (1) 花藥取材與低溫預(yù)處理 在大田常規(guī)栽培的煙草正常開(kāi)花季節(jié)，上午9點(diǎn)~11點(diǎn)采集生長(zhǎng)正常的、花冠與花萼等 長(zhǎng)或花冠略長(zhǎng)于花萼的花蕾，此時(shí)花蕾中花藥處于單核后期或二核早期，將采集的花蕾分 別裝入自封袋中，置于4°C冰箱低溫預(yù)處理2d; (2) 培養(yǎng)基的滅菌 按照最佳配方：KN〇3 1000mg/L，NH4N03 1000mg/L，KH2P〇4 300mg/L，Ca(N〇3)2.4H20 345mg/L，KCl 65mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 56mg/L，MnS〇4.4H20 4.5mg/L，ZnS〇4· 7H20 2.2mg/L，H3B03 2.5mg/L，KI 1.2mg/L，CuS〇4.5H20 0.025mg/L，CoC1.6H2〇 0.025mg/L， NaMo〇4.2H2〇 0.25mg/L，AgN〇3 19mg/L，肌醇 100mg/L，維生素 B1 0.1mg/L，維生素 B6 O.lmg/L，煙酸 0.5mg/L，維生素 C 22ymol/L，胰島素 2.5mg/L，葉酸 0.2mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸0.35mg/L，絲氨酸0.6mg/L，甲基磺酸乙酯0.5mg/L，鹿糖20g/L，果糖 17.5g/L，椰