)基因的合成及其在畢赤酵母中的表達(dá)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為耐熱木聚糖酶(Xyl11M)基因的合成及其在畢赤酵母中的表達(dá)，涉及一種來源于嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)的耐熱β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(Xyl11M)在畢赤酵母中表達(dá)、活性測定及酶學(xué)性質(zhì)分析方法。其基因命名為xyl11M，它的核苷酸序列為SEQ ID NO:1，編碼的蛋白質(zhì)為Xyl11M，氨基酸序列為SEQ ID NO:2。所制備的重組酶的活性為157U/mL；其最適反應(yīng)溫度為70℃，70℃下保溫60min，殘余酶活為98％，表明該酶熱穩(wěn)定性非常好；其最適pH為6.0，在pH 5.0～8.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定；金屬離子對該酶活性影響較小。作為一種耐熱型的酶制劑，該酶具有較大的工業(yè)化應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價值。
【專利說明】耐熱木聚糖酶（Xyl11M)基因的合成及其在畢赤酵母中的表 達(dá)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種耐熱木聚糖酶（XylllM)基因的人工合成及其在畢赤酵母中的表 達(dá)，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)切 β-1，4-D-木聚糖酶（endo-β _1，4-D-xylanase，EC 3. 2. 1. 8)簡稱木聚糖 酶。它從木聚糖主鏈的內(nèi)部隨機(jī)切割β _1，4糖苷鍵，將木聚糖降解成寡聚木糖、木二糖和 少量木糖，是有效利用半纖維素類資源不可缺少的生物催化劑?；诿复呋蛞患壗Y(jié)構(gòu)的 同源性比對和疏水簇分析，絕大多數(shù)木聚糖酶歸屬糖苷水解酶10家族和11家族。與其它 家族不同，11家族只含木聚糖酶，具有底物特異性高、分子量低（<30kDa)和堿性等電點等 特征，空間結(jié)構(gòu)主要由兩個β-折疊片和一個α-螺旋所構(gòu)成的單一催化域，呈右手半握形 狀。木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織等工業(yè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。由于紙漿漂白、飼 料制粒等工藝均需較高溫度，因此耐熱木聚糖酶的研究和開發(fā)受到了眾多研究者的青睞。
[0003] 目前已發(fā)現(xiàn)了許多能產(chǎn)11家族耐熱木聚糖酶的微生物，其中許多耐熱木聚糖酶 基因已被克隆并表達(dá)在合適的宿主中。根據(jù)密碼子的偏好性，宿主細(xì)胞能夠以不同的速度 合成蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)的基因中有些密碼子對應(yīng)的tRNA含量少（即屬于稀有密碼子），所 以合成量較少，宿主以此來控制蛋白質(zhì)的合成速度。因此按照密碼子的偏好性，對外源蛋白 編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化可以有效提高外源蛋白的表達(dá)量。畢赤酵母（Pichia pastoris) 表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的真核表達(dá)系統(tǒng)，其不僅具有大腸桿菌繁殖快、易于培養(yǎng)、遺傳 穩(wěn)定、操作簡單和易于工業(yè)化生產(chǎn)等原核生物的特點，還具有真核生物基因表達(dá)調(diào)控和蛋 白修飾功能，如糖基化，蛋白磷酸化等，避免了產(chǎn)物形成包涵體，活性降低等問題?；谝陨?原因，畢赤酵母是表達(dá)木聚糖酶較好的系統(tǒng)之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種來源于嗜熱裂孢菌的耐熱β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶 (Xylll M)的異源表達(dá)、活性測定及酶學(xué)性質(zhì)分析的方法，為該酶的高效表達(dá)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn) 奠定理論基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：將源自嗜熱裂孢菌的耐熱β -1，4-內(nèi)切木聚糖酶xylll催化 域根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行序列優(yōu)化，優(yōu)化后基因命名為xylllM，其核苷酸序列為 SEQ ID N0:1，編碼的蛋白質(zhì)為XylllM，其氨基酸序列為SEQ ID N0:2;將該優(yōu)化基因在畢赤 酵母（Pichia paSt〇riS)GS115中進(jìn)行分泌表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性測定及酶學(xué)性質(zhì)分 析。
[0006] 所述的xylll是一種來源于嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca NTU22)的耐熱木聚 糖酶基因（GenBank登錄號AY795559)，它的熱穩(wěn)定性非常好，具有適合于工業(yè)應(yīng)用的理想 特性。
[0007] 所述的重組木聚糖酶的活性測定方法：
[0008] 于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 6. 0、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質(zhì)量 濃度為〇. 5%的樺木木聚糖溶液2. 4mL，50°C預(yù)熱lOmin，在A管中加入0. ImL適當(dāng)稀釋的酶 液，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)15min ;立即各加入2. 5mL 3, 5-二硝基水楊酸（DNS)試劑，在B管中再補 加0. ImL滅活的酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B 管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖（以木糖計）含 量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μ mol還原糖 所需的酶量定義為1個木聚糖酶活性單位（U)。
[0009] 所述的xylllM的異源表達(dá)、活性測定及分析：
[0010] (1)重組質(zhì)粒pUCm-T-XylllM的構(gòu)建：對照畢赤酵母密碼子偏好性表對來源于嗜 熱裂孢菌的耐熱木聚糖酶催化域基因中的稀有密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并在其催化域基因兩端分 別加入EcoR I、Not I位點，該基因命名為xylllM，人工合成后克隆至pUCm-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 E. coli JM109,藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-xylllM。
[0011] (2)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-xylIIm進(jìn)行EcoR I和 Not I雙酶切，割膠回收產(chǎn)物與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選鑒定后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-xyl IIm(圖1)。
[0012] (3)GS115/xylllM重組子的構(gòu)建、表達(dá)及酶活性的測定：測序正確的 pPIC9K-xylllM質(zhì)粒經(jīng)Sal I線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的 重組子GS115/xylllM ;按照手冊上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；用改進(jìn)的DNS法測定重組木 聚糖酶活性。
[0013] 所述的重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析：
[0014] (1)酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性：在不同溫度下（50?80°C )測定酶活性，以酶 活力最高者為100%;將酶液置于不同溫度下保溫〇?60min，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘余酶活性， 以未處理酶液（Omin)的酶活性為100%。當(dāng)殘余酶活達(dá)到85%以上，即定義為穩(wěn)定。
[0015] (2)酶的最適pH及pH穩(wěn)定性：用不同pH值（pH 3. 0?9. 0)、0· lmol/L朽1檬 酸-Na2HPO4緩沖液配制的0. 5%木聚糖溶液，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定重組木聚糖酶的活性，以酶活 力最高者為100%。將酶液分別置于不同pH值緩沖液（pH 3. 0?8. 0檸檬酸-Na2HPO4和 pH 8. 5-9. OTris-HCl)中，在40°C保溫60min，測定殘余酶活性，以未處理酶液的酶活性為 100%。當(dāng)殘余酶活達(dá)到85%以上，即定義為穩(wěn)定。
[0016] (3)金屬離子對酶活性的影響：將酶液與不同金屬離子或EDTA溶液（終濃度為 2. 0 mmol/L)混合后于40°C保溫Ih測定殘余酶活性。以未加金屬離子和EDTA的酶活性計 為 100%。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種來源于嗜熱裂孢菌的耐熱β -1，4-內(nèi)切木 聚糖酶（XylllM)的異源表達(dá)、活性測定及酶學(xué)性質(zhì)分析的方法，其重組酶最適反應(yīng)溫度為 70°C，在70°C下保溫60min，殘余酶活為98%，表明該酶熱穩(wěn)定性非常好，具有適合于工業(yè) 應(yīng)用的理想特性，本發(fā)明為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化應(yīng)用潛力 及經(jīng)濟(jì)價值，也為其它耐熱木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖I :重組質(zhì)粒pPIC9K-xylllM的構(gòu)建示意圖

【具體實施方式】
[0019] 以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0020] 實施例1重組質(zhì)粒pUCm-T-xyl I Im的構(gòu)建
[0021] 為實現(xiàn)來源于嗜熱裂孢菌的耐熱木聚糖酶基因 xylll在畢赤酵母中的高效表達(dá)， 對xylll催化域基因序列（570bp)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其密碼子的偏好性與畢赤酵母有較大差 異。遂對照畢赤酵母密碼子偏好性表對xyl 11催化域基因中的稀有密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并在 其催化域基因兩端分別加入EcoR I、Not I位點，該基因命名為xylllM，人工合成后克隆至 pUCm-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli JM109,藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒 pUCm-T_xylllM〇
[0022] 實施例2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0023] 將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-xyl IIm進(jìn)行EcoR I和Not I雙酶切，割膠回收產(chǎn) 物與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選鑒 定后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-xyl 11M。
[0024] 實施例3GS115/xylllM重組子的構(gòu)建、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的測定：pPIC9K-xylll M質(zhì) 粒經(jīng)Sal I線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子 GS115/xylllM。該工程菌用1.0%甲醇誘導(dǎo)72h。離心后上清液為重組木聚糖酶粗酶液，DNS 法測得粗酶液中重組木聚糖酶活性達(dá)157U/mL。該酶的最適反應(yīng)溫度為70°C，在70°C處理 60min后，殘留酶活性為98%;其最適pH為6. 0,在pH 5. 0?8. 0的范圍內(nèi)較穩(wěn)定；金屬離 子和EDTA對其影響較小。
【權(quán)利要求】
1. 一種來源于嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca)的耐熱P-1,4-內(nèi)切木聚糖酶 (XylllM)的優(yōu)化基因（xylllM)，其對應(yīng)的核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列分別為：SEQ ID N0:1和 SEQ ID N0:2。 2. XylllM的異源表達(dá)、活性及酶學(xué)性質(zhì)的測定： (1) 重組質(zhì)粒pUCm-T-XylllM的構(gòu)建：參照畢赤酵母密碼子偏好性表對來源于嗜熱裂 孢菌的耐熱木聚糖酶催化域基因中的稀有密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并在其催化域基因兩端分別 加入EcoR I、Not I位點，該基因命名為xylllM，人工合成后克隆至pUCm-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 E. coli JM109,藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-xylllM ; (2) 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：將上述得到的重組質(zhì)粒pUCm-T-xylllM進(jìn)行EcoR I和Not I雙酶切，割膠回收產(chǎn)物與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受 態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選鑒定后送上海生工測序，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-xylllM ; (3) GS115/xylllM重組子的構(gòu)建、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的測定：pPIC9K-xylllM質(zhì)粒經(jīng)Sal I線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ xylllM ;該工程菌用1. 0%甲醇誘導(dǎo)72h，離心后上清液為重組木聚糖酶粗酶液，DNS法測得 粗酶液中重組木聚糖酶活性達(dá)157U/mL ;該酶的最適反應(yīng)溫度為70°C，在70°C處理60min 后，殘留酶活性為98% ;其最適pH為6. 0,在pH 5. 0?8. 0的范圍內(nèi)較穩(wěn)定；金屬離子和 EDTA對其影響較小。
【文檔編號】C12N15/81GK104388451SQ201410758941
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】鄔敏辰, 姚瑤, 吳芹, 李劍芳, 李興倩, 張鵬 申請人:江南大學(xué)