專(zhuān)利名稱(chēng)：海藻糖生物合成基因在植物中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海藻糖生物合成基因和耐旱性在植物中的表達(dá)。特別是，本發(fā)明涉及高等植物中海藻糖積累和耐旱性的問(wèn)題，和構(gòu)建這種性狀的新方法。也涉及對(duì)收獲植物的改進(jìn)的貯存性質(zhì)、果實(shí)和花的延長(zhǎng)的保存期以及轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定的需要。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了海藻糖生物合成基因在植物中的表達(dá)，優(yōu)選地在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下，這賦予耐旱性而沒(méi)有與不受控制的海藻糖積累有關(guān)的有害作用。
海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-[1,1]-α-D-吡喃葡糖苷)是在低等生物如細(xì)菌、真菌和昆蟲(chóng)中常見(jiàn)的二糖，它常常在靜止期或穩(wěn)定期細(xì)胞和器官中積累。海藻糖生物合成需要兩種酶活性海藻糖-6-磷酸合酶催化UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸縮合為海藻糖-6-磷酸，海藻糖-6-磷酸磷酸酶使海藻糖-6-磷酸磷酸化，成為海藻糖。
盡管海藻糖能作為還原碳的貯存形式，但它可作為對(duì)抗多種非生物協(xié)迫(尤其是熱和干燥)的有害作用的保護(hù)劑起更重要的作用。無(wú)論在體內(nèi)還是在體外，海藻糖積累都與保護(hù)生物大分子(特別是膜和蛋白質(zhì))免于脫水、極端溫度和滲透壓休克有關(guān)。發(fā)酵產(chǎn)生的海藻糖在商業(yè)上用于酶的保存和脫水及加工食品的穩(wěn)定。
長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)識(shí)到，海藻糖可以作為共生微生物的產(chǎn)物存在于植物中，而通常認(rèn)為脊椎動(dòng)物和高等植物不能合成海藻糖。高等植物家族中特異海藻糖異化酶(海藻糖酶)的普遍存在是一種生物學(xué)奇觀(guān)，主要?dú)w因于存在從共生或附生植物的微生物和真菌來(lái)源進(jìn)入植物細(xì)胞的外源海藻糖。重要的例外是粗略地歸類(lèi)為“更蘇植物”種類(lèi)的低等植物和被子植物，它們能在特別長(zhǎng)時(shí)間的干燥下存活。這些植物，包括卷柏屬(Selaginella)和Myrothamnus的種，能在發(fā)生干旱之后積累高達(dá)10％干重的海藻糖。
由于海藻糖與耐旱性的相關(guān)性和微生物海藻糖發(fā)酵的歷史上不佳的經(jīng)濟(jì)狀況，也已經(jīng)設(shè)法改造了轉(zhuǎn)基因植物來(lái)積累這種二糖。雖然已經(jīng)成功地獲得了這些植物(使用細(xì)菌和酵母海藻糖合成基因)，但顯然植物細(xì)胞溶膠中的組成型海藻糖產(chǎn)生伴隨著明顯的有害作用。當(dāng)在根組織中或在早期發(fā)育階段發(fā)生海藻糖表達(dá)時(shí)，這些表型(矮化的生長(zhǎng)、異常的葉、未發(fā)育的根)是特別嚴(yán)重的，因?yàn)槭褂镁G色組織特異性植物啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)海藻糖產(chǎn)生基因改進(jìn)了某些但不是全部這些作用。
由這些事實(shí)，能使海藻糖積累并且導(dǎo)致耐旱性而對(duì)植物無(wú)有害作用的海藻糖生物合成基因的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)將是十分有實(shí)際用途的，并且有經(jīng)濟(jì)效益。
因此本發(fā)明涉及海藻糖生物合成基因和耐旱性在植物中的表達(dá)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了海藻糖生物合成基因在植物中表達(dá)，該基因優(yōu)選地在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下在植物中的表達(dá)，其導(dǎo)致耐旱性而沒(méi)有與失控的海藻糖積累有關(guān)的有害作用。一種優(yōu)選的啟動(dòng)子是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如煙草PR-1a啟動(dòng)子，它能被化學(xué)誘導(dǎo)物的葉施用而激活。
另外，本發(fā)明描述了在不同細(xì)胞區(qū)室中表達(dá)的海藻糖生物合成基因的表達(dá)。在第一個(gè)實(shí)施方案中，海藻糖生物合成基因在植物胞質(zhì)中表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，海藻糖生物合成基因從植物核基因組中表達(dá)，而由其編碼的海藻糖生物合成酶例如通過(guò)使用質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽被導(dǎo)向到質(zhì)體中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，海藻糖生物合成基因從植物質(zhì)體基因組中表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將含有海藻糖生物合成基因的載體轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中，該海藻糖生物合成基因與一個(gè)能引導(dǎo)海藻糖生物合成基因在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子相融合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將含有與海藻糖生物合成基因融合的噬菌體啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中。使得到的植物系與一種轉(zhuǎn)基因系雜交，該轉(zhuǎn)基因系含有噬菌體RNA酶的核編碼區(qū)，其添加有質(zhì)體導(dǎo)向序列并與植物啟動(dòng)子(如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子)有效連接。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，能引導(dǎo)海藻糖生物合成基因在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子是由質(zhì)體中正常存在的RNA聚合酶如核編碼聚合酶或質(zhì)體編碼聚合酶所轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括但不限于例如clpP啟動(dòng)子、16S r-RNA基因啟動(dòng)子、psbA啟動(dòng)子或rbcL啟動(dòng)子。
在本發(fā)明中，優(yōu)選使用大腸桿菌的海藻糖生物合成基因，但也可使用來(lái)源于其他生物包括但不限于酵母、其他低等生物或高等生物的基因。例如，大腸桿菌OtsA和/或大腸桿菌OtsB基因；酵母TPS1、TSL1或TSL2基因(美國(guó)專(zhuān)利5,792,921)、擬南芥(Arabidopsis)海藻糖合酶基因(TPS1，保藏號(hào)Y08568,Blazquez等人，植物雜志(PlantJ)(1998)13:685-9)、擬南芥海藻糖磷酸磷酸酶(Vogel等人，植物雜志(1998)13:673-83)或編碼雙功能海藻糖磷酸合酶/磷酸酶的鱗葉卷柏(Selaginella lepidophylla)基因(保藏號(hào)U96736)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼海藻糖磷酸合酶的核苷酸序列和編碼海藻糖磷酸磷酸酶的核苷酸序列都在植物中表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼海藻糖磷酸合酶的核苷酸序列在植物中表達(dá)，或者編碼海藻糖磷酸磷酸酶的核苷酸序列在植物中表達(dá)。本發(fā)明也涉及從操縱子樣多順?lè)醋踊蛑袉螁?dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的兩種海藻糖生物合成基因從質(zhì)體基因組中的表達(dá)。
本發(fā)明也公開(kāi)了來(lái)源于重要經(jīng)濟(jì)作物尤其是來(lái)源于玉米的編碼海藻糖生物合成酶的新核苷酸序列。這些核苷酸序列被轉(zhuǎn)化到植物中提高其海藻糖含量及其耐旱性。本發(fā)明也提供使用這些核苷酸序列作為標(biāo)記通過(guò)常規(guī)培育技術(shù)產(chǎn)生具有提高的逆境抗性的植物系的方法。
本發(fā)明因此提供一種表達(dá)編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列的植物，例如一種含有編碼海藻糖-6-磷酸合酶和/或海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列(如大腸桿菌OtsA和/或大腸桿菌OtsB基因)的植物。這些核苷酸序列例如穩(wěn)定地整合于核或質(zhì)體DNA中，優(yōu)選地處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)的控制之下，或者處于能引導(dǎo)海藻糖生物合成基因在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子(如反式激活蛋白調(diào)節(jié)啟動(dòng)子)的控制之下，其中相應(yīng)的反式激活蛋白處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制之下；也包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子中。
本發(fā)明特別提供根據(jù)本發(fā)明的植物，在其基因組中含有包含編碼海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列的第一種異源表達(dá)盒或其部分，所述核苷酸序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下，或者處于能引導(dǎo)該核苷酸序列在該植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下，如反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，其中相應(yīng)的反式激活蛋白優(yōu)選地處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制之下，該植物中還含有包含編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列的第二種異源表達(dá)盒或其部分，所述核苷酸序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下，或者處于能引導(dǎo)該核苷酸序列在該植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下，如反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，其中相應(yīng)的反式激活蛋白優(yōu)選地處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的控制之下。本發(fā)明也包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種植物表達(dá)盒，其含有編碼海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列，優(yōu)選地所述核苷酸序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下；一種含有這種植物可表達(dá)盒的載體；和一種用這種載體轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種植物表達(dá)盒，其含有編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列，優(yōu)選地所述核苷酸序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下；一種含有這種植物可表達(dá)盒的載體；和一種用這種載體轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種植物表達(dá)盒，其含有編碼海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列，優(yōu)選地該核苷酸序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下，還含有編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列，優(yōu)選地該核苷酸序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下；一種含有這種植物可表達(dá)盒的載體；和一種用這種載體轉(zhuǎn)化的植物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列在反式激活蛋白調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制下在質(zhì)體中的表達(dá)，并且反式激活蛋白基因位于核DNA中，受植物啟動(dòng)子的控制。例如，質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體一般用噬菌體啟動(dòng)子如噬菌體T7基因10啟動(dòng)子構(gòu)建，其轉(zhuǎn)錄激活依賴(lài)于RNA聚合酶如噬菌體T7 RNA聚合酶。得到的植物系與轉(zhuǎn)基因系雜交，該轉(zhuǎn)基因系含有噬菌體RNA聚合酶的核編碼區(qū)，其中添加了葉綠體導(dǎo)向序列，并與植物啟動(dòng)子有效連接，所述植物啟動(dòng)子優(yōu)選地為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選地化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如煙草PR-1a啟動(dòng)子。
本發(fā)明因此另外提供一種植物，其含有一種異源核表達(dá)盒或其部分，其優(yōu)選地含有一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，更優(yōu)選地含有一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如煙草PR-1a啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼反式激活蛋白(優(yōu)選的是不在植物中天然存在的反式激活蛋白，優(yōu)選地RNA聚合酶或DNA結(jié)合蛋白，如T7 RNA聚合酶)的DNA序列有效連接，該反式激活蛋白任選地與質(zhì)體導(dǎo)向序列如葉綠體導(dǎo)向序列(例如，上述可在植物中表達(dá)的表達(dá)盒)融合；和一種異源質(zhì)體表達(dá)盒或其部分，其含有由反式激活蛋白調(diào)節(jié)并與編碼至少一種海藻糖生物合成酶(如海藻糖-6-磷酸合酶)的核苷酸序列有效連接的反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，當(dāng)反式激活蛋白是T7RNA聚合酶時(shí)為T(mén)7啟動(dòng)子)；還包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子或其他容器中。
此外本發(fā)明提供一種植物，其含有一種異源核表達(dá)盒或其部分，其優(yōu)選地含有一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，更優(yōu)選地含有一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如煙草PR-1a啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼反式激活蛋白(優(yōu)選的是不在植物中天然存在的反式激活蛋白，優(yōu)選地RNA聚合酶或DNA結(jié)合蛋白，如T7 RNA聚合酶)的核苷酸序列有效連接，該反式激活蛋白任選地與質(zhì)體導(dǎo)向序列如葉綠體導(dǎo)向序列(例如，上述可在植物中表達(dá)的表達(dá)盒)融合；和一種異源質(zhì)體表達(dá)盒或其部分，其含有由反式激活蛋白調(diào)節(jié)并與編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列有效連接的反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，當(dāng)反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶時(shí)為T(mén)7啟動(dòng)子)；還包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子或其他容器中。
此外本發(fā)明提供一種植物，其含有一種異源核表達(dá)盒或其部分，其優(yōu)選地含有一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，更優(yōu)選地含有一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如煙草PR-1a啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼反式激活蛋白(優(yōu)選的是不在植物中天然存在的反式激活蛋白，優(yōu)選地RNA聚合酶或DNA結(jié)合蛋白，如T7 RNA聚合酶)的DNA序列有效連接，該反式激活蛋白任選地與質(zhì)體導(dǎo)向序列如葉綠體導(dǎo)向序列(例如，上述可在植物中表達(dá)的表達(dá)盒)融合；和一種異源質(zhì)體表達(dá)盒或其部分，其含有由反式激活蛋白調(diào)節(jié)并與編碼海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列有效連接的反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，當(dāng)反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶時(shí)為T(mén)7啟動(dòng)子)，和由反式激活蛋白調(diào)節(jié)并與編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列有效連接的反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，當(dāng)反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶時(shí)為T(mén)7啟動(dòng)子)；還包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子或其他容器中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列在一個(gè)啟動(dòng)子控制下在質(zhì)體中的表達(dá)，該啟動(dòng)子由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶(如核編碼的聚合酶或質(zhì)體編碼的聚合酶)所轉(zhuǎn)錄。這些啟動(dòng)子包括但不限于clpP啟動(dòng)子、16S r-RNA基因啟動(dòng)子、psbA啟動(dòng)子或rbcL啟動(dòng)子。
本發(fā)明因此另外提供一種植物，其含有一種異源核表達(dá)盒或其部分，其優(yōu)選地含有一種能使編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶(如核編碼的聚合酶或質(zhì)體編碼的聚合酶)所轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，它與至少一種編碼海藻糖生物合成酶如海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列有效連接；還包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子或其他容器中。
此外本發(fā)明提供一種植物，其含有一種異源核表達(dá)盒或其部分，其優(yōu)選地含有一種能使編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶(如核編碼的聚合酶或質(zhì)體編碼的聚合酶)所轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，它與編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列有效連接；還包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子或其他容器中。
此外本發(fā)明提供
一種植物，其含有一種異源核表達(dá)盒或其部分，其優(yōu)選地含有一種能使編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶(如核編碼的聚合酶或質(zhì)體編碼的聚合酶)所轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，它與編碼海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列有效連接，以及由由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶(如核編碼的聚合酶或質(zhì)體編碼的聚合酶)所轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，它與編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列有效連接；還包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子或其他容器中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括操縱子樣多順?lè)醋踊蛑袃煞N或多種基因在植物質(zhì)體中由單一啟動(dòng)子開(kāi)始的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，操縱子樣多順?lè)醋踊虬瑑煞N或多種基因，例如包含編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列的基因，其與能引導(dǎo)操縱子樣多順?lè)醋踊蛟谫|(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接，并將該多順?lè)醋踊虿迦胭|(zhì)體基因組中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸粋€(gè)位于操縱子樣多順?lè)醋踊蛑袃蓚€(gè)基因之間的間插DNA序列，優(yōu)選的其是在質(zhì)體基因組中不存在的DNA序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，間插DNA序列來(lái)源于非真核基因的5’非翻譯(UTR)區(qū)，優(yōu)選地病毒5’UTR，優(yōu)選地來(lái)源于噬菌體如T7、T3或SP6噬菌體的5’UTR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾該DNA序列從而防止形成能阻止或抑制位于間插DNA序列直接下游的基因翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，位于間插DNA序列直接下游的基因的表達(dá)-優(yōu)選地翻譯-得到增強(qiáng)。
此外，本發(fā)明因此提供一種植物，其含有一種異源核表達(dá)盒或其部分，其優(yōu)選地含有一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，更優(yōu)選地一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如煙草PR-1a啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼反式激活蛋白(優(yōu)選的是不在植物中天然存在的反式激活蛋白，優(yōu)選地RNA聚合酶或DNA結(jié)合蛋白，如T7 RNA聚合酶)的核苷酸序列有效連接，該反式激活蛋白任選地與質(zhì)體導(dǎo)向序列如葉綠體導(dǎo)向序列(例如，上述可在植物中表達(dá)的表達(dá)盒)融合；和一種異源質(zhì)體表達(dá)盒或其部分，其含有由反式激活蛋白調(diào)節(jié)并與操縱子樣多順?lè)醋踊蛴行нB接的反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，當(dāng)反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶時(shí)為T(mén)7啟動(dòng)子)，該多順?lè)醋踊蚝兄辽僖环N包含編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列的基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸环N包含編碼海藻糖磷酸合酶的核苷酸序列的基因，和一種編碼編碼海藻糖磷酸磷酸酶的核苷酸序列的基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸环N位于操縱子樣多順?lè)醋踊蛑袃蓚€(gè)基因之間的間插DNA序列，優(yōu)選的是在質(zhì)體基因組中不存在的DNA序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA序列來(lái)源于非真核基因的5’非翻譯(UTR)區(qū)，優(yōu)選地病毒5’UTR，優(yōu)選地來(lái)源于噬菌體如T7、T3或SP6噬菌體的5’UTR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾該DNA序列從而防止形成能阻止或抑制位于間插DNA序列直接下游的基因翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，位于間插DNA序列直接下游的基因的表達(dá)-優(yōu)選地翻譯-得到增強(qiáng)。
還包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子或其他容器中。
此外本發(fā)明提供一種植物，其含有一種異源核表達(dá)盒或其部分，其優(yōu)選地含有一種能使編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶(如核編碼的聚合酶或質(zhì)體編碼的聚合酶)所轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與一種操縱子樣多順?lè)醋踊蛴行нB接，該基因含有至少一種包含編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列的基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸环N包含編碼海藻糖磷酸合酶的核苷酸序列的基因，和一種編碼編碼海藻糖磷酸磷酸酶的核苷酸序列的基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸环N位于操縱子樣多順?lè)醋踊蛑袃蓚€(gè)基因之間的間插DNA序列，優(yōu)選的是在質(zhì)體中不存在的DNA序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA序列來(lái)源于非真核基因的5’非翻譯(UTR)區(qū)，優(yōu)選地病毒5’UTR，優(yōu)選地來(lái)源于噬菌體如T7、T3或SP6噬菌體的5’UTR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾該DNA序列從而防止形成能阻止或抑制位于間插DNA序列直接下游的基因翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，位于間插DNA序列直接下游的基因的表達(dá)-優(yōu)選地翻譯-得到增強(qiáng)。
還包括這種植物的子代和種子，種子被任選地處理(如裝填或包被)和/或包裝，例如與使用說(shuō)明書(shū)一起放于袋子或其他容器中。
此外本發(fā)明提供一種可在植物中表達(dá)的表達(dá)盒，其優(yōu)選地含有一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如例如煙草PR-1a啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼反式激活蛋白(優(yōu)選的是不在植物中天然存在的反式激活蛋白，優(yōu)選地RNA聚合酶或DNA結(jié)合蛋白，如T7 RNA聚合酶)的核苷酸序列有效連接，該反式激活蛋白與質(zhì)體導(dǎo)向序列如葉綠體導(dǎo)向序列融合；一種含有這種植物表達(dá)盒的載體；和一種用這種載體轉(zhuǎn)化的植物，或其基因組中含有這種植物可表達(dá)表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也提供一種異源質(zhì)體表達(dá)盒，其含有一種由反式激活蛋白調(diào)節(jié)并與編碼至少一種海藻糖生物合成酶(如海藻糖-6-磷酸合酶和/或海藻糖-6-磷酸磷酸酶)的核苷酸序列有效連接的反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，當(dāng)反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶時(shí)為T(mén)7啟動(dòng)子)。
本發(fā)明也提供一種異源質(zhì)體表達(dá)盒，其含有一種由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶(如核編碼聚合酶或質(zhì)體編碼聚合酶)轉(zhuǎn)錄并與編碼至少一種海藻糖生物合成酶(如海藻糖-6-磷酸合酶和/或海藻糖-6-磷酸磷酸酶)的核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子。
本發(fā)明也提供一種異源質(zhì)體表達(dá)盒，其含有一種能使海藻糖生物合成基因在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶如核編碼聚合酶或質(zhì)體編碼聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，或由反式激活蛋白調(diào)節(jié)的反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，當(dāng)反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶時(shí)為T(mén)7啟動(dòng)子)，它與一種含有編碼兩種海藻糖生物合成酶的核苷酸序列的操縱子樣多順?lè)醋踊蛴行нB接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸环N位于操縱子樣多順?lè)醋踊蛑袃蓚€(gè)基因之間的間插DNA序列，優(yōu)選的是在質(zhì)體中不存在的DNA序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA序列含有非真核基因的5’非翻譯(UTR)區(qū)的一部分，優(yōu)選地病毒5’UTR，優(yōu)選地來(lái)源于噬菌體如T7、T3或SP6噬菌體的5’UTR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾該DNA序列從而防止形成能阻止或抑制位于間插DNA序列直接下游的基因翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，位于間插DNA序列直接下游的基因的表達(dá)-優(yōu)選地翻譯-得到增強(qiáng)。
本發(fā)明也包括一種產(chǎn)生上述植物的方法，包括一種含有異源核表達(dá)盒或其部分的植物，此表達(dá)盒包含一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，更優(yōu)選地誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼能調(diào)節(jié)反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子的反式激活蛋白的核苷酸序列有效連接，用該植物的花粉對(duì)一種含有包含反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子的異源質(zhì)體表達(dá)盒或其部分的植物傳粉，該啟動(dòng)子由反式激活蛋白調(diào)節(jié)并與目的核苷酸序列(優(yōu)選地編碼至少一種海藻糖生物合成酶如海藻糖-6-磷酸合酶和/或海藻糖-6-磷酸磷酸酶)的核苷酸序列有效連接；從這樣傳粉的植物中回收種子；和由所述種子培育上述植物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在植物中產(chǎn)生海藻糖的方法，方法是在該植物中，在上述任一種啟動(dòng)子如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子的控制下或在上述任一種表達(dá)盒中，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
一種保護(hù)植物免于干旱、高鹽度、滲透壓協(xié)迫和極端溫度影響的方法，方法是在該植物中，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
一種提高收獲植物的耐貯性的方法，方法是在該植物中，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
一種延長(zhǎng)果實(shí)和蔬菜貯存時(shí)間和保存花的方法，方法是在該果實(shí)、蔬菜和花中，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法，方法是在該植物中，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在植物質(zhì)體中從單一啟動(dòng)子開(kāi)始表達(dá)兩種或多種基因的方法，包括向該植物的質(zhì)體基因組中引入一種操縱子樣多順?lè)醋踊?，該基因包含與能在該植物質(zhì)體中表達(dá)該操縱子樣多順?lè)醋踊虻膯?dòng)子有效連接的所述兩種或多種基因，其中該操縱子樣多順?lè)醋踊蛄硗夂幸环N位于兩個(gè)基因之間的間插DNA序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA序列在質(zhì)體基因組中不存在。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA序列包含非真核基因的5’非翻譯(UTR)區(qū)的一部分，優(yōu)選地病毒5’UTR，優(yōu)選地來(lái)源于噬菌體如T7、T3或SP6噬菌體的5’UTR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾該DNA序列從而防止形成能阻止或抑制位于間插DNA序列直接下游的基因翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，位于間插DNA序列直接下游的基因的表達(dá)-優(yōu)選地翻譯-得到增強(qiáng)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，操縱子樣多順?lè)醋踊蚝兄辽僖环N包含編碼海藻糖生物合成基因的核苷酸序列的基因。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸环N包含編碼海藻糖磷酸合酶的核苷酸序列的基因和一種包含編碼海藻糖磷酸磷酸酶的核苷酸序列的基因。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離的DNA分子，其含有與SEQ ID NO:45、47、49或51所示任一種核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核苷酸序列編碼一種具有與SEQ ID NO:46、48、50或52所示任一種氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA分子與SEQ ID NO:45、47、49或51所示任一種核苷酸序列相同或基本上相似，或者編碼一種具有與SEQ ID NO:46、48、50或52所示任一種氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA分子來(lái)源于一種單子葉植物，優(yōu)選地來(lái)源于玉米。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核苷酸序列編碼一種海藻糖生物合成基因或其部分，優(yōu)選地海藻糖-6-磷酸合酶或海藻糖-6-磷酸磷酸酶。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離的蛋白質(zhì)，其含有一種由SEQ ID NO:45、47、49或51所示任一種核苷酸序列編碼的多肽，或者含有一種具有與SEQ IDNO:46、48、50或52所示任一種氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)由SEQ ID NO:45、47、49或51所示任一種核苷酸序列編碼，或者與SEQ ID NO:46、48、50或52所示任一種氨基酸序列編碼的多肽相同或基本上相似。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多肽優(yōu)選地來(lái)源于一種單子葉植物，優(yōu)選地來(lái)源于玉米。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多肽包含海藻糖生物合成酶或其部分，優(yōu)選地海藻糖-6-磷酸合酶或海藻糖-6-磷酸磷酸酶。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種植物，其含有一種包含SEQ ID NO:45、47、49或51所示任一種核苷酸序列或其部分的表達(dá)盒，其中該DNA分子可在該植物中表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該表達(dá)盒穩(wěn)定地整合于該植物的基因組中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物耐受逆境，優(yōu)選地干旱、滲透壓及溫度逆境。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種培育對(duì)逆境優(yōu)選地干旱、滲透壓及溫度逆境有增強(qiáng)抗性的植物的方法，包括下列步驟a)使用SEQ ID NO:45、47、49或51所示任一種核苷酸序列或其部分，鑒定植物種不同品種中的分子多態(tài)性，和b)使該多態(tài)性與顯示對(duì)逆境優(yōu)選地干旱、滲透壓及溫度逆境有增強(qiáng)抗性的植物種的一個(gè)品種相關(guān)聯(lián)，和c)利用該多態(tài)性通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)培育技術(shù)將該逆境抗性引入該植物種的希望的系中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種通過(guò)上述任一種方法獲得的植物，其中該植物耐受逆境，優(yōu)選地干旱、滲透壓及溫度逆境。定義為了確保對(duì)本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)的清楚和一致的理解，提供下列定義“耐旱性”是一種生理狀態(tài)，此時(shí)植物能持續(xù)長(zhǎng)期地接受少于正常所需的水或不被澆水，而不顯示葉子枯萎或脫水的其他特征。
在此使用時(shí)，“基因”包含任選地與核苷酸序列之前或之后的DNA序列有效連接的核苷酸序列。該核苷酸序列一般被轉(zhuǎn)錄為RNA如mRNA(有義RNA或反義RNA)、rRNA、tRNA或snRNA?；蛑械暮塑账嵝蛄腥芜x地包含一種能被翻譯為一種多肽的編碼序列。核苷酸序列之前或之后的DNA序列的實(shí)例包括5’和3’非翻譯序列、終止信號(hào)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)，或其部分?；蛑幸部赡艽嬖诘钠渌抢鐑?nèi)含子。
在此使用的“表達(dá)盒”意思是一種DNA構(gòu)建體，它設(shè)計(jì)為使得插入其中的核苷酸序列能在適當(dāng)宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，任選地翻譯。表達(dá)盒一般含有調(diào)節(jié)元件，例如能引導(dǎo)與該核苷酸序列有效連接的核苷酸序列表達(dá)的啟動(dòng)子，其本身任選地與3’序列(如3’調(diào)節(jié)序列)或終止信號(hào)有效連接。表達(dá)盒也可含有核苷酸序列中所含編碼序列的正確翻譯所需的序列。該核苷酸序列通常含有一種蛋白質(zhì)的編碼序列，但也可編碼一種目的功能RNA，例如反義RNA或非翻譯RNA，它們以有義或反義方向抑制特定基因的表達(dá)如反義RNA。含有目的核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，意思是其至少一種成分對(duì)于其至少另一種成分而言是異源的。表達(dá)盒也可以是天然存在但已經(jīng)以用于異源表達(dá)的重組形式獲得的。然而一般而言，表達(dá)盒對(duì)于宿主是異源的，即表達(dá)盒的特定DNA序列不是天然存在于宿主細(xì)胞中，必須被引入宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的祖先中。表達(dá)盒中核苷酸序列的表達(dá)可以受組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制，該啟動(dòng)子只有在宿主細(xì)胞接觸某種特定外部刺激物時(shí)才起始轉(zhuǎn)錄。對(duì)于多細(xì)胞生物，如植物，啟動(dòng)子也可能是對(duì)特定組織或器官或發(fā)育階段特異的。核表達(dá)盒通常被插入植物的核基因組中，并且能引導(dǎo)該植物核基因組的特定核苷酸序列的表達(dá)。質(zhì)體表達(dá)盒通常被插入植物的質(zhì)體基因組中，并且能引導(dǎo)該植物質(zhì)體基因組的特定核苷酸序列的表達(dá)，例如，由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶(如核編碼聚合酶或質(zhì)體編碼聚合酶)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，或反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子。此處所述的質(zhì)體表達(dá)盒可以任選地含有一種操縱子樣多順?lè)醋踊颉?br> “調(diào)節(jié)元件”是指參與核苷酸序列表達(dá)的DNA序列。調(diào)節(jié)元件含有一種與目的核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子，也可包含5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)或終止信號(hào)。它們一般也包含核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列，例如，在質(zhì)體表達(dá)的情況中，包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)。
在此使用的“異源的”意思是“不同自然來(lái)源的”，或代表一種非天然狀態(tài)。例如，如果用來(lái)源于另一種生物尤其來(lái)源于另一個(gè)種的核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，則該核苷酸序列對(duì)于該宿主細(xì)胞是異源的，并且對(duì)于該宿主細(xì)胞的攜帶該基因的后代也是異源的。同樣，異源是指一種來(lái)源于和插入相同天然、原始細(xì)胞型的核苷酸序列，但它以非天然狀態(tài)存在，例如，不同拷貝數(shù)，或處于不同調(diào)節(jié)元件控制之下。轉(zhuǎn)化的核苷酸序列可以含有一種異源編碼序列，或異源調(diào)節(jié)序列。此外，轉(zhuǎn)化的核苷酸序列也可能是完全異源的，或者可能包括異源和內(nèi)源核酸序列的任一可能的組合。
“表達(dá)”是指核苷酸序列(如內(nèi)源基因或異源基因)在宿主生物如微生物或植物中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，對(duì)于反義構(gòu)建體，表達(dá)可以?xún)H指反義DNA的轉(zhuǎn)錄。
“操縱子樣多順?lè)醋踊颉焙袃煞N或多種目的基因，它們受能引導(dǎo)這種操縱子樣多順?lè)醋踊蛟谥参镔|(zhì)體中表達(dá)的單個(gè)啟動(dòng)子控制。操縱子樣多順?lè)醋踊蛑械拿恳环N基因任選地含有一種與核苷酸序列5’端有效連接的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)。操縱子樣多順?lè)醋踊蛑械拿糠Nrbs優(yōu)選地是不同的。操縱子樣多順?lè)醋踊蛞话阋舶c操縱子樣多順?lè)醋踊蛑械谝环N基因rbc的5’端有效連接的5’UTR，和與操縱子樣多順?lè)醋踊蛑凶詈笠环N基因3’端有效連接的3’UTR。操縱子樣多順?lè)醋踊蛑械膬煞N基因也可包含在兩種基因間重疊的幾種核酸。
“同質(zhì)體的”指一種植物、植物組織或植物細(xì)胞，其中所有的質(zhì)體是遺傳學(xué)上相同的。當(dāng)質(zhì)體未被轉(zhuǎn)化、突變或其他遺傳改變時(shí)，這在植物中是正常狀態(tài)。在不同的組織或發(fā)育階段中，質(zhì)體可能有不同的形式，例如葉綠體、前質(zhì)體、黃化質(zhì)體、造粉體、色質(zhì)體等等。
“標(biāo)記基因”一種編碼選擇性或可篩選性狀的基因。
“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”是僅當(dāng)植物接觸某些特定的外部刺激物時(shí)才起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其不同于組成型啟動(dòng)子或?qū)μ囟ńM織或器官或發(fā)育階段特異的啟動(dòng)子。對(duì)于本發(fā)明特別優(yōu)選的是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括植物衍生的啟動(dòng)子，如系統(tǒng)獲得的耐受途徑中的啟動(dòng)子，例如PR啟動(dòng)子，如PR-1、PR-2、PR-3、PR-4和PR-5啟動(dòng)子，尤其是煙草PR-1a啟動(dòng)子和擬南芥PR-1啟動(dòng)子，當(dāng)植物接觸BTH和相關(guān)化學(xué)物時(shí)它們才起始轉(zhuǎn)錄。見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,614,395，在此引用作為參考，以及WO98/03536，在此引用作為參考。化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也包括受體介導(dǎo)的系統(tǒng)，如來(lái)源于其他生物的系統(tǒng)，如類(lèi)固醇依賴(lài)的基因表達(dá)、銅依賴(lài)的基因表達(dá)、四環(huán)素依賴(lài)的基因表達(dá)，尤其是應(yīng)用保幼生長(zhǎng)激素及其拮抗劑介導(dǎo)的果蠅(Drosophila)USP受體的表達(dá)系統(tǒng)，這在EP-A 0859851中有述，在此引用作為參考，以及使用受體組合的系統(tǒng)，如EP-A 0813 604中所述，在此引用作為參考。創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括蛋白酶抑制劑的啟動(dòng)子，如馬鈴著的蛋白酶抑制劑Ⅱ啟動(dòng)子，及其他參與創(chuàng)傷應(yīng)答途徑的植物衍生的啟動(dòng)子，如多酚氧化酶、LAP和TD的啟動(dòng)子?？偟囊?jiàn)C.Gatz，“基因表達(dá)的化學(xué)調(diào)控”，植物生理學(xué)與植物分子生物學(xué)年報(bào)，(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)(1997)48:89-108，其內(nèi)容在此引用作為參考。
“有效連接/相關(guān)”如果兩種序列位于某處使得DNA序列影響核苷酸序列的表達(dá)，那么該DNA序列，例如含有一種調(diào)節(jié)元件，認(rèn)為與該核苷酸序列“有效連接”或“相關(guān)”。
“表型性狀”由一種或多種基因的表達(dá)引起的可檢測(cè)性質(zhì)。
“植物”“植物”是指處于任一發(fā)育階段的任一植物或植物的部分。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，植物可能被致死性創(chuàng)傷以誘導(dǎo)表達(dá)，或者可誘導(dǎo)表達(dá)致死水平的希望蛋白質(zhì)，因此在此使用的術(shù)語(yǔ)“植物”特別是指包括被嚴(yán)重?fù)p傷或殺死的植物和植物材料，以及存活的植物、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物和種子。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物不同之處在于，直到海藻糖生物合成基因誘導(dǎo)時(shí)仍是發(fā)育正常的。
“植物細(xì)胞”植物的結(jié)構(gòu)和生理學(xué)單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可能為分離的單細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞的形式，或者作為高級(jí)組織單位的一部分，如植物組織或植物器官。
“植物材料”是指葉、莖、根、花或花部分、果實(shí)、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵細(xì)胞、合子、胚、種子、質(zhì)體、線(xiàn)粒體、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或植物的其他任何部分或產(chǎn)物。
“啟動(dòng)子”起始相關(guān)DNA序列轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動(dòng)子區(qū)也可包含作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)物如激活物、增強(qiáng)劑和/或阻抑物的元件。
“原生質(zhì)體”細(xì)胞壁被全部或部分去除的分離的植物細(xì)胞。
“重組DNA分子”用重組DNA技術(shù)連接在一起的DNA序列的組合。
“重組DNA技術(shù)”用來(lái)連接DNA序列的方法，例如，如Sambrook等人，1989，冷泉港，NY冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社所述。
“可篩選的標(biāo)記基因”一種基因，其表達(dá)不能賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇性?xún)?yōu)勢(shì)，但其表達(dá)使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在表型上不同于未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
“選擇性標(biāo)記基因”一種基因，其在植物細(xì)胞中的表達(dá)給予該細(xì)胞一種選擇性?xún)?yōu)勢(shì)。與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的生長(zhǎng)相比，用選擇性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所具有的選擇性?xún)?yōu)勢(shì)可能是由于其在負(fù)選擇劑如抗生素或除草劑存在下生長(zhǎng)的能力。與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有的選擇性?xún)?yōu)勢(shì)也可能是由于其利用添加的化合物作為養(yǎng)分、生長(zhǎng)因子或能源的增強(qiáng)的或新的能力。選擇性標(biāo)記基因也指其在植物細(xì)胞中的表達(dá)給予細(xì)胞負(fù)選擇和正選擇優(yōu)勢(shì)的基因或基因組合。
最廣義地來(lái)說(shuō)，當(dāng)在此對(duì)于核苷酸序列使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本上類(lèi)似”意思是一種對(duì)應(yīng)于參照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相應(yīng)的序列編碼一種與參照核苷酸序列編碼的多肽有基本上相同的結(jié)構(gòu)和功能的多肽，例如，只發(fā)生不影響多肽功能的氨基酸改變。希望地，基本上相似的核苷酸序列編碼參照核苷酸序列編碼的多肽。基本上類(lèi)似的核苷酸序列與參照核苷酸序列之間同一性的百分?jǐn)?shù)希望地為至少80％，更希望地為至少85％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，再更優(yōu)選地至少99％。使用Smith-Waterman序列對(duì)比算法進(jìn)行序列對(duì)比(見(jiàn)，例如，Waterman,M.S.《計(jì)算生物學(xué)介紹圖譜、序列與基因組》。Chapman & Hall.倫敦1995.ISBN 0-412-99391-0，或http://www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html)。localS程序1.16版使用下列參數(shù)匹配1，罰錯(cuò)配0.33，開(kāi)放罰區(qū)間(open-gap)2，擴(kuò)展罰區(qū)間(extended-gap)2。與參照序列“基本上類(lèi)似的”核苷酸序列在下列條件下可與參照核苷酸序列雜交7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、lmM EDTA,50℃，用2×SSC、0.1％SDS在50℃下洗滌，更希望的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA,50℃，用1×SSC、0.1％SDS在50℃下洗滌，更希望的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA,50℃，用0.5×SSC、0.1％SDS在50℃下洗滌，優(yōu)選的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA,50℃，用0.1×SSC、0.1％SDS在50℃下洗滌，更優(yōu)選的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA,50℃，用0.1×SSC、0.1％SDS在65℃下洗滌。
當(dāng)在此對(duì)于蛋白質(zhì)使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本上類(lèi)似”意思是一種對(duì)應(yīng)于參照蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)與參照蛋白質(zhì)有基本上相同的結(jié)構(gòu)和功能，例如，只發(fā)生不影響多肽功能的氨基酸變化。當(dāng)用于蛋白質(zhì)或氨基酸序列時(shí)，基本上類(lèi)似的與參照蛋白質(zhì)或氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)希望地至少為80％，更希望地85％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，再更優(yōu)選地至少99％。
“反式激活蛋白”“反式激活蛋白”是一種蛋白質(zhì)，其本身或與一種或多種其他蛋白質(zhì)結(jié)合，能使編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄受相應(yīng)反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子的控制。反式激活蛋白系統(tǒng)的實(shí)例包括噬菌體T7基因10啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄激活依賴(lài)于特異的RNA聚合酶如噬菌體T7 RNA聚合酶。反式激活蛋白一般是一種RNA聚合酶或DNA結(jié)合蛋白，它能通過(guò)直接激活啟動(dòng)子或滅活阻遏基因，例如，抑制阻遏蛋白的表達(dá)或積累，與特定的啟動(dòng)子相互作用而起始轉(zhuǎn)錄。DNA結(jié)合蛋白可以是一種包含與適當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活蛋白結(jié)構(gòu)域連接的結(jié)合區(qū)(如GAL4結(jié)合區(qū))的嵌合蛋白。某些反式激活蛋白系統(tǒng)可能具有多種反式激活蛋白，例如對(duì)于啟動(dòng)子識(shí)別、DNA結(jié)合、或轉(zhuǎn)錄激活不僅需要聚合酶而且需要特定亞單位(sigma因子)的啟動(dòng)子。反式激活蛋白優(yōu)選地對(duì)于植物是異源的。
“轉(zhuǎn)化”核苷酸序列向細(xì)胞中的引入。特別是，DNA分子向目的生物基因組中的穩(wěn)定整合。
“海藻糖生物合成酶”是如此處所述參與由葡萄糖生物合成海藻糖的多肽，特別是催化UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸縮合為海藻糖-6-磷酸的海藻糖-6-磷酸合酶，或使海藻糖-6-磷酸磷酸化為海藻糖的海藻糖-6-磷酸磷酸酶。編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列包含于海藻糖生物合成基因中。
“海藻糖”是一種D-吡喃葡糖基-[1,1]-D-吡喃葡糖苷。本發(fā)明中海藻糖的優(yōu)選形式是α,α-海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-[1,1]-α-D-吡喃葡糖苷)。
本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的DNA分子的細(xì)胞，其中該DNA分子不存在于其天然細(xì)胞環(huán)境中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些細(xì)胞是植物細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA分子可在這些細(xì)胞中表達(dá)，并包含于使其能在這些細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)盒中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)盒穩(wěn)定地整合于這種宿主細(xì)胞的DNA中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含于能在細(xì)胞中復(fù)制并作為染色體外分子存在于細(xì)胞中的載體中。
本發(fā)明也包括含有上述植物細(xì)胞的植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA分子可在植物中表達(dá)，本發(fā)明的任一種DNA分子或其功能部分或其衍生物在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)使得海藻糖產(chǎn)生，并導(dǎo)致耐旱性、提高的食物質(zhì)量、可用于工業(yè)生產(chǎn)的高水平海藻糖及此處所述的其他特征。因此本發(fā)明也包括由于本發(fā)明的任一種DNA分子或其功能部分或衍生物表達(dá)而表達(dá)海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物。
根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，包括但不限于玉米、小麥、大麥、黑麥、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、洋白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、蘿卜、小蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、胡椒、芹菜、筍瓜、南瓜、大麻、夏南瓜、蘋(píng)果、梨、溫柏、甜瓜、李子、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜，芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油籽油菜、三葉草、煙草、胡蘿卜、棉花、苜蓿、水稻、馬鈴薯、茄子、黃瓜、擬南芥(Arabidopsis thaliana)，和木本植物如松柏類(lèi)和落葉類(lèi)樹(shù)。
優(yōu)選的是選自玉米、小麥、大麥、黑麥、高粱和水稻的單子葉植物。
進(jìn)一步優(yōu)選的是選自菊苣、萵苣、洋白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、胡椒、筍瓜、南瓜、夏南瓜、甜瓜、大豆、番茄、甘蔗、甜菜、向日葵、油籽油菜、棉花和苜蓿的雙子葉植物。
一旦希望的核苷酸序列被轉(zhuǎn)化到特定的植物種中，即可用傳統(tǒng)的培育技術(shù)，例如通過(guò)輪回選擇培育(如回交)，使其在該種中繁殖或移至相同種的其他變種中，尤其包括商業(yè)變種。在此情況中，首先使欲漸滲希望的轉(zhuǎn)基因的回歸親本與帶有所述轉(zhuǎn)基因的非回歸親本雜交。然后使該雜交的子代與回歸親本回交，之后在得到的子代中選擇欲從非回歸親本轉(zhuǎn)移出的轉(zhuǎn)基因。與回歸親本回交選擇轉(zhuǎn)基因三代、優(yōu)選地四代、更優(yōu)選地五代或更多代之后，對(duì)所轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因而言子代將是雜合的，但在大多數(shù)或幾乎所有其他基因而言類(lèi)似于回歸親本。
對(duì)于在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，DNA分子可能需要修飾和優(yōu)化，特別是在DNA分子是原核來(lái)源時(shí)。本領(lǐng)域中公知，所有生物都具有密碼子使用的特殊偏好性，并且能改變本發(fā)明的DNA分子中所含核苷酸序列中的密碼子，使之符合特殊的植物偏好性，而保留由此編碼的氨基酸。此外，由至少具有35％優(yōu)選地超過(guò)45％GC含量的編碼序列可最佳地實(shí)現(xiàn)在植物中的高表達(dá)。由于存在可能使信息去穩(wěn)定的ATTTA基元和可引起不適當(dāng)聚腺苷酸化的AATAAA基元，具有低GC含量的核苷酸序列可能表達(dá)較差。雖然優(yōu)選的基因序列在單子葉植物和雙子葉植物種中都可以充分表達(dá)，但是可以修飾這些序列來(lái)適應(yīng)單子葉植物或雙子葉植物的特殊密碼子偏好性和GC含量偏好性，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)這些偏好性各不相同(Murray等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)17:477-498(1989))。另外，對(duì)導(dǎo)致信息截?cái)嗟姆浅Ｒ?guī)剪接位點(diǎn)的存在進(jìn)行核苷酸序列篩選。用公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0385962(Monsanto)、EP 0359472(Lubrizol)和WO 93/07278(Ciba-geigy)所述的方法，利用眾所周知的定點(diǎn)誘變、PCR和合成基因構(gòu)建，進(jìn)行如上所述需要在核苷酸序列內(nèi)進(jìn)行的所有改變。
為了翻譯的有效起始，與起始甲硫氨酸相鄰的序列可能需要修飾。例如，可通過(guò)使之含有已知在植物中有效的序列進(jìn)行修飾。Joshi曾經(jīng)提出了適當(dāng)?shù)闹参锕灿袇^(qū)(NAR 15:6643-6653(1987)),Clontech提出另一種共有翻譯起始區(qū)(1993/1994目錄，第210頁(yè))。這些共有區(qū)適于與本發(fā)明的核苷酸序列一起使用。將這些序列摻入含有該核苷酸序列的構(gòu)建體中，直到并包含ATG(在第二個(gè)氨基酸未被修飾時(shí))，或者直到并包含在A(yíng)TG之后的GTC(具有修飾轉(zhuǎn)基因的第二個(gè)氨基酸的可能性)。
在轉(zhuǎn)基因植物中，本發(fā)明的DNA分子，例如海藻糖生物合成基因或編碼一種反式激活蛋白的基因，由在植物中顯示有功能的啟動(dòng)子所引導(dǎo)。啟動(dòng)子的選擇將隨表達(dá)的時(shí)間和空間需要而不同，也隨目標(biāo)種而不同。雖然多種雙子葉植物啟動(dòng)子顯示在單子葉植物中也是有效的并且反之亦然，但理想的是，對(duì)于雙子葉植物中的表達(dá)選擇雙子葉植物啟動(dòng)子，對(duì)于單子葉植物中的表達(dá)選擇單子葉植物啟動(dòng)子。然而，對(duì)于所選擇啟動(dòng)子的來(lái)源沒(méi)有限制；只要它們?cè)谝龑?dǎo)DNA分子在希望的細(xì)胞中表達(dá)這一方面有效就足夠了。
組成型表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子包括CaMV 35S和19S啟動(dòng)子、來(lái)源于編碼肌動(dòng)蛋白或遍在蛋白的基因的啟動(dòng)子和來(lái)源于農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriuim)的啟動(dòng)子，例如PCT/US94/12946中所述的合成啟動(dòng)子。然而，本發(fā)明的DNA分子優(yōu)選地在化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下表達(dá)。這使得只有在用誘導(dǎo)性化學(xué)制劑處理作物時(shí)才合成海藻糖，由此避免了秧苗的發(fā)育異常。在公開(kāi)申請(qǐng)EP 0332104(Ciba-Geigy)和美國(guó)專(zhuān)利5,614,395中詳述了用于化學(xué)誘導(dǎo)基因表達(dá)的優(yōu)選技術(shù)。用于化學(xué)誘導(dǎo)的一種優(yōu)選啟動(dòng)子是煙草PR-1a啟動(dòng)子。
第二種優(yōu)選的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子種類(lèi)是，當(dāng)植物受到損傷例如收獲或青貯或其他加工時(shí)使海藻糖生物合成酶表達(dá)的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。曾經(jīng)描述了在創(chuàng)傷部位表達(dá)的多種啟動(dòng)子。該種類(lèi)的優(yōu)選啟動(dòng)子包括以下所述的啟動(dòng)子Stanford等人，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)215:200-208(1989),Xu等人，植物分子生物學(xué)(Plant Molec.Biol.)22:573-588(1993),Logemann等人，植物細(xì)胞(Plant Cell)1:151-158(1989),Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學(xué)22:783-792(1993),Firek等人，植物分子生物學(xué)22:129-142(1993)，和Warner等人，植物雜志(Plant J.)3:191-201(1993)。
優(yōu)選的組織特異性表達(dá)模式包括綠色組織特異性、根特異性、莖特異性和花特異性表達(dá)。適于在綠色組織中表達(dá)的啟動(dòng)子包括調(diào)節(jié)參與光合作用的基因的多種啟動(dòng)子，其中許多已經(jīng)從單子葉植物和雙子葉植物中克隆。一種優(yōu)選啟動(dòng)子是來(lái)源于磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC啟動(dòng)子(Hudspeth和Grula，植物分子生物學(xué)12:579-589(1989))。一種用于根特異性表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子是de Framond(FEBS290:103-106(1991)；授予Ciba-Geigy的EP 0452269)所述的啟動(dòng)子，另一種優(yōu)選的根特異性啟動(dòng)子是本發(fā)明提供的T-1基因的啟動(dòng)子。一種優(yōu)選的莖特異性啟動(dòng)子是美國(guó)專(zhuān)利5,625,136(Ciba-Geigy)所述并引導(dǎo)玉米trpA基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
除了適當(dāng)啟動(dòng)子的選擇之外，用于蛋白質(zhì)在植物中表達(dá)的構(gòu)建還任選地需要一種與異源核苷酸序列下游連接的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄終止子。幾種這樣的終止子在本領(lǐng)域中是可獲得的和公知的(例如CaMV的tm1和rbcS的E9)。在本發(fā)明中能使用已知在植物中起作用的任一可獲得的啟動(dòng)子。能將多種其他序列摻入本發(fā)明的DNA分子的表達(dá)盒中。這包括顯示增強(qiáng)表達(dá)的序列如(例如Adh1和bronze1的)內(nèi)含子序列和(例如，TMV、MCMV和AMV的)病毒前導(dǎo)序列。
將DNA分子的表達(dá)導(dǎo)向到植物的不同細(xì)胞部位是優(yōu)選的。在某些情況中，在細(xì)胞溶膠中的定位可能是希望的，而在另一些情況中，在某些亞細(xì)胞器中的定位可能是優(yōu)選的。能用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因編碼酶的亞細(xì)胞定位。一般而言，操作編碼已知細(xì)胞器導(dǎo)向基因產(chǎn)物的引導(dǎo)肽的DNA，并使其與核苷酸序列上游融合。對(duì)于葉綠體已知多種這類(lèi)導(dǎo)向序列，并且證明了其在異源構(gòu)建中的作用。優(yōu)選的一類(lèi)導(dǎo)向序列是液泡導(dǎo)向序列，例如，在植物殼多糖酶和蛋白酶中發(fā)現(xiàn)的。
在本說(shuō)明書(shū)中另外敘述了適用于植物轉(zhuǎn)化的載體。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，二元載體或攜帶至少一種T-DNA邊界序列的載體是合適的，而對(duì)于直接基因轉(zhuǎn)移，任何載體都是合適的，僅含有目的構(gòu)建體的線(xiàn)性DNA可能是優(yōu)選的。在直接基因轉(zhuǎn)移的情況中，能使用單DNA種轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化(Schocher等人，生物技術(shù)(Biotechnology)4:1093-1096(1986))。對(duì)于直接基因轉(zhuǎn)移和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，通常(但不是必須)用可提供對(duì)抗生素(卡那霉素、潮霉素或氨甲喋呤)或除草劑(basta)抗性的選擇性標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然而，選擇性標(biāo)記的選擇對(duì)于本發(fā)明是不重要的。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，直接將本發(fā)明的DNA分子轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,576,198；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 95/16783和WO 97/32977；和McBride等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:7301-7305(1994)中廣泛描述了質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，在此全部引用作為參考。經(jīng)biolistics的質(zhì)體轉(zhuǎn)化最初在單細(xì)胞綠藻萊因哈德衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中進(jìn)行(Boynton等人(1988)科學(xué)(Science)240:1534-1537，在此引用作為參考)，很快將利用選擇順式作用抗生素抗性基因座(壯觀(guān)霉素/鏈霉素抗性)或非光合作用突變表型互補(bǔ)的該方法擴(kuò)展到煙草(Nicotiana tabacum)(Svab等人(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)87:8526-8530，在此引用作為參考)。
煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括，對(duì)葉或愈傷組織的粒子轟擊，或PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體質(zhì)粒DNA攝取，該質(zhì)粒具有側(cè)翼為選擇性抗生素抗性標(biāo)記的克隆質(zhì)體DNA區(qū)。1-1.5kb側(cè)翼區(qū)稱(chēng)為導(dǎo)向序列，其利于與質(zhì)體基因組的同源重組，因此允許156kb煙草質(zhì)體基因組特定區(qū)的置換或修飾。開(kāi)始時(shí)，用賦予壯觀(guān)霉素和/或鏈霉素抗性的質(zhì)體16SrRNA和rps12基因中的點(diǎn)突變作為轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(Svab,Z.,Haidukiewicz,P.和Maliga,P.(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)87,8526-8530；Staub,J.M.和Maliga,P.(1992)植物細(xì)胞4,39-45，在此引用作為參考)。這產(chǎn)生穩(wěn)定的同質(zhì)轉(zhuǎn)化體，頻率為每100次轟擊靶葉產(chǎn)生大約一個(gè)。這些標(biāo)記之間克隆位點(diǎn)的存在使得能產(chǎn)生用于外源基因引入的質(zhì)體導(dǎo)向載體(Staub,J.M.和Maliga,P.，歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志(EMBO J.)12:601-606(1993)，在此引用作為參考)。通過(guò)用顯性選擇標(biāo)記，編碼壯觀(guān)霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌aadA基因，置換隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因，能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化頻率的大大提高(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)90,913-917，在此引用作為參考)。以前，該標(biāo)記曾成功地用于綠藻萊因哈德衣藻質(zhì)體基因組的高頻轉(zhuǎn)化(Goldschmidt-Clermont,M.(1991)核酸研究19,4083-4089，在此引用作為參考)。最近，用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的DNA攝取實(shí)現(xiàn)了煙草和蘚類(lèi)Physcomitrella patens的原生質(zhì)體的質(zhì)體轉(zhuǎn)化(O’Neill等人(1993)植物雜志3:729-738；Koop等人(1996)Planta199:193-201，兩者在此都引用作為參考)。粒子轟擊和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化這兩種方法在本發(fā)明中都是適合的。
將本發(fā)明的DNA分子插入包含一種能在植物質(zhì)體中表達(dá)DNA分子的啟動(dòng)子的質(zhì)體表達(dá)盒中。一種能在植物質(zhì)體中表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子是從質(zhì)體基因編碼區(qū)上游5’側(cè)翼區(qū)分離的啟動(dòng)子，它可能來(lái)源于相同的或不同的種，其天然產(chǎn)物一般存在于大多數(shù)質(zhì)體類(lèi)型中，包括非綠色組織中存在的質(zhì)體中。質(zhì)體中的基因表達(dá)不同于核基因表達(dá)，并且與原核生物中的基因表達(dá)有關(guān)(如Stern等人(1997)植物科學(xué)趨勢(shì)(Trends in Plant Sciences)2:308-315所述，在此引用作為參考)。質(zhì)體啟動(dòng)子通常含有原核啟動(dòng)子典型的-35和-10元件，一些質(zhì)體啟動(dòng)子由主要在質(zhì)體基因組中編碼的大腸桿菌樣RNA聚合酶識(shí)別，稱(chēng)為PEP(質(zhì)體編碼的RNA聚合酶)啟動(dòng)子，而其他質(zhì)體啟動(dòng)子由核編碼的RNA聚合酶識(shí)別(NEP啟動(dòng)子)。兩種類(lèi)型的質(zhì)體啟動(dòng)子都適用于本發(fā)明。質(zhì)體啟動(dòng)子的實(shí)例包括clpP基因的啟動(dòng)子、如煙草clpP基因啟動(dòng)子(WO 97/06250，在此引用作為參考)和擬南芥clpP基因啟動(dòng)子。
能在植物質(zhì)體中表達(dá)DNA分子的另一種啟動(dòng)子來(lái)源于質(zhì)體16S核糖體RNA操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)(Harris等人，微生物學(xué)綜述(Microbiol.Rev.)58:700-754(1994),Shinozaki等人，歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志5:2043-2049(1986)，兩篇在此都引用作為參考)。能在植物質(zhì)體中表達(dá)DNA分子的啟動(dòng)子的其他實(shí)例是psbA啟動(dòng)子或rbcL啟動(dòng)子。質(zhì)體表達(dá)盒優(yōu)選地也另外含有與本發(fā)明的DNA分子有效連接的質(zhì)體基因3’非翻譯序列(3’UTR)。非翻譯序列的作用優(yōu)選地是引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄RNA的3’加工，而不是轉(zhuǎn)錄終止。優(yōu)選地，3’UTR是質(zhì)體rps16基因3’非翻譯序列或擬南芥質(zhì)體psbA基因3’非翻譯序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，質(zhì)體表達(dá)盒含有一個(gè)poly-G序列段代替3’非翻譯序列。質(zhì)體表達(dá)盒優(yōu)選地還含有與本發(fā)明的DNA分子有效連接的、在植物質(zhì)體中有功能的5’非翻譯序列(5’UTR)。
質(zhì)體表達(dá)盒包含于質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體中，該載體優(yōu)選地還含有用于通過(guò)同源重組向質(zhì)體基因組中整合的側(cè)翼區(qū)。質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體可任選地含有至少一個(gè)質(zhì)體復(fù)制起點(diǎn)。本發(fā)明也包括用這種質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的植物質(zhì)體，其中DNA分子可在植物質(zhì)體中表達(dá)。本發(fā)明也包括一種包含該植物質(zhì)體的植物或植物細(xì)胞，包括其后代。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物或植物細(xì)胞(包括其后代)就轉(zhuǎn)基因質(zhì)體而言是同質(zhì)的。
能在植物質(zhì)體中表達(dá)DNA分子的其他啟動(dòng)子是反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，優(yōu)選地對(duì)于其中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的植物或亞細(xì)胞器或植物細(xì)胞成分是異源的。在這些情況中，將編碼反式激活蛋白的DNA分子插入一種適當(dāng)?shù)暮吮磉_(dá)盒中，并將其轉(zhuǎn)化到植物核DNA中。用質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽將反式激活蛋白導(dǎo)向到質(zhì)體中。使反式激活蛋白和反式激活蛋白驅(qū)使的DNA分子集合在一起，方法是使選擇的質(zhì)體轉(zhuǎn)化系與一種轉(zhuǎn)基因系雜交，該轉(zhuǎn)基因系含有編碼反式激活蛋白的DNA分子，并補(bǔ)充有質(zhì)體導(dǎo)向序列，并且其與一個(gè)核啟動(dòng)子有效連接，或者將含有希望的DNA分子的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體直接轉(zhuǎn)化到一種轉(zhuǎn)基因系中，該轉(zhuǎn)基因系含有編碼反式激活蛋白的DNA分子，并補(bǔ)充有質(zhì)體導(dǎo)向序列，并且其與一個(gè)核啟動(dòng)子有效連接。如果該核啟動(dòng)子是一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，特別化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則DNA分子在植物質(zhì)體中的表達(dá)由化學(xué)誘導(dǎo)物的葉施用而激活。這種反式激活蛋白介導(dǎo)的誘導(dǎo)型質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選地是可緊密調(diào)節(jié)的，在誘導(dǎo)之前無(wú)可檢測(cè)的表達(dá)，在誘導(dǎo)之后有異常高的蛋白質(zhì)表達(dá)和積累。一種優(yōu)選的反式激活蛋白是例如病毒RNA聚合酶。該類(lèi)型的優(yōu)選啟動(dòng)子是由單亞基RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，如T7基因10啟動(dòng)子，它被噬菌體T7 DNA依賴(lài)的RNA聚合酶識(shí)別。優(yōu)選地將編碼T7聚合酶的基因轉(zhuǎn)化到核基因組中，并用質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽將T7聚合酶導(dǎo)向到質(zhì)體中。在下文或上文中描述了適用于核表達(dá)基因如編碼病毒RNA聚合酶如T7聚合酶的基因的啟動(dòng)子。DNA分子在質(zhì)體中的表達(dá)可以是組成型的或是誘導(dǎo)型的。DNA分子在質(zhì)體中的表達(dá)也可以是器官或組織特異的。在WO 98/11235中廣泛描述了這些不同的實(shí)施方案，在此引用作為參考。因此，一方面，本發(fā)明使葉綠體導(dǎo)向的噬菌體T7 RNA聚合酶在化學(xué)誘導(dǎo)型煙草PR-1a啟動(dòng)子控制下在核基因組中的表達(dá)(US 5,614,395，引用作為參考)與T7基因10啟動(dòng)子/終止序列調(diào)節(jié)的葉綠體報(bào)道轉(zhuǎn)基因結(jié)合起來(lái)。例如，當(dāng)用在核中表達(dá)T7聚合酶的植物系傳粉給就母體遺傳的海藻糖生物合成基因而言同質(zhì)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化體時(shí)，獲得帶有兩種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體但不表達(dá)它們的F1植物。只在葉施用PR-1a誘導(dǎo)化合物苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)后，才在這些植物的質(zhì)體中引發(fā)大量酶活性蛋白質(zhì)的合成。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在操縱子樣多順?lè)醋踊蛑袕膯螁?dòng)子開(kāi)始由質(zhì)體基因組轉(zhuǎn)錄兩種或多種基因，如海藻糖生物合成基因。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，操縱子樣多順?lè)醋踊蚝形挥谠摬倏v子樣多順?lè)醋踊蛑袃蓚€(gè)基因之間的間插DNA序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA序列在質(zhì)體基因組中不存在，以避免與質(zhì)體序列的同源重組。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA序列來(lái)源于非真核基因的5’非翻譯(UTR)區(qū)，優(yōu)選地來(lái)源于病毒5’UTR，優(yōu)選地來(lái)源于噬菌體如T7、T3或SP6噬菌體的5’UTR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾該DNA序列，從而防止在操縱子樣多順?lè)醋踊虻腞NA轉(zhuǎn)錄中，例如在該DNA序列與下游基因rbs之間形成RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)將阻止或抑制下游基因的表達(dá)，特別是其翻譯的起始。利用計(jì)算機(jī)模型和程序如“mfold”程序第3版(Zuker和Turner，華盛頓醫(yī)學(xué)院，St-Louis,MO)和本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其他方法，通過(guò)測(cè)定其解鏈溫度，預(yù)測(cè)這些RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。以下例舉了這種DNA序列。
間插DNA序列在操縱子樣多順?lè)醋踊蛑械拇嬖谔岣吡讼掠位虻膔bs的可接近性，從而導(dǎo)致更高的表達(dá)率。這種策略適用于欲在操縱子樣嵌合基因中從單啟動(dòng)子開(kāi)始從質(zhì)體基因組轉(zhuǎn)錄的任何兩種或多種基因。這些基因可能是代謝途徑的一部分，或者是編碼輸入(input)或輸出(output)性狀的基因。代謝途徑的實(shí)例是例如糖生物合成途徑，如海藻糖或果聚糖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用稱(chēng)為體外重組或DNA重排(shuffling)的技術(shù)，通過(guò)隨機(jī)突變的引入來(lái)修飾本發(fā)明的DNA分子。Stemmer等人，自然(Nature)370:389-391(1994)和美國(guó)專(zhuān)利5,605,793中描述了該技術(shù)，在此引用作為參考。根據(jù)此處所述原始核苷酸序列，能產(chǎn)生上百萬(wàn)的核苷酸序列突變拷貝，并能得到具有改進(jìn)的性質(zhì)如活性提高或特異性改變的變體。該方法包括由含有本發(fā)明的核苷酸序列的雙鏈多核苷酸的模板形成誘變的雙鏈多核苷酸，其中模板雙鏈多核苷酸被切割為希望大小的雙鏈隨機(jī)片段，該方法還包括下列步驟向得到的雙鏈隨機(jī)片段群添加一種或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸，其中該寡核苷酸具有與雙鏈模板多核苷酸的同一性區(qū)和異源性區(qū)；將得到的雙鏈隨機(jī)片段和寡核苷酸的混合物變性為單鏈片段；將得到的單鏈片段群與聚合酶在一定條件下溫育，使得該單鏈片段在同一性區(qū)退火，形成退火片段對(duì)，該同一性區(qū)對(duì)于片段對(duì)的一個(gè)成員而言足以引起另一個(gè)的復(fù)制，由此形成誘變的雙鏈多核苷酸；再重復(fù)第二步和第三步至少兩個(gè)循環(huán)，其中在另一循環(huán)第二步中得到的混合物包含從前一循環(huán)第三步得到的誘變雙鏈多核苷酸，而再一循環(huán)形成另一種誘變的雙鏈多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙鏈隨機(jī)片段的一個(gè)種在雙鏈隨機(jī)片段群體中的濃度低于總DNA重量的1％。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，模板雙鏈多核苷酸包含至少約100個(gè)種的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈隨機(jī)片段的大小為約5bp-5kb。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法的第四步包括重復(fù)第二步和第三步至少10個(gè)循環(huán)。
多種轉(zhuǎn)化載體可用于植物轉(zhuǎn)化，并且本發(fā)明的基因可與任何這些載體結(jié)合使用。所用載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的目標(biāo)物種。對(duì)于一定的目標(biāo)物種，可優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化中常規(guī)應(yīng)用的選擇標(biāo)記包括賦予卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptⅡ基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19:259-268(1982)；Benvan等人，自然304:184-187(1983))、賦予除草劑phosphinothricin抗性的bar基因(White等人，核酸研究18:1062(1990),Spencer等人，理論應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor Appl Genet)79:625-631(1990))、賦予抗生素潮霉素抗性的hpt基因(Blochinger和Diggelmann，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell Biol)4:2929-2931)和賦予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志2(7):1099-1104(1983))。
多種載體可用于應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的轉(zhuǎn)化。它們一般攜帶至少一種T-DNA邊界序列，并且包括如pbIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ的載體。以下描述了兩種典型載體的構(gòu)建。
pCIB200和pCIB2001的構(gòu)建二元載體pCIB200和pCIB2001用于構(gòu)建農(nóng)桿菌使用的重組載體，按以下方法構(gòu)建。通過(guò)用NarⅠ消化pTJS75產(chǎn)生pTJS75kan(Schmidhauser和Helinski，細(xì)菌學(xué)雜志(JBacteriol.)164:446-455(1985))，它使得四環(huán)素抗性基因被切除，隨后插入一個(gè)來(lái)源于pUC4K的攜帶NPTⅡ的AccⅠ片段(Messing和Vierra，基因19:259-268(1982)；Bevan等人，自然304:184-187(1983)；McBride等人，植物分子生物學(xué)14:266-276(1990))。XhoⅠ接頭與pCIB7的EcoRⅤ片段連接，此片段包含左和右T-DNA邊界、植物選擇性nos/nptⅡ嵌合基因和pUC多接頭(Rothstein等人，基因53:153-161(1987))，將XhoⅠ消化的片段克隆到SalⅠ消化的pTJS75kan中產(chǎn)生pCIB200(參見(jiàn)EP 0332104，實(shí)施例19)。pCIB200包含下列單一多接頭限制位點(diǎn)EcoRⅠ、SstⅠ、KpnⅠ、BglⅡ、XbaⅠ和SalⅠ。pCIB2001是pCIB200的衍生物，它是通過(guò)向多接頭中插入其他限制位點(diǎn)而產(chǎn)生的。pCIB2001多接頭中的單一限制位點(diǎn)是EcoRⅠ、SstⅠ、KpnⅠ、BglⅡ、XbaⅠ、SalⅠ、MluⅠ、BclⅠ、AvrⅡ、ApaⅠ、HpaⅠ和StuⅠ。除包含這些單一限制位點(diǎn)外，pCIB2001也有植物和細(xì)菌卡那霉素的選擇性、用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的左和右T-DNA邊界、在大腸桿菌和其他宿主之間轉(zhuǎn)移的RK2衍生的trfA功能以及也是來(lái)源于RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適用于包含其自身調(diào)節(jié)信號(hào)的植物表達(dá)盒的克隆。
pCIB10及其潮霉素篩選衍生物的構(gòu)建二元載體pCIB10含有用于在植物中篩選的編碼卡那霉素抗性的基因、T-DNA右和左邊界序列，并且引入了寬宿主范圍的質(zhì)粒pRK252的序列，使其可在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制。Rothstein等人(基因53:153-161(1987))描述了它的構(gòu)建。已經(jīng)構(gòu)建了pCIB10的多種衍生物，它們引入了Gritz等人(基因25:179-188(1983))描述的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。這些衍生物使得能在僅有潮霉素(pCIB743)或同時(shí)有潮霉素和卡那霉素(pCIB715、pCIB717)時(shí)篩選轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
不使用根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化避免了對(duì)所選的轉(zhuǎn)化載體中T-DNA序列的需要，所以除如上描述的包含T-DNA序列的載體外，可使用缺乏這些序列的載體。不依賴(lài)于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過(guò)粒子轟擊、原生質(zhì)體攝取(如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇主要取決于對(duì)所轉(zhuǎn)化的種的優(yōu)選。下面，描述了某些典型載體的構(gòu)建。
pCIB3064的構(gòu)建pCIB3064是一種pUC衍生載體，適用于與除草劑basta(或phosphino thricin)篩選結(jié)合的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。質(zhì)粒pCIB246包含與大腸桿菌GUS基因有效融合的CaMV 35S啟動(dòng)子和CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子，在PCT公開(kāi)的申請(qǐng)WO 93/07278中有描述。該載體的35S啟動(dòng)子含有兩個(gè)ATG序列的起始位點(diǎn)5′端。這些位點(diǎn)用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)突變以去除ATG，產(chǎn)生SspⅠ和PvuⅡ限制位點(diǎn)。新限制位點(diǎn)距唯一的SalⅠ位點(diǎn)96和37bp遠(yuǎn)，距實(shí)際起始位點(diǎn)101和42bp遠(yuǎn)。產(chǎn)生的pCIB246的衍生物命名為pCIB3025。然后通過(guò)用SalⅠ和SacⅠ消化從pCIB3025上切下GUS基因，末端變?yōu)槠蕉饲以龠B接產(chǎn)生質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82從John Innes Centre,Norwich獲得，切下含有產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)bar基因的400bp SmaⅠ片段，將其插入pCIB3060的HpaⅠ位點(diǎn)(Thompson等人，歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志6:2519-2523(1987))。這產(chǎn)生了pCIB3060，它含有位于CaMV 35S啟動(dòng)子和用于除草劑篩選的終止子控制下的bar基因、氨芐青霉素抗性基因(用于在大腸桿菌中篩選)和具有單一SphⅠ、PstⅠ、HindⅢ、BamHⅠ位點(diǎn)的多接頭。該載體適用于含有自身調(diào)節(jié)信號(hào)的植物表達(dá)盒的克隆。
pSOG19和pSOG35的構(gòu)建pSOG35是一種應(yīng)用大腸桿菌基因二氫葉酸還原酶(DHFR)作為選擇性標(biāo)記提供氨甲喋呤抗性的轉(zhuǎn)化載體。用PCR擴(kuò)增35S啟動(dòng)子(～800bp)、玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(～550bp)和pSOG10的18bp GUS非翻譯前導(dǎo)序列。編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶Ⅱ型基因的250bp片段也用PCR擴(kuò)增，這兩個(gè)PCR片段與包含pUC19載體骨架和胭脂氨酸合酶終止子的pBI221(Clontech)的SacⅠ-PstⅠ片段裝配。這些片段的裝配產(chǎn)生pSOG19，它含有與內(nèi)含子6序列融合的35S啟動(dòng)子、GUS前導(dǎo)序列、DHFR基因和胭脂氨酸合酶終止子。用玉米萎黃病斑點(diǎn)病毒(MCMV)的前導(dǎo)序列替換pSOG19的GUS前導(dǎo)序列產(chǎn)生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶氨芐青霉素抗性的pUC基因，并且具有可用于外源序列克隆的HindⅢ、SphⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)。
首先將準(zhǔn)備在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的基因序列裝配于位于適當(dāng)啟動(dòng)子之后和適當(dāng)轉(zhuǎn)錄終止子上游的表達(dá)盒中。然后可將這些表達(dá)盒容易地轉(zhuǎn)移至上述植物轉(zhuǎn)化載體中。
在表達(dá)盒中使用的啟動(dòng)子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的空間和時(shí)間表達(dá)模式。所選的啟動(dòng)子將在特定的細(xì)胞型(如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮細(xì)胞)或在特定組織或器官(如根、葉或花)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，此選擇將反映酶生物合成的希望的定位。另外，所選的啟動(dòng)子可在光誘導(dǎo)的或其他時(shí)間調(diào)節(jié)啟動(dòng)子之下引導(dǎo)基因的表達(dá)。另一種(并優(yōu)選的)選擇是，所選的啟動(dòng)子可被外部刺激如特異化學(xué)誘導(dǎo)物的施用或創(chuàng)傷誘導(dǎo)。這將提供僅當(dāng)希望時(shí)才誘導(dǎo)海藻糖生物合成基因轉(zhuǎn)錄的可能性。
多種轉(zhuǎn)錄終止子均可在表達(dá)盒中使用。它們負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因之外的轉(zhuǎn)錄終止和其正確的聚腺苷酸化。合適的和已知在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄終止子包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子、豌豆rbcS E9終止子。它們可在單子葉植物和雙子葉植物中使用。
已發(fā)現(xiàn)許多序列能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達(dá)，這些序列可與本發(fā)明的基因結(jié)合使用以增強(qiáng)其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。
多種內(nèi)含子序列顯示能增強(qiáng)表達(dá)，尤其在單子葉植物細(xì)胞中的表達(dá)。例如，發(fā)現(xiàn)當(dāng)引入玉米細(xì)胞時(shí)，玉米Adh1基因的內(nèi)含子顯著增強(qiáng)位于同源啟動(dòng)子之下的野生型基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1特別有效，且增強(qiáng)在與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達(dá)(Callis等人，基因發(fā)育(Genes Develep)1:1183-1200(1987))。在相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，玉米青銅1基因的內(nèi)含子在增強(qiáng)表達(dá)方面具有相似的效果。內(nèi)含子序列已被常規(guī)引入植物轉(zhuǎn)化載體中，一般在非翻譯前導(dǎo)序列中。
已知多種由病毒衍生的非翻譯前導(dǎo)序列也可增強(qiáng)表達(dá)，且其在雙子葉植物細(xì)胞中特別有效。特別是，煙草花葉病毒(TMV,“Ω-序列”)、玉米萎黃病斑點(diǎn)病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的前導(dǎo)序列在增強(qiáng)表達(dá)方面已證明有效(如Gallie等人，核酸研究15:8693-8711(1987)；Skuzeski等人，植物分子生物學(xué)15:65-79(1990))。
已知植物中存在導(dǎo)向基因產(chǎn)物的多種機(jī)制，也已比較詳細(xì)地表征了控制這些機(jī)制作用的序列。例如，基因產(chǎn)物向葉綠體的導(dǎo)向由在多種蛋白質(zhì)氨基末端發(fā)現(xiàn)的信號(hào)序列控制，該信號(hào)序列在葉綠體輸入期間被切除產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)(如，Comai等人，生物化學(xué)雜志263:15104-15109(1988))。這些信號(hào)序列可與異源基因產(chǎn)物融合，實(shí)現(xiàn)異源產(chǎn)物向葉綠體中的輸入(van den Broeck等人，自然313:358-363(1985))?？蓮木幋aRUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶、GS2蛋白和已知定位于葉綠體的許多其他蛋白質(zhì)的cDNA的5′末端分離編碼適當(dāng)信號(hào)序列的DNA。
其他基因產(chǎn)物定位于其他細(xì)胞器如線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體(如Unger等人，植物分子生物學(xué)13:411-418(1989))。也可使用編碼這些產(chǎn)物的cDNA完成異源基因產(chǎn)物向這些細(xì)胞器的導(dǎo)向。這些序列的實(shí)例包括核編碼的ATP酶和線(xiàn)粒體特異的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同工酶。Rogers等人(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)82:6512-6516(1985))描述了對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)體的導(dǎo)向。
另外，已經(jīng)表征了使基因產(chǎn)物導(dǎo)向于其他細(xì)胞區(qū)室的序列。氨基端序列負(fù)責(zé)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)外體的導(dǎo)向和從糊粉細(xì)胞的胞外分泌(Koehler和Ho，植物細(xì)胞2:769-783(1990))。另外，氨基端序列聯(lián)合羧基端序列負(fù)責(zé)基因產(chǎn)物的液泡導(dǎo)向(Shinshi等人，植物分子生物學(xué)14:357-368(1990))。
通過(guò)將上述適當(dāng)導(dǎo)向序列與目的轉(zhuǎn)基因序列融合，可以將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物引導(dǎo)至任一細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室中。例如，為了葉綠體導(dǎo)向，RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的葉綠體信號(hào)序列與轉(zhuǎn)基因的氨基端ATG在框架內(nèi)融合。所選的信號(hào)序列應(yīng)該包含已知的切割位點(diǎn)，構(gòu)建的融合體應(yīng)考慮切割所需的切割位點(diǎn)之后的任何氨基酸。在某些情況中，可通過(guò)在切割位點(diǎn)與轉(zhuǎn)基因ATG之間添加少量氨基酸，或替換轉(zhuǎn)基因序列內(nèi)的某些氨基酸來(lái)滿(mǎn)足這一需要。使用(Bartlett等人，在Edelmann等人(編)《葉綠體分子生物學(xué)之方法》，Elsevier.第1081-1091頁(yè)(1982)；Wasmann等人，分子普通遺傳學(xué)205:446-453(1986))描述的技術(shù)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的體外翻譯，隨后是體外葉綠體攝取，能測(cè)試為葉綠體輸入而構(gòu)建的融合體的葉綠體攝取的效能。這些構(gòu)建技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，并且同樣可用于線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體。海藻糖生物合成基因所需的導(dǎo)向選擇將取決于作為給定途徑的起點(diǎn)所需的前體的細(xì)胞定位。這通常是胞質(zhì)的或葉綠體的，盡管某些情況中可能是線(xiàn)粒體的或過(guò)氧化物酶體的。
上述細(xì)胞導(dǎo)向機(jī)制不僅可與其同源啟動(dòng)子結(jié)合使用，而且可與異源啟動(dòng)子結(jié)合使用，從而實(shí)現(xiàn)在啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的特定細(xì)胞導(dǎo)向目的，該啟動(dòng)子具有與衍生導(dǎo)向信號(hào)的啟動(dòng)子不同的表達(dá)模式。
本發(fā)明包括海藻糖生物合成基因在植物中可表達(dá)的任一啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下的表達(dá)，而不論啟動(dòng)子的來(lái)源如何。
此外，本發(fā)明還包括任一植物可表達(dá)的啟動(dòng)子與海藻糖生物合成基因表達(dá)所需或選擇的任何其他序列的結(jié)合使用。這些序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)表達(dá)的外部序列(如內(nèi)含子[如Adh內(nèi)含子1]、病毒序列[如TMV-Ω])、以及旨在將基因產(chǎn)物導(dǎo)向于特定細(xì)胞器和細(xì)胞區(qū)室的序列。
合適的植物可表達(dá)的啟動(dòng)子是那些組成型表達(dá)的啟動(dòng)子，如CaMV35S啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或遍在蛋白啟動(dòng)子。
含有“雙”35S啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建在公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0392225(實(shí)施例23)中有述。pCGN1761含有“雙”35S啟動(dòng)子和tml轉(zhuǎn)錄終止子和在啟動(dòng)子與終止子之間的唯一EcoRⅠ位點(diǎn)，并且具有pUC型骨架。構(gòu)建了pCGN1761的一種衍生物，其具有一個(gè)除了已有的EcoRⅠ位點(diǎn)之外還包含NotⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)的修飾過(guò)的多接頭。該衍生物被命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于其多接頭內(nèi)cDNA序列或基因序列(包括微生物開(kāi)放閱讀框序列)的克隆，其目的是在35S啟動(dòng)子控制下在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。該結(jié)構(gòu)的完整的35S啟動(dòng)子-基因序列-tml終止子盒可被從啟動(dòng)子5’側(cè)的HindⅢ、SphⅠ、SalⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)以及終止子3’側(cè)的XbaⅠ、BamHⅠ和BglⅠ位點(diǎn)切割，用于如上所述向轉(zhuǎn)化載體中的轉(zhuǎn)移。此外，通過(guò)用HindⅢ、SphⅠ、SalⅠ、XbaⅠ或PstⅠ進(jìn)行5′切割，及用任何多接頭限制位點(diǎn)(EcoRⅠ、NotⅠ或XhoⅠ)進(jìn)行3′切割以替換為另一啟動(dòng)子，能去除雙35S啟動(dòng)子片段。
對(duì)于本部分所述的任何結(jié)構(gòu)，可通過(guò)引入能增強(qiáng)翻譯的序列進(jìn)行克隆位點(diǎn)周?chē)男揎?。?dāng)將來(lái)源于微生物的基因引入植物表達(dá)盒時(shí)這種修飾特別有用，因?yàn)檫@些基因可能不包含適于植物中翻譯起始的與起始甲硫氨酸相鄰的序列。在將來(lái)源于微生物的基因克隆到植物表達(dá)盒的ATG處的情況中，可能需要修飾其插入位點(diǎn)以?xún)?yōu)化表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化翻譯起始位點(diǎn)對(duì)pCGN1761ENX的修飾以實(shí)施例的形式描述，引入用于植物表達(dá)的幾種優(yōu)化序列之一(如Joshi，出處同前)。在本發(fā)明范圍內(nèi)能適當(dāng)使用的其他植物可表達(dá)啟動(dòng)子是如下文所述的化學(xué)調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。例如，本部分描述了用所選的任一啟動(dòng)子對(duì)pCGN1761ENX中雙35S啟動(dòng)子的替換；化學(xué)調(diào)節(jié)型PR-1a啟動(dòng)子以實(shí)施例的形式在美國(guó)專(zhuān)利5,614,395中描述，在此完全引用作為參考，以及化學(xué)調(diào)節(jié)型擬南芥PR-1啟動(dòng)子。選擇的啟動(dòng)子優(yōu)選地用限制酶從其來(lái)源切下，但另外也可用攜帶適當(dāng)末端限制位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在靶載體中克隆擴(kuò)增的啟動(dòng)子之后，應(yīng)該對(duì)啟動(dòng)子重新測(cè)序以檢查擴(kuò)增錯(cuò)誤。從質(zhì)粒pCIB1004(見(jiàn)EP 0332104，實(shí)施例21，構(gòu)建)上切下化學(xué)調(diào)節(jié)型煙草PR-1a啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒pCGN1761ENX中。用NcoⅠ酶切pCIB1004，產(chǎn)生的線(xiàn)性片段的3′突出端通過(guò)T4 DNA聚合酶處理提供平端。然后用HindⅢ酶切該片段，凝膠純化所得的包含PR-1a啟動(dòng)子的片段，并克隆到已去除雙35S啟動(dòng)子的pCGN1761ENX中。實(shí)現(xiàn)方法是用XhoⅠ酶切，用T4 DNA聚合酶產(chǎn)生平端，隨后用HindⅢ酶切，分離較大的含有載體終止子的片段，其中克隆有pCIB1004啟動(dòng)子片段。這產(chǎn)生了一種pCGN1761ENX衍生物，它具有PR-1a啟動(dòng)子和tml終止子和具有唯一EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn)的間隔多接頭?？蓪⑦x擇的海藻糖生物合成基因插入該載體中，隨后可將融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)轉(zhuǎn)移到選擇的任一轉(zhuǎn)化載體中，包括本申請(qǐng)中所述的轉(zhuǎn)化載體。
可使用多種化學(xué)調(diào)節(jié)劑來(lái)誘導(dǎo)海藻糖生物合成編碼序列在根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)。在本公開(kāi)內(nèi)容的上下文中，“化學(xué)調(diào)節(jié)劑”包括已知在植物中是PR-1a啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的化學(xué)試劑，或其相關(guān)的衍生物。用于本發(fā)明的化學(xué)可誘導(dǎo)海藻糖生物合成基因的一組優(yōu)選調(diào)節(jié)劑基于苯并-1,2,3-噻二唑(BTH)結(jié)構(gòu)，包括但不限于下列類(lèi)型的化合物苯并-1,2,3-噻二唑羧酸、苯并-1,2,3-噻二唑硫代羧酸、氰基苯并-1,2,3-噻二唑、苯并-1,2,3-噻二唑羧酸胺、苯并-1,2,3-噻二唑羧酸酰肼、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸、苯并-1,2,3-噻二唑-7-硫代羧酸、7-氰基-苯并-1,2,3-噻二唑、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸胺、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸酰肼、苯并-1,2,3-噻二唑羧酸烷基酯，其中烷基含有一至六個(gè)碳原子、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸甲酯、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸正丙基酯、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸芐酯、苯并-1,2,3-噻二唑-7-羧酸仲丁基酰肼，及其合適的衍生物。其他化學(xué)誘導(dǎo)物包括，例如，苯甲酸、水楊酸(SA)、聚丙烯酸及其取代的衍生物；合適的取代物包括低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基和鹵素。用于本發(fā)明的化學(xué)可誘導(dǎo)DNA序列的另一組調(diào)節(jié)劑基于吡啶羧酸結(jié)構(gòu)，如異煙酸結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地是鹵代異煙酸結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的是二氯異煙酸及其衍生物，如低級(jí)烷基酯。該類(lèi)化合物的合適的調(diào)節(jié)劑是，例如，2,6-二氯異煙酸(INA)及其低級(jí)烷基酯，尤其是甲酯。
用肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子也能實(shí)現(xiàn)組成型表達(dá)。已知肌動(dòng)蛋白的幾個(gè)同種型能在大多數(shù)細(xì)胞型中表達(dá)，因此肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子的良好選擇。尤其是，已經(jīng)克隆和表征了水稻ActⅠ基因的啟動(dòng)子(McElroy等人，植物細(xì)胞2:163-171(1990))。發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子的1.3kb片段包含在水稻原生質(zhì)體中表達(dá)所需的所有調(diào)節(jié)元件。此外，已經(jīng)構(gòu)建了基于A(yíng)ctl啟動(dòng)子的特別用于單子葉植物的許多表達(dá)載體(McElroy等人，分子普通遺傳學(xué)231:150-160(1991))。它們摻入了Actl-內(nèi)含子1、Adhl 5′側(cè)翼序列和(玉米醇脫氫酶基因的)Adhl-內(nèi)含子1和CaMV 35S啟動(dòng)子的序列。顯示最高表達(dá)的載體是35S和Actl內(nèi)含子或Actl 5′側(cè)翼序列和Actl內(nèi)含子的融合體。(GUS報(bào)道基因的)起始ATG附近序列的優(yōu)化也能增強(qiáng)表達(dá)。McElroy等人(分子普通遺傳學(xué)231:150-160(1991))描述的啟動(dòng)子表達(dá)盒可被方便地修飾以用于海藻糖生物合成基因的表達(dá)，尤其適用于單子葉植物宿主中。例如，可從McElroy結(jié)構(gòu)中去除包含啟動(dòng)子的片段，用來(lái)替換pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子，然后可用于特異基因序列的插入。然后可將這樣構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)移到合適的轉(zhuǎn)化載體中。在個(gè)別報(bào)道中，也發(fā)現(xiàn)含有第一個(gè)內(nèi)含子的水稻Actl啟動(dòng)子引導(dǎo)在培養(yǎng)的大麥細(xì)胞中的高表達(dá)(Chibbar等人，植物細(xì)胞報(bào)道(Plant Cell Rep.)12:506-509(1993))。
遍在蛋白是已知在許多細(xì)胞型中積累的另一種基因產(chǎn)物，已從幾個(gè)種中克隆了它的啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因植物中用于組成型表達(dá)(如向日葵-Binet等人，植物科學(xué)79:87-94(1991)，玉米-Christensen等人，植物分子生物學(xué)12:619-632(1989))。玉米遍在蛋白啟動(dòng)子已在轉(zhuǎn)基因單子葉系統(tǒng)中加以研究，并且其序列和為單子葉植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建的載體公開(kāi)于專(zhuān)利公開(kāi)文本EP 0342926(Lubrizol)中。此外，Taylor等人(植物細(xì)胞報(bào)道12:491-495(1993))描述了一種載體(pAHC25)，它包含玉米遍在蛋白啟動(dòng)子和第一個(gè)內(nèi)含子，經(jīng)微粒轟擊引入時(shí)其在許多單子葉植物細(xì)胞懸液中有高活性。遍在蛋白啟動(dòng)子適用于海藻糖生物合成基因在轉(zhuǎn)基因植物尤其單子葉植物中的表達(dá)。合適的載體是pAHC25的衍生物或本申請(qǐng)中描述的通過(guò)引入合適的遍在蛋白啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子序列被修飾的任何轉(zhuǎn)化載體。
本發(fā)明的酶的另一種表達(dá)模式是根表達(dá)。一種合適的根啟動(dòng)子是deFramond(FEBS 290:103-106(1991))描述、也在公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0452269(Ciba-Geigy)中描述的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子被轉(zhuǎn)移到合適的載體如pCGN1761ENX中，用于插入海藻糖生物合成基因及隨后將完整的啟動(dòng)子-基因-終止子盒轉(zhuǎn)移到目的轉(zhuǎn)化載體中。
創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也適用于海藻糖生物合成基因的表達(dá)。已經(jīng)描述了許多這樣的啟動(dòng)子(例如，Xu等人，植物分子生物學(xué)22:573-588(1993),Logemann等人，植物細(xì)胞1:151-158(1989),Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學(xué)22:783-792(1993),Firek等人，植物分子生物學(xué)22:129-142(1993),Warner等人，植物雜志3:191-201(1993))，并且均都適用于本發(fā)明。Logemann等人描述了雙子葉馬鈴薯Wunl基因的5′上游序列。Xu等人證明雙子葉植物馬鈴薯的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(pin2)在單子葉植物水稻中有活性。此外，Rohrmeier和Lehle也描述了為創(chuàng)傷誘導(dǎo)型且可用于使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離同源啟動(dòng)子的玉米Wipl cDNA的克隆。相似地，F(xiàn)irek等人和Warner等人描述了單子葉植物藥用蘆筍(Asparagus officinalis)的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型基因，該基因在局部創(chuàng)傷和病原體侵入部位表達(dá)。使用本領(lǐng)域眾所周知的克隆技術(shù)，可將這些啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移到合適的載體中，與本發(fā)明的海藻糖生物合成基因融合，并用來(lái)在植物創(chuàng)傷部位表達(dá)這些基因。
專(zhuān)利申請(qǐng)WO 93/07278(Ciba-Geigy)描述了玉米trpA基因的分離，該基因優(yōu)先在木髓細(xì)胞中表達(dá)。介紹了該基因序列和從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)延伸至-1726的啟動(dòng)子。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，可將此啟動(dòng)子或其部分轉(zhuǎn)移到載體如pCGN1761中，能替換35S啟動(dòng)子，并用來(lái)以木髓偏好的方式引導(dǎo)外源基因的表達(dá)。實(shí)際上，含有木髓偏好的啟動(dòng)子或其部分的片段可被轉(zhuǎn)移到任何載體中并為應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物而修飾。
Hudspeth和Grula(植物分子生物學(xué)12:579-589(1989))曾描述了一種編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，該基因的啟動(dòng)子能用來(lái)引導(dǎo)任一基因以葉特異的方式在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
Chen和Jagendorf(生物化學(xué)雜志268:2363-2367(1993))曾描述了用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)輸入異源轉(zhuǎn)基因的成功應(yīng)用。所使用的肽是Nicotiana plumbaginifolia的rbcS基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Poulsen等人，分子普通遺傳學(xué)205:193-200(1986))。使用限制酶DraⅠ和SphⅠ，或Tsp509Ⅰ和SphⅠ，能從質(zhì)粒prbcS-8B上切下編碼該轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，操作后與上述任何結(jié)構(gòu)一起使用。DraⅠ-SphⅠ片段從相對(duì)于起始rbcS ATG的-58延伸至，并且包括，緊接輸入切割位點(diǎn)之后的成熟肽的第一個(gè)氨基酸(也是甲硫氨酸)，而Tsp509Ⅰ-SphⅠ片段從相對(duì)于起始rbcS ATG的-8延伸至，并且包括，成熟肽的第一個(gè)氨基酸。因此，可將這些片段適當(dāng)?shù)夭迦胨x的任一表達(dá)盒的多接頭中，產(chǎn)生與所選啟動(dòng)子(如35S、PR-1a、肌動(dòng)蛋白、遍在蛋白等)的非翻譯前導(dǎo)序列融合的轉(zhuǎn)錄融合基因，而能使海藻糖生物合成基因插入轉(zhuǎn)運(yùn)肽下游的正確的融合基因中。這種構(gòu)建在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。例如，DraⅠ末端本來(lái)就是平端，而5′Tsp509Ⅰ位點(diǎn)可經(jīng)T4聚合酶處理產(chǎn)生平端，或者另外可與接頭或銜接頭序列連接，以便于它與所選擇的啟動(dòng)子融合。可照此保留3′SphⅠ位點(diǎn)，或者另外可與接頭序列的銜接頭連接，以便于它插入所選擇的載體，這樣使可得的合適的限制位點(diǎn)可用于隨后所選的海藻糖生物合成基因的插入。理想的是保留SphⅠ位點(diǎn)的ATG，并包含所選的海藻糖生物合成基因的第一個(gè)ATG。Chen和Jagendorf提供了用于葉綠體輸入的理想切割的共有序列，在所有情況中甲硫氨酸優(yōu)選地位于成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)位點(diǎn)。在隨后的位點(diǎn)上有更多的變化，并且氨基酸可能不如此關(guān)鍵。在任何情況中，可用Bartlett等人(在Edelmann等人(編)《葉綠體分子生物學(xué)方法》，Elsevier,1081-1091頁(yè)(1982))和Wasmann等人(分子普通遺傳學(xué)205:446-453(1986))所述的方法，評(píng)估融合構(gòu)建體的體外輸入效率。一般而言，最好的方法可能是用在氨基端未修飾的所選海藻糖生物合成基因產(chǎn)生融合基因，并僅當(dāng)融合基因顯然不以高效率輸入葉綠體時(shí)才引入修飾，在這種情況中可根據(jù)已有的文獻(xiàn)(Chen和Jagendorf；Wasmann等人；Ko和Ko，生物化學(xué)雜志267:13910-13916(1992))進(jìn)行修飾。
通過(guò)將prbcS-8B的DraⅠ-SphⅠ轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼片段轉(zhuǎn)移至克隆載體pCGN1761ENX/Sph-中構(gòu)建一種優(yōu)選的載體。該質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切，經(jīng)T4 DNA聚合酶處理使末端變?yōu)槠蕉?。用SphⅠ酶切質(zhì)粒prbc-8B，連接至退火的分子銜接頭。通過(guò)T4激酶處理使所得產(chǎn)物5′端磷酸化。隨后用DraⅠ酶切，釋放連接于上述修飾載體的平端前EcoRⅠ位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼片段。通過(guò)測(cè)序鑒定帶有方向?yàn)椴迦肫?′端的與35S啟動(dòng)子3′端相鄰的克隆。這些克隆攜帶35S前導(dǎo)序列與rbcS-8A啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的DNA融合基因，其從相對(duì)于rbcS ATG的-58延伸至成熟蛋白質(zhì)的ATG，并且在此位點(diǎn)包含唯一的SphⅠ位點(diǎn)、一個(gè)新產(chǎn)生的EcoRⅠ位點(diǎn)和已有的pCGN1761ENX的NotⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)。這個(gè)新載體被命名為pCGN1761/CT。為了方便構(gòu)建，可能需要改變克隆基因的第二個(gè)氨基酸，然而在幾乎所有情況中，與標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)誘變一起使用PCR，能構(gòu)建在成熟蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn)和第一個(gè)甲硫氨酸附近的任一希望的序列。
另一種優(yōu)選載體的構(gòu)建方法是，用prbcS-8A的BamHⅠ-SphⅠ片段替換pCGN1761ENX的雙35S啟動(dòng)子，前者包含全長(zhǎng)的光調(diào)節(jié)rbcS-8A啟動(dòng)子，它從-1038(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄開(kāi)始位點(diǎn))直到成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)甲硫氨酸。用PstⅠ和EcoRⅠ酶切帶有破壞的SphⅠ位點(diǎn)的經(jīng)修飾的pCGN1761，并用T4 DNA聚合酶處理產(chǎn)生平端。用SphⅠ酶切prbcS-8A，連接于上述序列的退火的分子銜接頭上。所得產(chǎn)物經(jīng)T4激酶處理使5′-端磷酸化。隨后用BamHⅠ酶切釋放啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)運(yùn)肽，它包含經(jīng)T4 DNA聚合酶處理產(chǎn)生BamHⅠ平端的片段。將如此產(chǎn)生的啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)運(yùn)肽片段克隆到制備的pCGN1761ENX載體中，產(chǎn)生一種包含rbcS-8A啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)運(yùn)肽并在用來(lái)插入異源基因的切割位點(diǎn)處有一個(gè)SphⅠ位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。此外，SphⅠ位點(diǎn)下游有EcoRⅠ(重新產(chǎn)生的)、NotⅠ和XhoⅠ克隆位點(diǎn)。這個(gè)結(jié)構(gòu)被命名為pCGN1761rbcS/CT。
可以應(yīng)用其他來(lái)源(單子葉和雙子葉的)和其他基因的其他GS2葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列進(jìn)行相似的操作。另外，可按相似的方法來(lái)完成向其他亞細(xì)胞區(qū)室如線(xiàn)粒體的導(dǎo)向。
對(duì)雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)和不需要農(nóng)桿菌的技術(shù)。非農(nóng)桿菌的技術(shù)包括原生質(zhì)體或細(xì)胞對(duì)外源遺傳物質(zhì)的直接攝取。這可通過(guò)PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、粒子轟擊介導(dǎo)的運(yùn)輸或顯微注射來(lái)完成。這些技術(shù)的實(shí)例描述于Paszkowski等人，歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志3:2717-2722(1984)，Potrykus等人，分子普通遺傳學(xué)199:169-177(1985),Reich等人，生物技術(shù)4:1001-1004(1986)，和Klein等人，自然327:70-73(1987)。在每種情況中，用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生為整個(gè)植物。
由于其高轉(zhuǎn)化效率和對(duì)許多不同種的廣泛應(yīng)用，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物的優(yōu)選技術(shù)。用農(nóng)桿菌常規(guī)轉(zhuǎn)化的許多作物種包括煙草、蕃茄、向日葵、棉花、油籽油菜、馬鈴薯、大豆、苜蓿和白楊(EP 0317511(棉花),EP 0249432(蕃茄，Calgene),WO 87/07299(蕓苔屬，Calgene),US 4,795,855(白楊))。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化一般包括將攜帶目的外源DNA的二元載體(如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移至合適的農(nóng)桿菌菌株中，這依賴(lài)于在共生Ti質(zhì)粒上或染色體上由宿主農(nóng)桿菌菌株攜帶的vir基因的完整性(如對(duì)于pCIB200和pCIB2001的CIB542株(Uknes等人，植物細(xì)胞5:159-169(1993))。重組二元載體向農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)移通過(guò)三親本交配方法完成，使用攜帶重組二元載體的大腸桿菌、攜帶質(zhì)粒如pRK2013并能將重組二元載體轉(zhuǎn)移至目標(biāo)農(nóng)桿菌株的輔助大腸桿菌菌株。另外，可通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化將重組二元載體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中(Hofgen和Willmitzer，核酸研究16:9877(1988))。
用重組農(nóng)桿菌對(duì)目標(biāo)植物種的轉(zhuǎn)化通常包括農(nóng)桿菌與植物外植體的共培育，且依照本領(lǐng)域眾所周知的方案。轉(zhuǎn)化的組織在帶有在二元質(zhì)粒T-DNA邊界之間存在的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的選擇培養(yǎng)基上再生。
大多數(shù)單子葉植物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)也已成為常規(guī)。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔技術(shù)直接將基因轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)體中，以及使用粒子轟擊轉(zhuǎn)移到愈傷組織中?？捎脝畏NDNA或多種DNA(即共轉(zhuǎn)化)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這兩種方法都適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)在于避免了復(fù)雜的載體構(gòu)建，以及產(chǎn)生具有目的基因和選擇性標(biāo)記的非連鎖基因座的轉(zhuǎn)基因植物，如果希望的話(huà)，能使選擇性標(biāo)記在后代中去除。然而，使用共轉(zhuǎn)化的一個(gè)缺點(diǎn)是個(gè)別DNA種整合入基因組中的頻率低于100％(Schocher等人，生物技術(shù)4:1093-1096(1986))。
專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0292435(Ciba-Geigy)、EP 0392225(Ciba Geigy)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)描述了從玉米的一個(gè)優(yōu)良近交系制備愈傷組織和原生質(zhì)體、用PEG或電穿孔法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、以及從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉米植物的技術(shù)。Gordon-Kamm等人(植物細(xì)胞2:603-618(1990))和Fromm等人(生物技術(shù)8:833-839(1990))發(fā)表了使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化A188-衍生的玉米株系的技術(shù)。此外，申請(qǐng)WO 93/07278(Ciba-Geigy)和Koziel等人(生物技術(shù)11:194-200(1993))描述了經(jīng)粒子轟擊轉(zhuǎn)化玉米的優(yōu)良近交系的技術(shù)。該技術(shù)使用傳粉后14-15天從玉米穗上切下的1.5-2.5mm長(zhǎng)的未成熟玉米胚和PDS-1000He Biolistics裝置用于轟擊。
水稻的轉(zhuǎn)化也可使用應(yīng)用原生質(zhì)體或粒子轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)進(jìn)行。對(duì)于Japonica型和Indica型的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已有描述(Zhang等人，植物細(xì)胞報(bào)道7:379-384(1988)；Shimamoto等人，自然338:274-277(1989)；Datta等人，生物技術(shù)8:736-740(1990))。使用粒子轟擊均可常規(guī)轉(zhuǎn)化這兩種類(lèi)型(Christou等人，生物技術(shù)9:957-962(1991))。
專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0 332 581(Ciba-Geigy)描述了Pooideae原生質(zhì)體的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)。這些技術(shù)允許鴨茅屬(Dactylis)和小麥的轉(zhuǎn)化。此外，Vasil等人(生物技術(shù)10:667-674(1992))描述了應(yīng)用粒子轟擊轉(zhuǎn)入C型長(zhǎng)期可再生愈傷組織細(xì)胞的小麥轉(zhuǎn)化，Vasil等人(生物技術(shù)11:1553-1558(1993))和Weeks等人(植物生理(PlantPhysiol.)102:1077-1084(1993))也描述了應(yīng)用粒子轟擊未成熟胚和未成熟胚衍生的愈傷組織的小麥轉(zhuǎn)化。然而，一種優(yōu)選的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過(guò)粒子轟擊未成熟胚轉(zhuǎn)化小麥，并包括基因輸運(yùn)前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。轟擊前，將任意數(shù)量的胚(長(zhǎng)0.75-1mm)置于含3％蔗糖(Murashiga和Skoog,Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))和3mg/l 2,4-D的MS培養(yǎng)基上，用于可在暗處進(jìn)行的體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。在選定的轟擊日，從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出胚，將其置于滲壓劑上(即含有希望濃度一般是15％的蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。將胚質(zhì)壁分離2-3小時(shí)，然后轟擊。一般是每個(gè)靶平板二十個(gè)胚，但這不是必需的。按標(biāo)準(zhǔn)方法在微米大小的金顆粒上沉淀合適的攜帶基因的質(zhì)粒(如pCIB3064或pSG35)。每個(gè)胚平板用DuPont Biolistics氦裝置轟擊，使用約1000psi的爆發(fā)壓力，使用標(biāo)準(zhǔn)的80目的篩子。轟擊后，將胚放回暗處回復(fù)約24小時(shí)(仍在滲壓劑上)。24小時(shí)后，從滲壓劑中取出胚，將其放回誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在再生之前放置約一個(gè)月。大約一個(gè)月后，將具有發(fā)育的胚發(fā)生愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中(MS+1mg/l NAA,5mg/l GA)，該培養(yǎng)基另外含有適當(dāng)?shù)倪x擇劑(在pCIB3064的情況中是10mg/l basta，在pSOG35的情況中是2mg/l氨甲喋呤)。約一個(gè)月后，將發(fā)育的苗轉(zhuǎn)移至更大的被稱(chēng)為“GA7s”的無(wú)菌容器中，其中含有半強(qiáng)度的MS、2％蔗糖和相同濃度的選擇劑。EP專(zhuān)利申請(qǐng)0 674 715描述了小麥轉(zhuǎn)化的方法，在此引用作為參考。
描述了來(lái)源于玉米的三種核苷酸序列(實(shí)施例32)。當(dāng)用BLAST檢索(BLASTN 2.0.7[1998年12月21日]，Altschul等人(1997)核酸研究25:3389-3402)比較時(shí)，這些核苷酸序列顯示與其他海藻糖磷酸合酶在DNA和蛋白質(zhì)水平上有高匹配得分和顯著同源性。
用作篩查玉米c-DNA文庫(kù)的探針的片段Be3，與酵母海藻糖磷酸合酶(TPS1，保藏號(hào)Q00764)在氨基酸水平上在堿基519-1之間顯示例如60％的同一性，在堿基831-463之間顯示58％的同一性，兩者都與酵母基因方向相反。Be3與擬南芥海藻糖磷酸合酶(保藏號(hào)Y08568)在氨基酸水平上在堿基471-1之間也顯示89％的同一性，在堿基830-462之間顯示84％的同一性，兩者都與擬南芥基因方向相反。
克隆4.11與Be3在克隆4.11的堿基4-129(Be3的堿基706-831)之間在核苷酸水平上幾乎相同(4個(gè)錯(cuò)配)。克隆6與Be3在克隆6的堿基4-218(Be3的堿基10-224)之間在核苷酸水平上幾乎相同(9個(gè)錯(cuò)配)，方向與Be3相反。克隆9與Be3在克隆9的堿基4-95(Be3的堿基447-568)之間在核苷酸水平上幾乎相同(1個(gè)錯(cuò)配)。
克隆4.11長(zhǎng)1686bp，包含預(yù)測(cè)的1413個(gè)堿基對(duì)的部分編碼序列?？寺?長(zhǎng)1558bp，包含預(yù)測(cè)的1092bp的全長(zhǎng)編碼序列?？寺?長(zhǎng)735bp，包含預(yù)測(cè)的735bp的部分編碼序列。
克隆4.11和克隆6在位點(diǎn)448-1600(克隆4.11)和300-1439(克隆6)之間在核苷酸水平上幾乎相同。
克隆4.11與酵母TPS1有例如55％的氨基酸同一性(堿基4-279)，與大腸桿菌OtsA有44％的同一性(堿基4-282)，與擬南芥海藻糖磷酸合酶有76％的氨基酸同一性(堿基4-1047)和59％的氨基酸同一性(堿基1240-1371)。克隆6與曲霉屬海藻糖磷酸合酶有例如63％的氨基酸同一性(堿基3-311，相反方向)，與酵母TPS1有46％的氨基酸同一性(堿基293-3，相反方向)，與擬南芥海藻糖磷酸合酶有67％的氨基酸同一性(堿基300-998)和86％的氨基酸同一性(堿基3-302，相反方向)。克隆9與酵母TPS1基因有61％的氨基酸同一性(堿基4-96)，與擬南芥海藻糖磷酸合酶有80％的氨基酸同一性(堿基4-96)。
將參照下列詳細(xì)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。這些實(shí)施例的目的僅僅是為了說(shuō)明，除非另外指明而不意在限制。
然后用SpeⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒pUCOTSA，凝膠純化含有OtsA基因5′端的400bp片段，并與事先用XbaⅠ和BamHⅠ消化的pCGN4467連接，獲得含有完整OtsA基因的pCGNOTSA。用NcoⅠ和SacⅠ消化質(zhì)粒pCGNOTSA，凝膠純化包含OtsA基因的1.4kb長(zhǎng)片段，并連接于pJG203的在903bp長(zhǎng)之煙草PR-1a啟動(dòng)子和nos基因終止信號(hào)之間的NcoⅠ和SacⅠ位點(diǎn)(Uknes等人(1993)，植物細(xì)胞5,159-169)。質(zhì)粒pJG203是pBSGus1.2的一種衍生物(Uknes等人(1993)，植物細(xì)胞5,159-169)，包含與GUS基因融合的煙草PR-1a啟動(dòng)子和nos聚腺苷酸化信號(hào)。在pJG203中，通過(guò)用SacⅠ部分消化、補(bǔ)平突出端并再連接，去除在nos聚腺苷酸化信號(hào)末端處的第二個(gè)SacⅠ位點(diǎn)。從而獲得含有與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsA基因的質(zhì)粒pPR1OTSA。實(shí)施例2包含與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的大腸桿菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因的嵌合基因的制備質(zhì)粒pCGN4452(獲自Calgene,Davis,CA)含有受雙35S啟動(dòng)子控制并與tml 3’聚腺苷酸化信號(hào)融合的大腸桿菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因編碼序列(OtsB,Kaasen等人(1994)基因145(1),9-15,EMBL/GenBank保藏號(hào)X69160)(pCGN4452是pCGN1761的一種衍生物，EP 0392225)，用其作為PCR模板，使用一條由左至右的“頂鏈”引物，其在原始GTG起始密碼子之前含有一個(gè)新產(chǎn)生的ATG密碼子，之前為GCC密碼子，從而在A(yíng)TG處產(chǎn)生一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn)，并且包含OstA基因的前23個(gè)堿基(引物TREB+:GTC AGC CAT GGTGAC AGA ACC GTT AAC CGA AAC,SEQ ID No:3),并使用一條與新ATG下游位點(diǎn)181-205同源的由右至左的“底鏈”引物(引物TREB-:GTG CGT CAA GCT CCA CCA TTG AGC,SEQ ID No:4)。按廠(chǎng)商推薦用AmpliTaq DNA聚合酶進(jìn)行該P(yáng)CR反應(yīng)(PerkdnElmer/Roche,Branchburg,NJ),94℃(30s)、40℃(60s)和72℃(30s)五個(gè)循環(huán)，隨后94℃(30s),55℃(60s)和72℃(30s)25個(gè)循環(huán)，這產(chǎn)生一種212bp的產(chǎn)物，它在左端包含一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn)，在右端包含一個(gè)EcoRⅤ位點(diǎn)。用標(biāo)準(zhǔn)方法凝膠純化該片段，用NcoⅠ和EcoRⅤ酶切，并連接于pUC21的NcoⅠ和EcoRⅤ位點(diǎn)，獲得pUCOTSB。
然后用SpeⅠ和EcoRⅤ消化質(zhì)粒pUCOTSB，凝膠純化含有OtsB基因5′端的210bp片段，并與事先用XbaⅠ和EcoRⅤ消化的pCGN4467連接，獲得含有完整OtsB基因的pCGNOTSB。用NcoⅠ和SacⅠ消化質(zhì)粒pCGNOTSB，凝膠純化包含OtsB基因的0.8kb長(zhǎng)片段，并連接于pJG203的在903bp長(zhǎng)之煙草PR-1a啟動(dòng)子和nos基因終止信號(hào)之間的NcoⅠ和SacⅠ位點(diǎn)，產(chǎn)生含有與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsB基因的pPR1OTSB。實(shí)施例3包含與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsA基因和與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsB基因的二元載體的制備用XhoⅠ消化質(zhì)粒pPR1OTSA，其突出端用Klenow DNA聚合酶(Promega,Madison,WI)補(bǔ)平，然后再用SpeⅠ消化。凝膠純化得到的2.6kb長(zhǎng)片段，連接于pPR1OTSB的補(bǔ)平的EcoRⅠ位點(diǎn)和SpeⅠ位點(diǎn)，獲得pPR1OTSAB，其含有與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsA基因和與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsB基因。
用ApaⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒pPR1OTSAB，凝膠純化含有與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsA基因和與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsB基因的4.6kb長(zhǎng)片段，并連接于pBHYGM的ApaⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)，獲得二元載體pEGL502(pBHYGM是一種修飾的pGPTV-Hyg(Becker等人(1992)植物分子生物學(xué)20,1195-1197)載體，它是通過(guò)將含有BfrⅠ/ApaⅠ/ClaⅠ/SmaⅠ/BfrⅠ/XbaⅠ/SalⅠ/PstⅠ/SphⅠ/HindⅢ限制位點(diǎn)的多接頭插入pGPTV-Hyg的EcoRⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)而產(chǎn)生的)。實(shí)施例4包含與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsA基因的二元載體的制備用ApaⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒pPR1OTSA，凝膠純化含有與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsA基因的2.6kb長(zhǎng)片段，連接于pBHYGM的ApaⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)，獲得含有與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsA基因的二元載體。實(shí)施例5包含與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsB基因的二元載體的制備用ApaⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒pPR1OTSB，凝膠純化含有與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsB基因的2.0kb長(zhǎng)片段，連接于pBHYGM的ApaⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)，獲得含有與煙草PR-1a啟動(dòng)子融合的OtsB基因的二元載體。實(shí)施例6用根癌農(nóng)桿菌對(duì)煙草葉盤(pán)的轉(zhuǎn)化通過(guò)電穿孔(Dower,W.J.(1987)，分子生物學(xué)報(bào)道1∶5)將二元載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101中(Bechtold,N.等人(1993),CR Acad.Sci.Paris,Science de la vie,316:1194-1199)。將過(guò)量表達(dá)水楊酸羥化酶基因的煙草cv′Xanthi nc′和轉(zhuǎn)基因系“NahG”的葉盤(pán)(Gaffney等人(1993)科學(xué)261:754-756)與包含上述構(gòu)建體的農(nóng)桿菌克隆共培育(Horsch等人(1985)科學(xué)227:1229-1231)，用對(duì)50mg/ml潮霉素B的抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化體。每個(gè)構(gòu)建體篩選出大約50個(gè)獨(dú)立的潮霉素系(T0系)，并根植于不含激素的培養(yǎng)基上。實(shí)施例7具有誘導(dǎo)型海藻糖生物合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系的篩選對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)基因系，將大約2-3cm2的葉鉆孔在3ml苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH,5.6mg/10ml)中，于約300mmol/m-2s-1照射下溫育2天。收獲葉物質(zhì)，速凍并在液氮中磨碎。提取總RNA(Verwoerd等人(1989)NAR 17,2362)，使用對(duì)OtsA和OtsB基因特異的放射性標(biāo)記探針如述(Ward等人(1991)植物細(xì)胞3,1085-1094)進(jìn)行Northern印跡分析。篩選在化學(xué)誘導(dǎo)物存在下具有海藻糖生物合成基因高水平誘導(dǎo)型表達(dá)而在無(wú)化學(xué)誘導(dǎo)物時(shí)具有低背景表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系。特別是，篩選出兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系N5和N6，并自花傳粉，其子代用于進(jìn)一步分析。實(shí)施例8玉米的轉(zhuǎn)化Koziel等人(生物技術(shù)11:194-200,1993)描述了利用粒子轟擊未成熟胚細(xì)胞而用于玉米轉(zhuǎn)化的方法。用至少一種此處所述的質(zhì)粒對(duì)玉米的轉(zhuǎn)化可通過(guò)微粒轟擊未成熟合子胚或可連續(xù)繁殖的Ⅰ型胚發(fā)生愈傷組織來(lái)實(shí)現(xiàn)。
專(zhuān)有基因型CG00526和CG00714的Ⅰ型胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)(Green等人，邁阿密冬季研討會(huì)20,1983)從溫室生長(zhǎng)物質(zhì)的1.5-2.5mm長(zhǎng)的未成熟胚開(kāi)始。傳粉大約14天后從表面消毒的穗上無(wú)菌切下胚。將CG00526的胚置于含有2％蔗糖和5mg/L草滅畏的D愈傷組織起始培養(yǎng)基上(Duncan等人，Planta 165:322-332,1985)，而將CG00714的胚置于含有3％蔗糖和0.75mg/L 2,4-D的KM愈傷組織起始培養(yǎng)基上(Kao和Michayluk,Planta 126:105-110,1975)。隨后在暗處培養(yǎng)胚和胚發(fā)生培養(yǎng)物。大約14天后從外植體上切下胚發(fā)生反應(yīng)物。將CG00526反應(yīng)物置于含有2％蔗糖和0.5mg/L 2,4-D的D愈傷組織維持培養(yǎng)基上，而將CG00714的反應(yīng)物置于含有2％蔗糖和5mg/L麥草畏的KM愈傷組織維持培養(yǎng)基上。每周向新鮮維持培養(yǎng)基中選擇性傳代培養(yǎng)，3-8周后建立高質(zhì)量密集胚發(fā)生培養(yǎng)物。選擇活躍生長(zhǎng)的胚發(fā)生愈傷組織片作為基因送遞的靶組織。在基因送遞之前大約4小時(shí)，將這些愈傷組織片置于含有含12％蔗糖的維持培養(yǎng)基的靶平板上。這些愈傷組織片以環(huán)形排列，半徑為距靶平板中心8mm和10mm.。
如DuPont Biolistics手冊(cè)所述使質(zhì)粒DNA沉淀于金微載體上。在每次6次轟擊的微載體制備中使用2-3μg的每種質(zhì)粒。用PDS-1000HeBiolistics裝置向靶組織細(xì)胞送遞基因。Biolistics裝置的設(shè)置如下破裂片與巨載體之間8mm，巨載體與終止篩之間10mm，終止篩與目標(biāo)之間7cm。每個(gè)靶平板用650psi破裂片轟擊兩次。在終止篩與靶組織之間放置一個(gè)200×200的不銹鋼篩(McMaster-Carr,New Brunswick,NJ)。
基因送遞7天后，將靶組織片從高滲培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移到高水平選擇性培養(yǎng)基中。從選擇性培養(yǎng)基中去除所有氨基酸。5-8周后，將在這些高水平選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的全部CG00526愈傷組織傳代培養(yǎng)到由低到高水平的培養(yǎng)基中。
由原始靶組織片篩選的存活組織傳代培養(yǎng)為單個(gè)集落，并稱(chēng)為獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。
在這一點(diǎn)上，將在選擇性培養(yǎng)基上篩選的集落轉(zhuǎn)移到含有3％蔗糖而不含選擇劑的改良MS培養(yǎng)基(MS3S)中(Murashige和Skoog，植物生理學(xué)(Physiol.Plant),15:473-497,1962)，置于光下。對(duì)于CG00526，向該培養(yǎng)基中加入0.25mg/L環(huán)丙嘧啶醇和0.5mg/L細(xì)胞分裂素來(lái)誘導(dǎo)胚萌發(fā)，對(duì)于CG00714，加入2mg/L芐基腺嘌呤。
2周后將再生的集落轉(zhuǎn)移到不合環(huán)丙嘧啶醇和細(xì)胞分裂素或芐基腺嘌呤的MS3S培養(yǎng)基中。將所有集落的有根或無(wú)根的再生苗轉(zhuǎn)移到含有MS3S培養(yǎng)基的Magenta盒中，最后回收有根的小植物，并轉(zhuǎn)移到溫室中的土壤中。
也曾經(jīng)使用以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)用從未成熟合子胚獲得的Ⅰ型愈傷組織產(chǎn)生轉(zhuǎn)化事件。為進(jìn)行基因送遞，在基因送遞前1-2天通過(guò)向新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)制備大約300mgⅠ型愈傷組織，篩選靶組織片，并將其以距靶平板中心10mm的環(huán)形方式置于含有12％蔗糖的培養(yǎng)基上。大約4小時(shí)后，用DuPont的PDS-1000/He Biolistic裝置轟擊該組織。用DuPont的標(biāo)準(zhǔn)方案使質(zhì)粒沉淀于1μm金顆粒上。每個(gè)靶平板以650psi兩次轟擊送遞基因。基因送遞大約16小時(shí)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含2％蔗糖不含選擇劑的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中。在基因送遞后的第12或13天，將靶組織片轉(zhuǎn)移到含40mg/lphosphino thricin作為Basta或雙丙氨膦的選擇性培養(yǎng)基中。該愈傷組織選擇傳代培養(yǎng)12-16周，之后將存活的和生長(zhǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)再生培養(yǎng)基中。
小麥轉(zhuǎn)化的一種優(yōu)選技術(shù)包括對(duì)未成熟小麥胚的粒子轟擊，并包括基因送遞前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，將任一數(shù)量的胚(0.75-1mm長(zhǎng))平板接種于含3％蔗糖(Murashige和Skoog,1962)和3mg/l 2,4-D的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行可在暗處進(jìn)行的體胚誘導(dǎo)。在所選的轟擊當(dāng)天，從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出胚，置于滲壓劑(即，以希望的濃度，一般15％，加入蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上。使胚質(zhì)壁分離2-3小時(shí)，然后轟擊。每個(gè)靶平板20個(gè)胚是常用的，但不是必需的。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使合適的含基因質(zhì)粒沉淀于微米大小的金顆粒上。用約1000psi的破裂壓力并使用標(biāo)準(zhǔn)80目篩子，用DuPont Biolistic氦裝置轟擊每一平板的胚。轟擊后，將胚放回暗處恢復(fù)約24小時(shí)(仍在滲壓劑上)。24小時(shí)后，從滲壓劑上取下胚，放回誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在再生前放置大約一個(gè)月。大約一個(gè)月后，將形成胚發(fā)生愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)移到另外含有適當(dāng)選擇劑的再生培養(yǎng)基(MS+1mg/升NAA,5mg/升GA)中。約一個(gè)月后，將形成的幼苗轉(zhuǎn)移到被稱(chēng)為GA7s的較大無(wú)菌容器中，其中含有半量強(qiáng)度的MS、2％蔗糖和相同濃度的選擇劑。專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0674715中詳細(xì)描述了小麥的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
預(yù)先傳代培養(yǎng)3-4天的2-3月齡懸乳培養(yǎng)物作為轟擊的靶細(xì)胞。粒子轟擊前4小時(shí)，將大約500mg細(xì)胞在5.5cm培養(yǎng)皿所含的0.35％瓊脂糖凝固的質(zhì)壁分離培養(yǎng)基(R2鹽和維生素、1mg/l 2,4-滴、3％蔗糖、0.5M蔗糖，pH5.8)上平鋪為2cm直徑的單層。用粒子流入槍(Finer等人，1992)將DNA包被的金顆粒(Aldrich Cat.#32,658-5，球形金粉1.5-3.0μm)傳送給胚發(fā)生懸浮細(xì)胞。顆粒包被基本上如Vain等人(1993)所述進(jìn)行將5μl等份質(zhì)粒溶液分到0.5ml反應(yīng)管中，置于冰上。顆粒以100mg/ml懸浮于96％乙醇中，渦旋振蕩2分鐘。將乙醇替換為等體積的無(wú)菌ddH2O，振蕩該懸液1分鐘。該洗滌步驟必須重復(fù)一次。最后將顆粒以100mg/ml重懸浮于無(wú)菌ddH2O中。向每一DNA等份中加入25μl顆粒懸液，將管振蕩1分鐘，隨后立即加入25μl無(wú)菌、冰預(yù)冷的CaCl2(2.5M溶于ddH2O)繼續(xù)振蕩1分鐘。加入10μl無(wú)菌亞精胺(0.1M溶于ddH2O)，再次振蕩懸液，置于冰上5分鐘，其間顆粒沉淀。移出50μl無(wú)顆粒上清液，剩余的懸液(15μl)進(jìn)行5次轟擊。在每次轟擊之前，顆粒需要通過(guò)劇烈移液重懸浮。
使細(xì)胞覆蓋500μm網(wǎng)狀隔板，將其置于含有顆粒的過(guò)濾單元之下14cm。在部分真空(2×104pa)下用50毫秒的單次8巴壓力脈沖釋放顆粒。
用所述轉(zhuǎn)化載體之一轟擊24小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)選擇劑如30mg/l巴龍霉素的0.3％瓊脂糖凝固的選擇性愈傷組織增強(qiáng)培養(yǎng)基R2I(R2鹽、1mg/l 2,4-滴、1mg/l硫胺素-HCl、500mg/l MES、6％蔗糖，pH5.8)上，于28℃在暗處保存3周，直到巴龍霉素抗性(PamR)集落在立體顯微鏡下成為可見(jiàn)的。將PamR集落轉(zhuǎn)移到含有40mg/l巴龍霉素的新鮮R2I培養(yǎng)基上，在暗處培養(yǎng)(每周傳代培養(yǎng))。2周后，將PamR集落轉(zhuǎn)移到含有40mg/l巴龍霉素的0.5％瓊脂糖凝固的R2I中，在暗處培養(yǎng)1周。為了再生，然后將集落轉(zhuǎn)移到0.8％瓊脂糖凝固的幼苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(R2R:R2鹽、MS維生素、2％蔗糖、3％山梨糖醇、1mg/l玉米素、0.5mg/l IAA、40mg/l巴龍霉素)，在光下培養(yǎng)直到形成幼苗。平行地，將愈傷組織物質(zhì)保持于含有40mg/l巴龍霉素的R2I培養(yǎng)基上，在暗處培養(yǎng)，每周傳代培養(yǎng)，以獲得同質(zhì)的細(xì)胞系。
B．海藻糖-6-磷酸合酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因在植物質(zhì)體中的表達(dá)B1．誘導(dǎo)型表達(dá)實(shí)施例11用于向質(zhì)體基因組中同源重組的載體pAT236的構(gòu)建為了經(jīng)同源重組插入嵌合基因，修飾煙草質(zhì)體基因組的trnⅤ和rps12/7基因間隔區(qū)。由煙草質(zhì)體基因組PCR擴(kuò)增1.78kb區(qū)(位點(diǎn)139255-141036,Shinozaki等人(1986)歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志5:2043-2049)，并在位點(diǎn)140169之后插入一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)，產(chǎn)生915bp和867bp的位于PstⅠ插入位點(diǎn)5’和3’的側(cè)翼質(zhì)體DNA。用在位點(diǎn)139255之前插入一個(gè)BsiEⅠ位點(diǎn)(5’-TAA CGG CCG CGC CCA ATCATT CCG GAT A-3’,SEQ ID No:5)和在位點(diǎn)140169之后插入一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)(5’-TAA CTG CAG AAA GAA GGC CCG GCT CCAA-3’,SEQ ID No:6)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Pfu Turbo DNA聚合酶，Stratagene,La Jolla,CA)。也用在位點(diǎn)140170之前插入一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)(5’-CGC CTG CAG TCG CAC TAT TAC GGA TAT G-3’,SEQ ID No:7)和在位點(diǎn)141036之后插入一個(gè)BsiWⅠ位點(diǎn)(5’-CGCCGT ACG AAA TCC TTC CCG ATA CCT C-3’,SEQ ID No:8)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PstⅠ-BsiEⅠ片段插入pbluescript SK+(Stratagene)的PstⅠ-SacⅡ位點(diǎn)，產(chǎn)生pAT216，并將PstⅠ-BsiWⅠ片段插入pbluescript SK+的PstⅠ-Acc65Ⅰ位點(diǎn)，產(chǎn)生pAT215。pAT218含有1.78kb的質(zhì)體DNA，含有PstⅠ位點(diǎn)用于嵌合基因和選擇性標(biāo)記的插入，通過(guò)將pAT215的2.0kb PstⅠ-ScaⅠ片段與pAT216的2.7kbPstⅠ-ScaⅠ帶連接而構(gòu)建。
Ⅰ．煙草16S rRNA啟動(dòng)子和rbcL基因的rbs的擴(kuò)增由煙草DNA(煙草cv.Xanthi)PCR擴(kuò)增16S rRNA啟動(dòng)子，并與煙草質(zhì)體rbcL基因的合成核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)融合。“頂鏈”引物在位點(diǎn)102568之前在16S rRNA啟動(dòng)子5’末端插入一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)(5’-GCC AGA ATT CGC CGT CGT TCA ATG AGA ATG-3’,SEQ ID No:9)?！暗祖湣币飻U(kuò)增到16SrRNA啟動(dòng)子的位點(diǎn)102675，通過(guò)改變位點(diǎn)102661(A改為C)和102670(A改為C)除去兩個(gè)上游ATG，加入rbcL基因的rbs(位點(diǎn)57569-57584)作為引物的5’延伸，并在rbs的3’末端插入一個(gè)BspHⅠ位點(diǎn)(5’-GCC TTC ATG ATCCCT CCC TAC AAC TAT CCA GGC GCT TCA GAT TCG-3’,SEQID NO:10)。凝膠純化142bp擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRⅠ和BspHⅠ酶切，產(chǎn)生含有與rbcL基因的rbs融合的煙草16S rRNA啟動(dòng)子的128bp片段。
Ⅱ．煙草質(zhì)體rps16基因3’非翻譯RNA序列(3’UTR)的擴(kuò)增使用下列寡核苷酸對(duì)由煙草DNA(煙草cv.Xanthi)PCR擴(kuò)增煙草質(zhì)體rps16 3’UTR:用“頂鏈引物”(5’-CGC GAC TAG TTC AACCGA AAT TCA AT-3’,SEQ ID NO:11)，在緊接編碼核糖體蛋白S16的質(zhì)體rps16基因的終止密碼子之后加入一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)，用“底鏈”引物(5’-CGC TCT GCA GTT CAA TGG AAG CAA TG-3’,SEQID No:12)在rps16 3’UTR的3’末端加入一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)，。凝膠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用SpeⅠ和PstⅠ消化，產(chǎn)生含有煙草rps16 3’UTR的163bp片段(煙草質(zhì)體基因組的位點(diǎn)4941-5093,Shinozaki等人，1986)，其5’側(cè)翼為一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)，3’為一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)。
Ⅲ．用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化篩選的16S rRNA啟動(dòng)子∷aadA基因∷rps163’UTR盒的構(gòu)建從pRL277中分離aadA基因的編碼序列，aadA基因是一種編碼提供壯觀(guān)霉素和鏈霉素抗性的氨基糖苷3’腺苷轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌基因(Black等人(1993)分子生物學(xué)9:77-84和Prentki等人(1991)基因103:17-23)。分離aadA編碼序列的5’主要部分作為pRL227的724bp BspHⅠ-BssHⅡ片段(起始密碼子位于BspHⅠ位點(diǎn))，用pRL277作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增在終止密碼子20bp之后加入一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)來(lái)修飾aadA基因的3’剩余部分，其中使用下列寡核苷酸對(duì)“頂鏈”引物(5’-ACC GTA AGG CTT GAT GAA-3’,SEQ ID NO:13)和加入一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)的“底鏈”引物(5’-CCC ACT AGT TTG AAC GAATTG TTA GAC-3’,SEQ ID NO:14)。凝膠純化658bp擴(kuò)增產(chǎn)物，用BssHⅡ、SpeⅠ消化，將89bp片段與724bp BspHⅠ-BssHⅡ片段上帶有的aadA基因5’部分、128bp EcoRⅠ-BspHⅠ PCR擴(kuò)增片段上帶有的16S rRNA啟動(dòng)子和rbcL的rbs及EcoRⅠ-SpeⅠ消化的pLITMUS28載體(New England Biolabs)相連接，產(chǎn)生pAT223。對(duì)pAT223的EcoRⅠ-SpeⅠ0.94kb片段，該片段含有16S rRNA啟動(dòng)子-rbs引導(dǎo)的aadA基因、163bp含有rps16 3’UTR的SpeⅠ、PstⅠ消化PCR片段、和EcoRⅠ、PstⅠ酶切的pUC19(New England Biolabs)進(jìn)行三路連接，獲得含有引導(dǎo)aadA基因的16S rRNA啟動(dòng)子和rps16 3’UTR的pAT229。
Ⅳ．噬菌體T7基因10啟動(dòng)子的擴(kuò)增從pET-3d(Statagene)PCR擴(kuò)增噬菌體T7基因10啟動(dòng)子，其中使用下列寡核苷酸對(duì)在T7啟動(dòng)子5’末端插入一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)的“頂鏈”引物(5’-CCC GAA TTC ATC CCG CGA AAT TAA TA-3’,SEQ ID NO:15)，和在3’末端插入一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn)的“底鏈”引物(5’-CGG CCA TGG GTA TAT CTC CTT CTT AAA GTT AAA-3’,SEQ ID NO:16)。凝膠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRⅠ、NcoⅠ酶切，產(chǎn)生含有T7啟動(dòng)子的96bp片段。
Ⅴ．噬菌體T7基因10終止子的擴(kuò)增從pET-3d(Stratagene)PCR擴(kuò)增噬菌體T7基因10終止子，其中使用下列寡核苷酸對(duì)“頂鏈”引物在終止子的5’末端插入一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)(5’-GCG AAG CTT GCT GAG CAA TAA CTA GCATAA-3’,SEQ ID NO:17)，“底鏈”引物在終止子的3’末端插入一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)(5’-GCG CTG CAG TCC GGA TAT AGT TCC TCC T-3’,SEQ ID NO:18)。凝膠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用HindⅢ-PstⅠ酶切，產(chǎn)生含有T7終止子的86bp片段。
Ⅵ．?dāng)M南芥質(zhì)體psbA 3’非翻譯RNA序列的擴(kuò)增從擬南芥DNA(生態(tài)型Landsburg)PCR擴(kuò)增擬南芥質(zhì)體psbA3’UTR，其中使用下列寡核苷酸對(duì)“頂鏈”引物向3’UTR的5’端添加了一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)，并通過(guò)將G突變?yōu)锳(下劃線(xiàn)標(biāo)出)除去了天然序列中的一個(gè)XbaⅠ位點(diǎn)(5’-GCG ACT AGT TAG TGT TAG TCTAAA TCT AGT T-3’,SEQ ID NO:19)，“底鏈”引物向UTR的3’端添加了一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)(5’-CCG CAA GCT TCT AAT AAA AAATAT ATA GTA-3’,SEQ ID NO:20)。擴(kuò)增區(qū)域從GenBank保藏號(hào)X79898的位點(diǎn)1350延伸到1552。凝膠純化218bp PCR產(chǎn)物，用SpeⅠ和HindⅢ消化，并與帶有T7終止子的HindⅢ-PstⅠ酶切PCR片段連接引入pbluescript sk-(Stratagene)的SpeⅠ-PstⅠ位點(diǎn)，產(chǎn)生pPH171．與GenBank保藏號(hào)X79898相比，pPH171的psbA 3’UTR區(qū)的序列分析顯示在位點(diǎn)1440和1452處缺失了A。
Ⅶ．含有與噬菌體T7基因10啟動(dòng)子和終止子及擬南芥質(zhì)體psbA3’UTR融合的GUS報(bào)道基因的嵌合基因在質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體中的制備通過(guò)含有T7啟動(dòng)子的96bp EcoRⅠ、NcoⅠ PCR片段，含有GUS基因的pC8的1.86kb NcoⅠ、XbaⅠ片段，含有擬南芥psbA 3’UTR和T7終止子的pPH171的295XbaⅠ、PstⅠ片段，向pGEM-3Z(Stratagene)的EcoRⅠ、PstⅠ位點(diǎn)中的四路連接，構(gòu)建噬菌體T7基因10啟動(dòng)子∷GUS基因∷擬南芥psbA 3’UTR∷T7終止子盒，產(chǎn)生質(zhì)粒pAT221。通過(guò)將含有16S rRNA啟動(dòng)子-rbs∷aadA∷rps16 3’UTR盒的pAT229的1.1kbHindⅢ、EcoRⅠ片段，和帶有T7啟動(dòng)子∷GUS∷psbA 3’UTR∷T7終止子盒的2.26kb EcoRⅠ、PstⅠ pAT221片段，克隆到pbluescript sk+(Stratagene)的HindⅢ、PstⅠ位點(diǎn)，將T7啟動(dòng)子引導(dǎo)的GUS基因盒與aadA選擇性標(biāo)記盒相連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pAT232。質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pAT236的構(gòu)建方法是，含有GUS和選擇性標(biāo)記盒的pAT232的3.36kbPstⅠ帶連接到pAT218的PstⅠ位點(diǎn)，并對(duì)GUS基因以與rps12/7ORF相同方向轉(zhuǎn)錄時(shí)的插入方向進(jìn)行篩選。實(shí)施例12用聚鳥(niǎo)苷序列段作為3’UTR替代者的載體構(gòu)建聚鳥(niǎo)苷序列段顯示可在體內(nèi)替代質(zhì)體atpB基因3’UTR(Drager等人(1996)RNA 2:652-663)。含有18個(gè)連續(xù)鳥(niǎo)苷殘基、在5’和3’末端側(cè)翼分別為SpeⅠ、HindⅢ粘端的polyG序列段是通過(guò)使下列兩種激酶處理的寡核苷酸退火而裝配成的(5’-CTA GTG GGG GGGGGG GGG GGG GGA-3’,SEQ ID NO:21)和(5’-AGC TTC CCCCCC CCC CCC CCC CCA-3’,SEQ ID NO:22)。含有SpeⅠ、HindⅢ粘端的polyG18序列段與含有T7終止子的HindⅢ、PstⅠ消化的PCR片段相連接，引入pBluescript SK+(Stratagene)的SpeⅠ、PstⅠ位點(diǎn)。實(shí)施例13含有與噬菌體T7基因10啟動(dòng)子融合的大腸桿菌海藻糖-6-磷酸合酶基因(OtsA)的嵌合基因在質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體中的制備用大腸桿菌DH5α株的基因組DNA作為OtsA基因5’部分PCR擴(kuò)增的模板，使用一條頂鏈引物(其中引入了ATG起始密碼子，隨后是一個(gè)新添加的GCA密碼子)，從而產(chǎn)生一個(gè)NcoⅠ限制位點(diǎn)(引物pOTSAN+:5’-TGA CCA TGG CAA GTC GTT TAG TCG TAG T-3’,SEQ ID NO:23)，并使用一條在OtsA唯一SfuⅠ限制位點(diǎn)下游的底鏈引物(引物pOTSAN-:5’-AGC AAC GCT TCA TAG-3’,SEQID NO:24)。用480型DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer/Roche,Branchburg,NJ)按廠(chǎng)商推薦用PFU DNA聚合酶(Promega)在50μ體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)，94℃(30s)、40℃(60s)和72℃(30s)五個(gè)循環(huán)，隨后94℃(30s),55℃(60s)和72℃(30s)25個(gè)循環(huán)。用標(biāo)準(zhǔn)方法凝膠純化850bp PCR產(chǎn)物，用NcoⅠ(除非另外指出，否則所有限制酶都獲自New England Biolabs)和SfuⅠ(BoehringerMannheim,Corp.,Indianapolis)酶切，釋放661bp的DNA片段。以與上述相似的方法獲得OtsA的3’部分，其中使用位于OtsA SfuⅠ位點(diǎn)上游的頂鏈引物(pOTSAX+:5’-GCG TTC CTG GAT TGT C-3’,SEQ ID NO:25)，和一條底鏈引物(pOTSAX-:5’-GGG TCT AGAGAT TCA CGC GAG CTT TGG AAA GGT AGC A-3’,SEQ ID NO:26)，其通過(guò)將CTT Leu密碼子改變?yōu)镃TC，在終止密碼子下游引入了一個(gè)XbaⅠ限制位點(diǎn)，并破壞了在OtsA 3’末端存在的HindⅢ限制位點(diǎn)。凝膠純化861bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，用SfuⅠ和XbaⅠ消化，得到的772bp DNA片段與5’OtsA NcoⅠ/SfuⅠ片段在用NcoⅠ和XbaⅠ消化的pLitmus28(Promega)中連接，產(chǎn)生pOTSA。
pAT236(實(shí)施例11)的質(zhì)粒DNA，在質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體中含有pET3a(Novagen)的噬菌體T7基因10啟動(dòng)子盒，用NcoⅠ和SphⅠ消化(產(chǎn)生1646bp片段)和SphⅠ和XbaⅠ消化(產(chǎn)生4514bp片段)。這些載體片段以三路反應(yīng)與含有完整OtsA基因的pOTSA的1433bpNcoⅠ/XbaⅠ片段連接，產(chǎn)生質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pT7-OTSA。實(shí)施例14含有與噬菌體T7基因10啟動(dòng)子融合的大腸桿菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(OtsB)的嵌合基因在質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體中的制備如上所述由大腸桿菌基因組DNA擴(kuò)增OtsB基因的5’部分，其中使用頂鏈引物pOTSBN+:5’-GTC GCC ATG GTG ACA GAA CCGTTA ACC-3’,SEQ ID NO:27，其使OtsB的GTG起始密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)锳TG，并在第二個(gè)位點(diǎn)添加了一個(gè)GTG Val密碼子，并使用位于OtsB唯一BglⅡ位點(diǎn)下游的底鏈引物pOTSBN-:5’-GTT CGC CCGATA AAG GGA G-3’,SEQ ID NO:28。凝膠純化584bp產(chǎn)物，用NcoⅠ和BglⅡ消化，分離產(chǎn)生的459bp片段。類(lèi)似地?cái)U(kuò)增OtsB的3’部分，其中使用位于OtsB BglⅡ位點(diǎn)上游的頂鏈引物pOTSBX+:5’-TAG CGC AAC GTA TTA CTC-3’,SEQ ID NO:29，和底鏈引物pOTSBX-:5’-GCC TCT AGA CTC ATC ATT AGA TAC TAC GACTAA AC-3’,SEQ ID NO:30，其在OtsB終止密碼子下游引入了一個(gè)XbaⅠ限制位點(diǎn)。用BglⅡ和XbaⅠ消化凝膠純化的381bp產(chǎn)物，得到的354bp BglⅡ/XbaⅠ限制片段與5’OtsB NcoⅠ/BglⅡ限制片段連接，引入用NcoⅠ和XbaⅠ消化的載體pLitmus28中，產(chǎn)生pOTSB。
然后用NcoⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒pOTSB，如上所述使得到的含有完整OtsB基因的820bp片段與質(zhì)粒pAT236的NcoⅠ/SphⅠ和SphⅠ/XbaⅠ片段以三路反應(yīng)連接，產(chǎn)生質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pT7 OTSB。實(shí)施例15含有操縱子樣嵌合基因構(gòu)建體的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的制備，該構(gòu)建體含有與噬菌體T7啟動(dòng)子和終止子融合的OtsA基因和OtsB基因用NcoⅠ和SpeⅠ消化質(zhì)粒pOTSB，分離并去磷酸化3534bp載體骨架/OtsB片段。該片段與合成寡核苷酸接頭連接，該接頭含有噬菌體T7基因10 5’UTR的一部分和嵌合共有質(zhì)體核糖體結(jié)合位點(diǎn)，其制備方法是退火然后用T4激酶磷酸化頂鏈寡核苷酸5’-CTA GTG GGAGAC CAC AAC GGT TTC CCT CTA GAA ATA ATT TTG TTTAAG TTT AAG AAG GGG AGA GAA T-3’,SEQ ID NO:31(SpeⅠ限制位點(diǎn)突出端以下劃線(xiàn)標(biāo)出)和底鏈寡核苷酸5’-CAT GAT TCTCTC CCC TTC TTA AAC TTA AAC AAA ATT ATT TCT AGAGGG AAA CCG TTG TGG TCT CCC A-3’,SEQ ID NO:32(BspHⅠ限制位點(diǎn)突出端以下劃線(xiàn)標(biāo)出)。用SpeⅠ消化得到的質(zhì)粒pOTSBL,連接于以方向SpeⅠ--OtsA∷接頭∷OtsB篩選的pOTSA的1516 bpSpeⅠ/XbaⅠ片段，產(chǎn)生pOTSABL。然后用NcoⅠ和XbaⅠ(部分)消化質(zhì)粒pOTSABL，使得到的含有完整OtsA∷T75’/RBS∷OtsB盒的2313bp片段與如上所述的質(zhì)粒pAT236的NcoⅠ/SphⅠ和SphⅠ/XbaⅠ片段以三路反應(yīng)連接，產(chǎn)生質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pT7_OTSAB。
用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法也產(chǎn)生一種省略了噬菌體T7基因10 5’UTR部分的類(lèi)似的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體。
B2．組成型表達(dá)實(shí)施例16煙草質(zhì)體clpP基因啟動(dòng)子和完整5’非翻譯RNA(5’UTR)的擴(kuò)增煙草c.v.“Xanthi NC”的總DNA用作PCR模板，使用一條由左至右的“頂鏈”引物，其在相對(duì)于組成型表達(dá)質(zhì)體clpP基因ATG起始密碼子的位點(diǎn)-197處含有一個(gè)引入的EcoRⅠ限制位點(diǎn)(引物Pclp_P1a:5’-GCG GAA TTC ATA CTT ATT TAT CAT TAG AAAG-3’(SEQ ID No:33)；EcoRⅠ限制位點(diǎn)以下劃線(xiàn)標(biāo)出)，并使用一條由右至左的“底鏈”引物，它與相對(duì)于clpP啟動(dòng)子ATG起始密碼子的-21到-1區(qū)域同源，并在翻譯起點(diǎn)處摻入了一個(gè)引入的NcoⅠ限制位點(diǎn)(引物Pclp-P2b:5’-GCG CCA TGG TAA ATG AAA GAA AGAACT AAA-3’(SEQ ID No:34)；NcoⅠ限制位點(diǎn)以下劃線(xiàn)標(biāo)出)。按廠(chǎng)商推薦用(Perkin Elmer/Roche,Branchburg,NJ)Perkin Elmer480型熱循環(huán)儀用Pfu熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla CA)如下進(jìn)行該P(yáng)CR反應(yīng)95℃7分鐘，隨后95℃1分鐘/43℃2分鐘/72℃1分鐘4個(gè)循環(huán)，然后95℃ 1分鐘/55℃ 2分鐘/72℃ 1分鐘25個(gè)循環(huán)。用標(biāo)準(zhǔn)方法凝膠純化213bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，其含有clpP基因的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)，在左端包含一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)，在右端包含一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn)，并對(duì)應(yīng)于煙草質(zhì)體DNA序列的核苷酸74700-74505(Shinozaki等人，歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志5:2043-2049(1986))，并用EcoRⅠ和NcoⅠ消化該產(chǎn)物(所有限制酶都購(gòu)自New England Biolabs,Beverly,MA)。實(shí)施例17煙草質(zhì)體rps16基因3’非翻譯RNA序列的擴(kuò)增如上所述用煙草c.v.“Xanthi NC”的總DNA作為PCR模板，使用一條由左至右的“頂鏈”引物，其在編碼核糖體蛋白S16的質(zhì)體rps16基因的TAA終止密碼子之后含有一個(gè)引入的XbaⅠ限制位點(diǎn)(引物rps16P 1a:5’-GCG TCT AGA TCA ACC GAA ATT CAA TTAAGG-3’(SEQ ID NO:35)；XbaⅠ限制位點(diǎn)以下劃線(xiàn)標(biāo)出)，并使用一條由右至左的“底鏈”引物，它與相對(duì)于rps16的TAA終止密碼子的+134到+151區(qū)域同源，并在rps16 3’UTR的3’末端摻入了一個(gè)引入的HindⅢ限制位點(diǎn)(引物rps16P_1b:5’-CGC AAG CTT CAA TGGAAG CAA TGA TAA-3’(SEQ ID NO:36)；HindⅢ限制位點(diǎn)以下劃線(xiàn)標(biāo)出)。凝膠純化169bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，其含有rps16基因的3’非翻譯區(qū)，在左端包含一個(gè)XbaⅠ位點(diǎn)，在右端包含一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)，并含有對(duì)應(yīng)于煙草質(zhì)體DNA序列核苷酸4943-5093的區(qū)域(Shinozaki等人，1986)，并用XbaⅠ和HindⅢ消化。實(shí)施例18含有與clpP基因啟動(dòng)子和5’和3’UTR連接的GUS報(bào)道基因片段的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的制備通過(guò)用NcoⅠ和XbaⅠ消化產(chǎn)生1864bp β-半乳糖醛酸酶(GUS)報(bào)道基因片段，其來(lái)源于質(zhì)粒pRAJ275(Clontech)，在A(yíng)TG起始密碼子處含有一個(gè)NcoⅠ限制位點(diǎn)，在天然3’UTR后含有一個(gè)XbaⅠ位點(diǎn)。該片段與201bp EcoRⅠ/NcoⅠ clpP啟動(dòng)子片段、157bpXbaⅠ/HindⅢ rps16 3’UTR片段、克隆載體pGEM3Zf(-)(Promega,Madison WI)的3148bp EcoRⅠ/HindⅢ片段以四路反應(yīng)連接，構(gòu)建質(zhì)粒pPH138。質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPH140的構(gòu)建方法是，用EcoRⅠ和HindⅢ消化質(zhì)粒pPRV111a(Zoubenko等人(1994)核酸研究22:3819-24)，并將得到的7287bp片段與pPH138的2222bp EcoRⅠ/HindⅢ片段連接。實(shí)施例19含有與clpP基因啟動(dòng)子和5’和3’UTR連接的OtsA基因的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的制備含有完整OtsA基因的pOTSA的1433bp NcoⅠ/XbaⅠ片段以四路反應(yīng)與201bp EcoRⅠ/NcoⅠclpP啟動(dòng)子片段、157bp XbaⅠ/HindⅢ rps163’UTR片段、克隆載體pGEM3Zf(-)(Promega,Madison WI)的3148bpEcoRⅠ/HindⅢ片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒pclpOtsA。質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法是，用EcoRⅠ和HindⅢ消化質(zhì)粒pPRV111a，并將得到的7287bp片段與pclpOtsA的1791bp EcoRⅠ/HindⅢ片段連接。實(shí)施例20含有與clpP基因啟動(dòng)子和5’和3’UTR連接的OtsB基因的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的制備用NcoⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒pOTSB，得到的含有完整OtsB基因的820bp片段以四路反應(yīng)與201bp EcoRⅠ/NcoⅠclpP啟動(dòng)子片段、157bpXbaⅠ/HindⅢ rps16 3’UTR片段、克隆載體pGEM3Zf(-)(Promega,Madison WI)的3148bp EcoRⅠ/HindⅢ片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒pclpOtsB。質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法是，用EcoRⅠ和HindⅢ消化質(zhì)粒pPRV111a，并將得到的7287bp片段與pclpOtsB的1178bpEcoRⅠ/HindⅢ片段連接。實(shí)施例21含有一種操縱子樣嵌合基因構(gòu)建體的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的制備，該構(gòu)建體含有與clpP基因啟動(dòng)子和5’和3’UTR連接的OtsA基因和OtsB基因用NcoⅠ和XbaⅠ(部分)消化質(zhì)粒pOTSABL，得到的含有完整OtsA∷T7 5’/RBS∷OtsB盒的2313bp片段以四路反應(yīng)與201bpEcoRⅠ/NcoⅠclpP啟動(dòng)子片段、157bp XbaⅠ/HindⅢ rps16 3’UTR片段、克隆載體pGEM3Zf(-)(Promega,Madison WI)的3148bpEcoRⅠ/HindⅢ片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒pclpOtsAB。質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPH140的構(gòu)建方法是，用EcoRⅠ和HindⅢ消化質(zhì)粒pPRV111a(Zoubenko等人，1994)，并將得到的7287bp片段與pclpOtsAB的2671bpEcoRⅠ/HindⅢ片段連接。實(shí)施例22煙草質(zhì)體基因組的Biolistic轉(zhuǎn)化每板七個(gè)，以1″環(huán)形排列于T瓊脂培養(yǎng)基上，使煙草c.v.′Xanthi nc′的種子萌發(fā)，播種12-14天后，基本如所述(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)PNAS 90,913-917)，用質(zhì)粒pC8E5和pC+E5的DNA包被的1μm鎢顆粒(M10,Biorad,Hercules,CA)轟擊。將轟擊的秧苗在T培養(yǎng)基上溫育兩天之后切下葉子，遠(yuǎn)軸側(cè)朝上置于亮光下(350-500μmol光子/m2/s)，于含有500μg/ml壯觀(guān)霉素二鹽酸鹽(Sigma,St.Louis,MO)的RMOP培養(yǎng)基板上(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.和Maliga,P.(1990)PNAS 87,8526-8530)。轟擊三至八周后在漂白葉下出現(xiàn)的抗性苗被亞克隆至相同的選擇培養(yǎng)基上，使之形成愈傷組織，分離并亞克隆第二批苗。獨(dú)立亞克隆中完全分離的轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組拷貝(同質(zhì)體狀態(tài))，用Southern印跡標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等人(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港)評(píng)價(jià)。BamHⅠ/EcoRⅠ消化的總細(xì)胞DNA(Mettler,I.J.(1987)植物分子生物學(xué)報(bào)告5,346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)移至尼龍膜上(Amersham)，用32P-標(biāo)記的隨機(jī)引物DNA序列探查，該序列對(duì)應(yīng)于包含一部分rps7/12質(zhì)體導(dǎo)向序列的pC8的0.7kb BamHⅠ/HindⅢ DNA片段。同質(zhì)體苗在包含壯觀(guān)霉素的MS/IBA培養(yǎng)基(McBride,K.E.等人(1994)PNAS 91,7301-7305)上無(wú)菌生根，并將其轉(zhuǎn)移到溫室中。實(shí)施例23表達(dá)化學(xué)誘導(dǎo)型、質(zhì)體導(dǎo)向的T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)基因煙草的制備一種合成寡核苷酸接頭，其含有一個(gè)NcoⅠ限制位點(diǎn)和ATG起始密碼子，隨后是rbcS基因(編碼核酮糖二磷酸羧化酶的小亞基)的前7個(gè)質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽密碼子和內(nèi)源PstⅠ限制位點(diǎn)(頂鏈5’-CAT GGC TTCCTC AGT TCT TTC CTC TGC A-3’,SEQ ID NO:37；底鏈5’-GAGGAA AGA ACT GAG GAA GC-3’,SEQ ID NO:38),pCGN4205(McBride,K.E.等人(1994),PNAS 91,7301-7305)的2.8kb PstⅠ/SacⅠDNA片段，其含有與rbcS基因轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列3’部分在框架內(nèi)融合的噬菌體T7 RNA聚合酶基因(T7 Pol),pCIB296的一個(gè)0.9kbNcoⅠ/KpnⅠDNA片段，其含有煙草PR-1a啟動(dòng)子，在起始密碼子處有一個(gè)引入的NcoⅠ限制位點(diǎn)(Uknes等人(1993)植物細(xì)胞5,159-169)，和二元農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體pSGCGC1(pGPTV-Hyg的衍生物，含有克隆到SacⅠ/HindⅢ位點(diǎn)的pGEM4(Promega,Madison WI)的多接頭)的4.9kb SfiⅠ/KpnⅠ和6.6kb SacⅠ/SfiⅠ片段，將以上片段連接，構(gòu)建pPH110。
將煙草‘Xanthi’和“NahG”的葉盤(pán)與帶有pPH110二元載體的GV3101農(nóng)桿菌共培育，如述從由此獲得的幼苗再生為潮霉素抗性NT-pPH110煙草植物。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)基因系，大約2-3cm2的雙重葉鉆孔在3ml BTH(5.6mg/10ml)或無(wú)菌蒸餾水中，于約300μmol/m2/s照射下溫育2天。收獲葉物質(zhì)，急凍，并在液氮中磨碎。提取總RNA(Verwoerd等人(1989)NAR 17,2362)．使用放射性標(biāo)記的T7 RNA聚合酶基因探針如述(Ward等人(1991)植物細(xì)胞3,1085-1094)進(jìn)行Northern印跡分析。將顯示一定程度T7 Pol表達(dá)的十九個(gè)NT-110X(Xanthi遺傳背景)和七個(gè)NT-110N(NahG遺傳背景)的T1系植物轉(zhuǎn)移到溫室中并自花傳粉。連鎖的潮霉素抗性標(biāo)記3∶1分離的子代自體受精，選擇純合的T2系。實(shí)施例24玉米的質(zhì)體轉(zhuǎn)化專(zhuān)有基因型CG00526和CG00714的Ⅰ型胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)(Green等人(1983)，于A(yíng).Fazelahmad,K.Downey,J.Schultz,R.W.Voellmy,編，基因技術(shù)進(jìn)展植物與動(dòng)物的分子遺傳學(xué)。邁阿密冬季研討會(huì)，第20卷，Academic Press,N.Y.)從溫室生長(zhǎng)物質(zhì)的1.5-2.5mm長(zhǎng)的未成熟胚開(kāi)始。傳粉大約14天后從表面消毒的穩(wěn)上無(wú)菌切下胚。將CG00526的胚置于含有2％蔗糖和5mg/L草滅畏的D愈傷組織起始培養(yǎng)基上(Duncan等人(1985)Planta 165:322-332)，而將CG00714的胚置于含有3％蔗糖和0.75mg/L 2,4-滴的KM愈傷組織起始培養(yǎng)基上(Kao和Michayluk(1975)Planta 126:105-110)。隨后在暗處培養(yǎng)胚和胚發(fā)生培養(yǎng)物。大約14天后從外植體上切下胚發(fā)生反應(yīng)物。將CG00526反應(yīng)物置于含有2％蔗糖和0.5mg/L 2,4-滴的D愈傷組織維持培養(yǎng)基上，而將CG00714的反應(yīng)物置于含有2％蔗糖和5mg/L麥草畏的KM愈傷組織維持培養(yǎng)基上。每周向新鮮維持培養(yǎng)基中選擇性傳代培養(yǎng)，3-8周后建立高質(zhì)量密集胚發(fā)生培養(yǎng)物。選擇活躍生長(zhǎng)的胚發(fā)生愈傷組織片作為基因送遞的靶組織。在基因送遞前大約4小時(shí)，將這些愈傷組織片置于含有含12％蔗糖的維持培養(yǎng)基的靶平板上。這些愈傷組織片以環(huán)形排列，半徑為距靶平板中心8mm和10mm.。如DuPont Biolistics手冊(cè)所述使質(zhì)粒DNA沉淀于金微載體上。在每次6次轟擊的微載體制備中使用2-3μg的每種質(zhì)粒。用PDS-1000HeBiolistics裝置向靶組織細(xì)胞送遞基因。Biolistics裝置的設(shè)置如下破裂片與巨載體之間8mm，巨載體與終止篩之間10mm，終止篩與目標(biāo)之間7cm。每個(gè)靶平板用650psi破裂片轟擊兩次。在終止篩與靶組織之間放置一個(gè)200×200的不銹鋼篩(McMaster-Carr,New Brunswick,NJ)。
5天后，將轟擊的愈傷組織片轉(zhuǎn)移到含有2％蔗糖和0.5mg/L 2,4-滴而不含氨基酸及含有750或1000nM通式ⅩⅦ的維持培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)移4-5小時(shí)后或第二天將愈傷組織片置于光架上1小時(shí)，于27℃在暗處貯存5-6周。5-6周初次篩選階段后，將黃色到白色的組織轉(zhuǎn)移到含有補(bǔ)加有500或750nM通式ⅩⅦ的相同培養(yǎng)基的新鮮平板上。轉(zhuǎn)移4-5小時(shí)后或在第二天，將組織置于光架上1小時(shí)，在暗處27℃貯存3-4周。3-4周二次篩選階段后，將組織轉(zhuǎn)移到含有補(bǔ)加有500nM通式ⅩⅦ的相同培養(yǎng)基的平板上。將健康生長(zhǎng)的組織置于光架上1小時(shí)，并在暗處27℃貯存。每?jī)芍軅鞔囵B(yǎng)一次，直到集落大到足以再生時(shí)為止。
在這一點(diǎn)上，將集落轉(zhuǎn)移到含有3％蔗糖而不含選擇劑的改良MS培養(yǎng)基(MS3S)中(Murashige和Skoog(1962)植物生理學(xué)15:473-497)，置于光下。對(duì)于CG00526，向該培養(yǎng)基中加入0.25mg/L環(huán)丙嘧啶醇和0.5mg/L細(xì)胞分裂素來(lái)誘導(dǎo)胚的萌發(fā)，對(duì)于CG00714，加入2mg/L芐基腺嘌呤。2周后，對(duì)于CG00526和CG00714，分別將再生的集落轉(zhuǎn)移到不含環(huán)丙嘧啶醇和細(xì)胞分裂素或不含芐基腺嘌呤的MS3S培養(yǎng)基中。將生根或無(wú)根的再生苗轉(zhuǎn)移到含有MS3S培養(yǎng)基的盒中，最后回收生根的小植物，并轉(zhuǎn)移到溫室中的土壤中。
C．海藻糖生物合成基因的化學(xué)誘導(dǎo)和植物中海藻糖含量的測(cè)定實(shí)施例25海藻糖生物合成基因的化學(xué)誘導(dǎo)在溫室中使種子萌發(fā)并使植物生長(zhǎng)3-6周。然后噴施1.2mM BTH(或者如Friedrich等人(1996)植物雜志10,61-70進(jìn)一步說(shuō)明的)或濕粉。在不同時(shí)間點(diǎn)收獲植物物質(zhì)的樣品并急凍。進(jìn)行Northern印跡分析監(jiān)測(cè)BTH處理后海藻糖生物合成基因表達(dá)的誘導(dǎo)。實(shí)施例26可溶性糖和多元醇從凍干的煙草組織中的提取加入40mg甘露庚酮糖(內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))后用400ml 80％甲醇65℃10分鐘抽提10-20mg凍干組織3次。合并的上清液(在Eppendorff臺(tái)式離心機(jī)中13000轉(zhuǎn)每分離心5分鐘后)在25℃下在Speedvac中真空干燥。然后將干燥的提取物重懸浮于700ml milipor水中，并加入50ml混合床離子交換樹(shù)脂(Serdolit micro blue和red 2∶1[v/v])脫鹽。以13000轉(zhuǎn)每分離心沉淀離子交換樹(shù)脂，并用300ml Milipore水洗滌。合并的上清液再次在25℃下在Speedvac中真空干燥。主要含有糖和多元醇的殘余物現(xiàn)在準(zhǔn)備用于HPLC分析，或者用于隨后毛細(xì)管GC分析的衍生。
表1顯示用BTH處理后或用濕粉(WP)作為對(duì)照處理后樣品的海藻糖含量。也顯示了野生型Xanthi海藻糖含量的測(cè)定。數(shù)值表示為mg/g測(cè)定樣品的干重(DW)。在野生型Xanthi中和在BTH處理后第0天的轉(zhuǎn)基因植物中未檢測(cè)到海藻糖，而在BTH處理后檢測(cè)到海藻糖。
實(shí)施例30用HPLC/GC對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中海藻糖含量的測(cè)定如實(shí)施例25所述培養(yǎng)并用BTH處理兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系的子代(轉(zhuǎn)基因系N5的N5/3和N5/4，轉(zhuǎn)基因系N6的N6/1、N6/2、N6/7和N6/8)。如實(shí)施例26所述收集并提取樣品。用HPLC/GC測(cè)定海藻糖含量(實(shí)施例28)。
表2顯示用BTH處理后或用濕粉(WP)作為對(duì)照處理后樣品的海藻糖含量。也顯示了野生型Xanthi海藻糖含量的測(cè)定。數(shù)值表示為mg/g測(cè)定樣品的干重(DW)。在BTH處理后的轉(zhuǎn)基因植物中觀(guān)察到海藻糖積累的誘導(dǎo)。
實(shí)施例31轉(zhuǎn)基因植物耐旱性的測(cè)定BTH或濕粉處理(見(jiàn)實(shí)施例25)7天后，使植物離開(kāi)灌溉系統(tǒng)，不再澆水。使其再生長(zhǎng)，并觀(guān)察其表型。14天后BTH處理的植物繼續(xù)生長(zhǎng)，看起來(lái)象灌溉的對(duì)照植物，而用濕粉處理的植物完全干枯。BTH處理的植物繼續(xù)生長(zhǎng)，并可以產(chǎn)種子。因此耐旱性與海藻糖生物合成基因的表達(dá)和海藻糖的積累有關(guān)。實(shí)施例32玉米海藻糖-6-磷酸合酶基因的分離選擇簡(jiǎn)并寡核苷酸AFOR、BFOR和EREV，因?yàn)樗鼈兾挥跀M南芥海藻糖-6-磷酸合酶和酵母海藻糖-6-磷酸合酶之間保守的序列中。簡(jiǎn)并寡核苷酸AFOR:5’-TIT GGC CIT(A/C)TIT TT(C)C AC(T)TAC(T)-3’,SEQ ID NO:39,(I代表肌苷，括號(hào)中的堿基代表簡(jiǎn)并寡核苷酸中括號(hào)前位點(diǎn)的另外的堿基)，編碼肽L(I)WPL(I)FHY,SEQID NO:40，(括號(hào)中的氨基酸代表肽中括號(hào)之前位點(diǎn)的另外氨基酸)，簡(jiǎn)并寡核苷酸EREV:5’-CCA IGG G(A)TT IAC IC(A)T(G)T(G/A)ATIGC ICC-3’,SEQ ID NO:41，互補(bǔ)于編碼肽GAIR(I)VNPW,SEQ IDNO:42的DNA序列，在PCR反應(yīng)中使用它們從切割的玉米c-DNA文庫(kù)(Stratagene,La Jolla,CA,Cat Nr.937005)中擴(kuò)增海藻糖-6-磷酸合酶。PCR條件根據(jù)廠(chǎng)商(Perkin Elmer)，使用4mM MgCl2,30”/90℃、2’/60℃、2’/72℃25個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增大約1000bp的片段，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從瓊脂糖凝膠中純化，用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆到載體中。用簡(jiǎn)并寡核苷酸BFOR進(jìn)行相似的反應(yīng)5’-TGGG(A)TI CAI GAC(T)TAC(T)CAC(T)T(C)TI ATG-3’,SEQ ID NO:43，編碼肽WV(I)H(Q)DYHLM,SEQ ID NO:44。擴(kuò)增大約850bp的DNA片段，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從瓊脂糖凝膠中純化，用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆到載體中。用引物BFOR和EREV反應(yīng)獲得的片段稱(chēng)為BE3，并測(cè)序(SEQ ID NO:45)?；贐E3核苷酸序列的預(yù)測(cè)的翻譯多肽(SEQ ID NO:46)含有保守的氨基酸結(jié)構(gòu)域。
用BE3探針按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)篩查玉米c-DNA文庫(kù)(例如，Sambrook等人，編，《分子克隆》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))。以大約10000個(gè)噬斑的密度將該文庫(kù)平板接種于培養(yǎng)皿上，并在37℃生長(zhǎng)過(guò)夜后制備噬斑的過(guò)濾片(lift)。用隨機(jī)引物法用32P-dCTP標(biāo)記的BE3探針之一探查該噬斑片。雜交條件是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4pH7.0、1mM EDTA,50℃。雜交過(guò)夜后，用0.2×SSC、1％SDS洗滌濾片。用放射自顯影術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性雜交噬斑。純化為單噬斑后，分離cDNA插入片段，并測(cè)定其序列。
分離出三個(gè)獨(dú)立的c-DNA克隆，其包含SEQ ID NO:47(克隆4.11)、SEQ ID NO:49(克隆6)和SEQ ID NO:51(克隆9)所示的核苷酸序列。實(shí)施例33玉米海藻糖-6-磷酸合酶基因的Southern印跡分析用標(biāo)準(zhǔn)方法從無(wú)菌條件下生長(zhǎng)的小植物中純化基因組玉米DNA。純化的DNA用EcoRⅠ、HindⅢ和SpeⅠ消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到膜上。該膜用放射性標(biāo)記的BE3片段探針雜交。檢測(cè)到的幾條帶顯示BE3對(duì)應(yīng)于至少一種玉米基因。
上述公開(kāi)的實(shí)施方案是說(shuō)明性的。本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容將使本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道本發(fā)明的多種變化。所有這些明顯且可預(yù)測(cè)的變化都包括于附加的權(quán)利要求書(shū)中。
序列表<110>Novartis AG<120>海藻糖生物合成基因在植物中的表達(dá)<130>S-30427/A/CGC 1990<140><141><150>US 60/077665<151>1998-03-11<160>52<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>1gtcagccatg gcaagtcgtt tagtcgtagt atctaac37<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>2gcaaatggca acaggtgata atcg 24<210>3<211>33<212>DNA<213>人序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>3gtcagccatg gtgacagaac cgttaaccga aac33<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>4gtgcgtcaag ctccaccatt gagc 24<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>5taacggccgc gcccaatcat tccggata 28<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>6taactgcaga aagaaggccc ggctccaa 28<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>7cgcctgcagt cgcactatta cggatatg 28<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>8cgccgtacga aatccttccc gatacctc 28<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>9gccagaattc gccgtcgttc aatgagaatg30<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>10gccttcatga tccctcccta caactatcca ggcgcttcag attcg 45<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>11cgcgactagt tcaaccgaaa ttcaat26<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>12cgctctgcag ttcaatggaa gcaatg26<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>13accgtaaggc ttgatgaa 18<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>14cccactagtt tgaacgaatt gttagac 27<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>15cccgaattca tcccgcgaaa ttaata26<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>16cggccatggg tatatctcct tcttaaagtt aaa33<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>17gcgaagcttg ctgagcaata actagcataa30<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>18gcgctgcagt ccggatatag ttcctcct 28<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>19gcgactagtt agtgttagtc taaatctagt t 31<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>20ccgcaagctt ctaataaaaa atatatagta30<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>21ctagtggggg gggggggggg ggga 24<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>22agcttccccc cccccccccc ccca 24<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>23tgaccatggc aagtcgttta gtcgtagt 28<210>24<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>24agcaaccgctt catag 15<210>25<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>25gcgttcctgg attgtc 16<210>26<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>26gggtctagag attcacgcga gctttggaaa ggtagca37<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>27gtcgccatgg tgacagaacc gttaacc 27<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>28gttcgcccga taaagggag19<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>29tagcgcaacg tattactc 18<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>30gcctctagac tcatcattag atactacgac taaac 35<210>31<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>31ctagtgggag accacaacgcg tttccctcta gaaataattt tgtttaagtt taagaagggg 60agagaat 67<210>32<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>32catgattctc tccccttctt aaacttaaac aaaattattt ctagagggaa accgttgtgg60tctccca 67<210>33<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>33gcggaattca tacttattta tcattagaaa g 31<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>34gcgccatggt aaatgaaaga aagaactaaa30<210>35<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>35gcgtctagat caaccgaaat tcaattaagg30<210>36<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>36cgcaagcttc aatggaagca atgataa 27<210>37<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>37catggcttcc tcagttcttt cctctgca 28<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>38gaggaaagaa ctgaggaagc 20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<220><221>修飾的堿基<222>(2)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(8)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(11)<223>i<400>39tntggccnht nttycaytay 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Val Pro Ile His His195 200 205ctg gac cga tct ctt gat ttc cat gcc ttg tgt gct ctt tat gca gtc 672Leu Asp Arg Ser Leu Asp Phe His Ala Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Val210 215 220act gat gtt gct ctt gta aca tca ctg aga gat ggg atg aac ctt gtg 720Thr Asp Val Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val225 230 235 240agc tat gaa tat gtt gca tgc caa ggg tct aag aaa gga gtt ctg ata 768Ser Tyr Glu Tyr Val Ala Cys Gln Gly Ser Lys Lys Gly val Leu Ile245 250 255ctt agc gag ttt gct ggg gca gca caa tca ctt gga gct ggc gcc att 816Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser Leu Gly Ala Gly Ala Ile260 265 270ctc gtc aac ccc tgg 831Leu Val Asn Pro Trp275<210>46<211>277<212>PRT<213>玉蜀黍<400>46Trp Val Gln Asp Tyr His Leu Met Phe Leu Pro Lys Cys Leu Lys Asp1 5 10 15His Asp Ile Asn Met Lys Val Gly Trp Phe Leu His Thr Pro Phs Pro20 25 30Ser Ser Glu Ile Tyr Arg Thr Leu Pro Ser Arg Leu Glu Leu Leu Arg
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Ile Thr305 310 315 320cca att gac tat gtc ctg tgc ata ggg cat ttc ctt ggg aag gat gag 1008Pro Ile Asp Tyr Val Leu Cys Ile Gly His Phe Leu Gly Lys Asp Glu325 330 335gac atc tac gtc ttc ttt gat ccc gag tac cct tct gaa tcc aaa gta 1056Asp Ile Tyr Val Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser Glu Ser Lys Val340 345 350aag cca gag ggc ggc tca gca tca ctt gac cgg agg ccg aac ggg agg 1104Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Asp Arg Arg Pro Asn Gly Arg355 360 365cca cca tcg aat ggc agg agt aac tcc agg aac cca cag tcc agg aca 1152Pro Pro Ser Asn Gly Arg Ser Asn Ser Arg ASn Pro Gln Ser Arg Thr370 375 380cag aag gcg cag cag gct gca tcc gag agg tca tcc tca tca agt cac 1200Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ser Ser Ser Ser His385 390 395 400agc agc acg agc agc aac cac gac tgg cgc gaa ggg tcc tcg gtc ctt 1248Ser Ser Thr Ser Ser Asn His Asp Trp Arg Glu Gly Ser Ser Val Leu405 410 415gat ctc aag ggc gag aac tac ttc tcc tgc gcc gtc ggg agg aag cgg 1296Asp Leu Lys Gly Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly 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420 425 430tct aac gcc cgc tac ttg ctg agc tcg tcg gag gag gtt gtc tcc ttc 1344Ser Asn Ala Arg Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Glu Glu Val Val Ser Phe435 440 445ctc aaa gag ttg gcg aca gcg aca gct ggc ttc cag gcc acc tgt gct 1392Leu Lys Glu Leu Ala Thr Ala Thr Ala Gly Phe Gln Ala Thr Cys Ala450 455 460gac tac atg cat gtt ctt gga taggcagtaa atagactgaa gttgaagcct 1443Asp Tyr Met His Val Leu Gly465 470ccgtgcttta ccagagacag agagaagaag aatattcatt cctcgtatgc gcgacagagc 1503tacacccgta gctagtcagc gtgctgtaca atcatgtaca aaatttatgc tcgtgataaa 1563actgcgagag gggagctagc aaatgggaaa ggataaagga gtttagttgc ttctggtacg 1623agacacaatc gcctgatttt gagttctctt taaaaaaaaa cccaaaaaaa aaaaaaaaaa 1683aaactcgagg gggggcccgg taancnttcg cggttttgcg aaatgatttc aacgnngatn 1743ngcctccgct1753<210>48<211>471<212>PRT<213>玉蜀黍<400>48Arg Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Tyr Val Ala Cys Gln Gly Ser1 5 10 15Lys Lys Gly Val Leu Ile Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gln Ser20 25 30Leu Gly Ala Gly Ala Ile Leu Val Asn Pro Trp Asn Ile Thr Glu Val35 40 45Ala Asp Ser Ile Arg His Ala Leu Thr Met Pro Ser Asp Glu Arg Glu50 55 60Lys Arg His Arg His Asn Tyr Ala His Val Thr Thr His Thr Ala Gln65 70 75 80Asp Trp Ala Glu Thr Phe Val Phe Glu Leu Asn Asp Thr Val Ala Glu85 90 95Ala Leu Leu Arg Thr Arg Gln Val Pro Pro Gly Leu Pro Ser Gln Met100 105 110Ala Ile Gln Gln Tyr Leu Arg Ser Lys Asn Arg Leu Leu Ile Leu Gly115 120 125Phe Asn Ser Thr Leu Thr Glu Pro Val Glu Ser Ser Gly Arg Arg Gly130 135 140Gly Asp Gln Ile Lys Glu Met Glu Leu Lys Leu His Pro Asp Leu Lys145 150 155 160Gly Pro Leu Arg Ala Leu Cys Glu Asp Glu Arg Thr Thr Val Ile Val165 170 175Leu Ser Gly Ser Asp Arg Ser Val Leu Asp Glu Asn Phe Gly Glu Phe180 185 190Lys Met Trp Leu Ala Ala Glu His Gly Met Phe Leu Arg Pro Thr Tyr195 200 205Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met Asp Cys Val210 215 220Asp Ser Val Lys His Val Phe Glu Tyr Phe Thr Glu Arg Thr Pro Arg225 230 235 240Ser His Phe Glu His Arg Glu Thr Ser Phe Val Trp Asn Tyr Lys Tyr245 250 255Ala Asp Val Glu Phe Gly Arg Leu Gln Ala Arg Asp Met Leu Gln His260 265 270Leu Trp Thr Gly Pro Ile Ser Asn Ala Ala Val Asp Val Val Gln Gly275 280 285Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ser Val Gly Val Thr Lys Gly Ala Ala290 295 300Ile Asp Arg Ile Leu Gly Glu Ile Val His Ser Glu Asn Met Ile Thr305 310 315 320Pro Ile Asp Tyr Val Leu Cys Ile Gly His Phe Leu Gly Lys Asp Glu325 330 335Asp Ile Tyr Val Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser Glu Ser Lys Val340 345 350Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Asp Arg Arg Pro Asn Gly Arg355 360 365Pro Pro Ser Asn Gly Arg Ser Asn Ser Arg Asn Pro Gln Ser Arg Thr370 375 380Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ser Ser Ser Ser His385 390 395 400Ser Ser Thr Ser Ser Asn His Asp Trp Arg Glu Gly Ser Ser Val Leu405 410 415Asp Leu Lys Gly Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly Arg Lys Arg420 425 430Ser Ash Ala Arg Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Glu Glu Val Val Ser Phe435 440 445Leu Lys Glu Leu Ala Thr Ala Thr Ala Gly Phe Gln Ala Thr Cys Ala450 455 460Asp Tyr Met His Val Leu Gly465 470<210>49<211>1558<212>DNA<213>玉蜀黍<220><221>CDS<222>(177)..(1268)<223>推斷的編碼序列<400>49cggagtattc tagtgcaagc actcacaaaa tgcctcgcat agtcgtaagt atggaatcca 60actaaatcag cacatagcac cgaccgaagc agctccaagc gggacggaag tgtccggtaa 120atctctgatg acgggaatgg tgtgtgcagg aaccacccga ccttcatatt gatgtc atg 179Met1gtc ctt gag gca ctt ggg cag gaa cat gag gtg gta gtc atg aca cca227Val Leu Glu Ala Leu Gly Gln Glu His Glu Val Val Val Met Thr Pro5 10 15gat tac atc ccc ctc ctg gta gtg ctg gta cac gac atc agc gaa cat275Asp Tyr Ile Pro Leu Leu Val Val Leu Val His Asp Ile Ser Glu His20 25 30ctg gtt agc acg ctt ata cgc gtc gaa atg gaa ctc aag ttg cat cct323Leu Val Ser Thr Leu Ile Arg Val Glu Met Glu Leu Lys Leu His Pro35 40 45gac tta aag ggt cct ctg gga gcc ctc tgt gag gat gag cgc act aca371Asp Leu Lys Gly Pro Leu Gly Ala Leu Cys Glu Asp Glu Arg Thr Thr50 55 60 65gtt att gtt ctt agt ggc agt gac agg agt gtt ctt gat gaa aat ttt419Val Ile Val Leu Ser Gly Ser Asp Arg Ser Val Leu Asp Glu Asn Phe70 75 80gga gaa ttc aaa atg tgg ttg gca gca gag cat ggg atg ttt tta cgc467Gly Glu Phe Lys Met Trp Leu Ala Ala Glu His Gly Met Phe Leu Arg85 90 95ccg act tat gga gaa tgg atg aca aca atg cct gag cat ctg aac atg515Pro Thr Tyr Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met100 105 110gat tgg gta gac agc gta aag cat gtt ttc gaa tac ttt aca gaa aga 563Asp Trp Val Asp Ser Val Lys His Val Phe Glu Tyr Phe Thr Glu Arg115 120 125acc cca aga tcc cat ttt gaa cat cgt gaa aca tca ttt gtg tgg aac 611Thr Pro Arg Ser His Phe Glu His Arg Glu Thr Ser Phe Val Trp Asn130 135 140 145tac aag tat gct gat gtt gaa ttt gga agg cta caa gca aga gat atg 659Tyr Lys Tyr Ala Asp Val Glu Phe Gly Arg Leu Gln Ala Arg Asp Met150 155 160ctg cag cac ttg tgg aca ggt ccg atc tca aat gca gct gtt gat gtt 707Leu Gln His Leu Trp Thr Gly Pro Ile Ser Asn Ala Ala Val Asp Val165 170 175gtt caa ggg agt cgg tca gtt gaa gtc cgg tct gtt gga gtt aca aag 755Val Gln Gly Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ser Val Gly Val Thr Lys180 185 190ggt gct gca att gat cgt att tta ggg gag ata gtt cac agc gaa aac 803Gly Ala Ala Ile Asp Arg Ile Leu Gly Glu Ile Val His Ser Glu Asn195 200 205atg gtt act cca att gat tat gtc ctg tgt ata ggg cat ttc ctt ggg 851Met Val Thr Pro Ile Asp Tyr Val Leu Cys Ile Gly His Phe Leu Gly210 215 220 225aag gat gag gac atc tat gtc ttt ttt gat ccg gsa tac cct tct gaa 899Lys Asp Glu Asp Ile Tyr Val Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser Glu230 235 240tcc aaa gta aaa cca gag ggt ggg tca gca tca ctt gac cgg agg cca 947Ser Lys Val Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Asp Arg Arg Pro245 250 255aat gga agg ccg gca tcg aat ggc aga agc aat tca agg aac cca cag 995Asn Gly Arg Pro Ala Ser Asn Gly Arg Ser Asn Ser Arg Asn Pro Gln260 265 270tcc agg cca cag aag gcg cag cag gct gca tcc gag agg tcg tcc tca 1043Ser Arg Pro Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ser Ser275 280 285tca agt cac agc agc act agc agc aac cac gac tgg cgc gaa ggg tcc 1091Ser Ser His Ser Ser Thr Ser Ser Asn His Asp Trp Arg Glu Gly Ser290 295 300 305tcg gtc ctc gat ctc aag gcc gag aac tac ttc tcc tgc gcc gtc gga 1139Ser Val Leu Asp Leu Lys Ala Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly310 315 320agg aag cgg tcc aac gcc cgt tac ctg ctg agt tcg tcg gag gag gtc 1187Arg Lys Arg Ser Asn Ala Arg Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Glu Glu Val325 330 335gtc tcc ttc ctc aaa gag ttg gca acg gaa aca gct ggc ttc cag tcc 1235Val Ser Phe Leu Lys Glu Leu Ala Thr Glu Thr Ala Gly Phe Gln Ser340 345 350agc tgt gct gat tac atg ttc ttg gat agg cag taaatagatt ggagcctccg 1288Ser Cys Ala Asp Tyr Met Phe Leu Asp Arg Gln355 360tgctttgcca gacaagcaca ctggaggggg ggaaaaccca ttcattcctc aaatgcgcga 1348cggagttaca cccagcgtgt tgtacaatcc tgtacaaaat ttatgctcgt gataaaactg 1408cgagagggtg gagcaaatgg aaaaggataa aattagttta gatttagggt ctgttcgtcg 1468caccaaaaat tgttccagtt gatcaaaatt tatacaaatt agagaagtaa tccgactcgg 1528aacagttccg gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1558<210>50<211>364<212>PRT<213>玉蜀黍<400>50Met Val Leu Glu Ala Leu Gly Gln Glu His Glu Val Val Val Met Thr1 5 10 15Pro Asp Tyr Ile Pro Leu Leu Val Val Leu Val His Asp Ile Ser Glu20 25 30His Leu Val Ser Thr Leu Ile Arg Val Glu Met Glu Leu Lys Leu His35 40 45Pro Asp Leu Lys Gly Pro Leu Gly Ala Leu Cys Glu Asp Glu Arg Thr50 55 60Thr Val Ile Val Leu Ser Gly Ser Asp Arg Ser Val Leu Asp Glu Asn65 70 75 80Phe Gly Glu Phe Lys Met Trp Leu Ala Ala Glu His Gly Met Phe Leu85 90 95Arg Pro Thr Tyr Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn100 105 110Met Asp Trp Val Asp Ser Val Lys His Val Phe Glu Tyr Phe Thr Glu115 120 125Arg Thr Pro Arg Ser His Phs Glu His Arg Glu Thr Ser Phe Val Trp130 135 140Asn Tyr Lys Tyr Ala Asp Val Glu Phe Gly Arg Leu Gln Ala Arg Asp145 150 155 160Met Leu Gln His Leu Trp Thr Gly Pro Ile Ser Asn Ala Ala Val Asp165 170 175Val Val Gln Gly Ser Arg Ser Val Glu Val Arg Ser Val Gly Val Thr180 185 190Lys Gly Ala Ala Ile Asp Arg Ile Leu Gly Glu Ile Val His Ser Glu195 200 205Asn Met Val Thr Pro Ile Asp Tyr Val Leu Cys Ile Gly His Phe Leu210 215 220Gly Lys Asp Glu Asp Ile Tyr Val Phe Phe Asp Pro Glu Tyr Pro Ser225 230 235 240Glu Ser Lys Val Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Asp Arg Arg245 250 255Pro Asn Gly Arg Pro Ala Ser Asn Gly Arg Ser Asn Ser Arg Asn Pro260 265 270Gln Ser Arg Pro Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ser275 280 285Ser Ser Ser His Ser Ser Thr Ser Ser Asn His Asp Trp Arg Glu Gly290 295 300Ser Ser Val Leu Asp Leu Lys Ala Glu Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val305 310 315 320Gly Arg Lys Arg Ser Asn Ala Arg Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Glu Glu325 330 335Val Val Ser Phe Leu Lys Glu Leu Ala Thr Glu Thr Ala Gly Phe Gln340 345 350Ser Ser Cys Ala Asp Tyr Met Phe Leu Asp Arg Gln355 360<210>51<211>935<212>DNA<213>玉蜀黍<220><221>CDS<222>(1)..(735)<223>推斷的部分編碼序列<400>51cgg tgg aac aac aaa gtt gtt cta ctg cag att gct gtg cca aca aga 48Arg Trp Asn Asn Lys Val Val Leu Leu Gln Ile Ala Val Pro Thr Arg1 5 10 15act gac gtc cct gaa tat caa aag cta acg agc caa gtg cat gaa atg 96Thr Asp Val Pro Glu Tyr Gln Lys Leu Thr Ser Gln Val His Glu Met20 25 30gcc act gtc acc gag ctc cag cgt ccc tca cgc gtc cag gcg gtg tcc 144Ala Thr Val Thr Glu Leu Gln Arg Pro Ser Arg Val Gln Ala Val Ser35 40 45gcc tac ttg tgg aag gtc ctc gcc gcc gtc gtg gcc gcg tgc cgc gtg 192Ala Tyr Leu Trp Lys Val Leu Ala Ala Vel Val Ala Ala Cys Arg Val50 55 60ccc gag gag cgg tgc tgc atg ggc tgg atg gtg gac gct cgg cgg cgg 240Pro Glu Glu Arg Cys Cys Met Gly Trp Met Val Asp Ala Arg Arg Arg65 70 75 80gtg aag tcg ccc gag ctg atc ccc gcg atg cgc aac tac ttc ggc aac 288Val Lys Ser Pro Glu Leu Ile Pro Ala Met Arg Asn Tyr Phe Gly Asn85 90 95gtc acg gcc tac gcg ctg ggc ggc gcg gcc gtg gag gag atc cgg cgg 336Val Thr Ala Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Ala Val Glu Glu Ile Arg Arg100 105 110aag ccg ctg gcc gag gtg gcg gcc atg gtg cgg gat acc atc acg tcc 384Lys Pro Leu Ala Glu Val Ala Ala Met Val Arg Asp Thr Ile Thr Ser115 120 125ata gac tac gac gag tac ctg cag gag ctg gtg gac tgg gtg gag gtg 432Ile Asp Tyr Asp Glu Tyr Leu Gln Glu Leu Val Asp Trp Val Glu Val130 135 140cac aag acg gag cac gtg atg gag aag ggc gtc ctc ggg ctg ggc tcg 480His Lys Thr Glu His Val Met Glu Lys Gly Val Leu Gly Leu Gly Ser145 150 155 160ccg acg ttg aac cag acc gtg ttc gcg tcg ttc ccg ctc gac acg aac 528Pro Thr Leu Asn Gln Thr Val Phe Ala Ser Phe Pro Leu Asp Thr Asn165 170 175ttc ggc ttc ggc gac gcc gcg ctc gcg ctg ccc atc tgc gac tat ggg 576Phe Gly Phe Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Pro Ile Cys Asp Tyr Gly180 185 190agg ctt tgt tcg ggc tac ctg tcc gtc gga gcg cgg cct gga ggc gac 624Arg Leu Cys Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Ala Arg Pro Gly Gly Asp195 200 205ggc tcc tgg ctc ctc agc gcc tac att tgg ccg cag atg gcg gcg gcg 672Gly Ser Trp Leu Leu Ser Ala Tyr Ile Trp Pro Gln Met Ala Ala Ala210 215 220ctg gag tcg gac ggc gtc ttt aag cct ctc acg gcg gag tat ctc ggt 720Leu Glu Ser Asp Gly Val Phe Lys Pro Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Gly225 230 235 240ctc aca gtc aca ccc tagcggcgac gtggtcgatc tacatgcgct gcatgcatat 775Leu Thr Val Thr Pro245cagatcagaa tcagatatcg ttcgtattgc tcattgttga ttgcatgatt gcgcgctacc 835ttgtattgtg tacgtcgttc gtgtaataat gttgcatggt ctcgggccag tgctaaataa 895aaatctctgt taattttctt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 935<210>52<211>245<212>PRT<213>玉蜀黍<400> 52Arg Trp Asn Asn Lys Val Val Leu Leu Gln Ile Ala Val Pro Thr Arg1 5 10 15Thr Asp Val Pro Glu Tyr Gln Lys Leu Thr Ser Gln Val His Glu Met20 25 30Ala Thr Val Thr Glu Leu Gln Arg Pro Ser Arg Val Gln Ala Val Ser35 40 45Ala Tyr Leu Trp Lys Val Leu Ala Ala Val Val Ala Ala Cys Arg Val50 55 60Pro Glu Glu Arg Cys Cys Met Gly Trp Met Val Asp Ala Arg Arg Arg65 70 75 80Val Lys Ser Pro Glu Leu Ile Pro Ala Met Arg Asn Tyr Phe Gly Asn85 90 95Val Thr Ala Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Ala Val Glu Glu Ile Arg Arg100 105 110Lys Pro Leu Ala Glu Val Ala Ala Met Val Arg Asp Thr Ile Thr Ser115 120 125Ile Asp Tyr Asp Glu Tyr Leu Gln Glu Leu Val Asp Trp Val Glu Val130 135 140His Lys Thr Glu His Val Met Glu Lys Gly Val Leu Gly Leu Gly Ser145 150 155 160Pro Thr Leu Ash Gln Thr Val Phe Ala Ser Phe Pro Leu Asp Thr Asn165 170 175Phe Gly Phe Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Pro Ile Cys Asp Tyr Gly180 185 190Arg Leu Cys Ser Gly Tyr Leu Ser Val Gly Ala Arg Pro Gly Gly Asp195 200 205Gly Ser Trp Leu Leu Ser Ala Tyr Ile Trp Pro Gln Met Ala Ala Ala210 215 220Leu Glu Ser Asp Gly Val Phe Lys Pro Leu Thr Ala Glu Tyr Leu Gly225 230 235 240Leu Thr Val Thr Pro24權(quán)利要求
1．一種表達(dá)海藻糖生物合成酶的異源基因的植物。
2．權(quán)利要求1的植物，在其核基因組中含有異源表達(dá)盒或其部分，其中含有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的植物，其在第一種異源表達(dá)盒或其部分中含有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列，并在第二種異源表達(dá)盒或其部分中含有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列。
4．根據(jù)權(quán)利要求2或3的植物，其中所述啟動(dòng)子是一種化學(xué)或創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
5．權(quán)利要求1的植物，在其質(zhì)體基因組中含有異源表達(dá)盒或其部分，其中含有編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，該序列處于一種能引導(dǎo)該核苷酸序列在該植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的植物，其含有一種編碼海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列，該序列處于一種能引導(dǎo)該核苷酸序列在該植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下，并且含有一種編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列，該序列處于一種能引導(dǎo)該核苷酸序列在該植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下。
7．權(quán)利要求6的植物，其中所述編碼海藻糖-6-磷酸合酶的核苷酸序列和所述編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列由操縱子樣多順?lè)醋踊蛑械膯螁?dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，其中該啟動(dòng)子能引導(dǎo)該操縱子樣多順?lè)醋踊蛟谠撝参锏馁|(zhì)體中表達(dá)。
8．權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的植物，其中所述啟動(dòng)子包括一種反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，其中相應(yīng)反式激活蛋白的表達(dá)處于一種能引導(dǎo)該反式激活蛋白在該植物中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下。
9．一種根據(jù)權(quán)利要求8的植物，其含有(a)一種異源核表達(dá)盒或其部分，其包含與編碼反式激活蛋白的核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子能引導(dǎo)該反式激活蛋白在該植物中的表達(dá)，其中該反式激活蛋白與質(zhì)體導(dǎo)向序列相融合；和(b)一種異源質(zhì)體表達(dá)盒或其部分，其包含由反式激活蛋白調(diào)節(jié)并與編碼至少一種海藻糖生物合成酶的核苷酸序列有效連接的反式激活蛋白介導(dǎo)的啟動(dòng)子。
10．權(quán)利要求8或9的植物，其中所述反式激活蛋白調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子包含一種T7基因10啟動(dòng)子，而所述相應(yīng)反式激活蛋白包含一種T7 RNA聚合酶。
11．權(quán)利要求8或9的植物，其中能引導(dǎo)所述反式激活蛋白在該植物中表達(dá)的所述啟動(dòng)子是一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子。
12．權(quán)利要求11的植物，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是化學(xué)或創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
13．權(quán)利要求5-12中任一項(xiàng)的植物，其中所述啟動(dòng)子由正常存在于該植物質(zhì)體中的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。
14．權(quán)利要求13的植物，其中所述RNA聚合酶是一種核編碼的聚合酶或質(zhì)體編碼的聚合酶。
15．權(quán)利要求14的植物，其中所述啟動(dòng)子是clpP啟動(dòng)子、16S r-RNA基因啟動(dòng)子、psbA啟動(dòng)子或rbcL啟動(dòng)子。
16．一種植物，在其質(zhì)體基因組中含有兩種或多種從操縱子樣多順?lè)醋踊蛑械膯螁?dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的基因，其中該啟動(dòng)子能引導(dǎo)該操縱子樣多順?lè)醋踊蛟谠撝参锏馁|(zhì)體中表達(dá)，其中該操縱子樣多順?lè)醋踊蜻M(jìn)一步含有一種位于該操縱子樣多順?lè)醋踊蛑袃蓚€(gè)基因之間的間插DNA序列。
17．一種根據(jù)權(quán)利要求16的植物，其中位于所述間插DNA序列直接下游的基因的表達(dá)得到增強(qiáng)。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的植物，其中所述間插DNA序列在該植物的質(zhì)體基因組中不存在。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的植物，其中所述間插DNA序列含有非真核5’UTR的一部分。
20．根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的植物，其中修飾所述間插DNA序列以防止在所述操縱子樣多順?lè)醋踊虻霓D(zhuǎn)錄中形成RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。
21．根據(jù)權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的植物，其中所述操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸环N包含編碼至少一種海藻糖生物合成酶的核苷酸序列的基因。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的植物，其中所述操縱子樣多順?lè)醋踊蚝幸环N包含編碼海藻糖磷酸合酶的核苷酸序列的基因和一種包含編碼海藻糖磷酸磷酸酶的核苷酸序列的基因。
23．根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物的種子。
24．一種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求7的植物的方法，包括(a)一種含有異源核表達(dá)盒或其部分的植物，此表達(dá)盒包含一種與編碼能調(diào)節(jié)反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子的反式激活蛋白的核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子與編碼能引導(dǎo)該反式激活蛋白在該植物中表達(dá)的反式激活蛋白的DNA序列有效連接，用該植物的花粉對(duì)一種含有包含反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子的異源質(zhì)體表達(dá)盒或其部分的植物傳粉，該啟動(dòng)子與編碼至少一種海藻糖生物合成酶的核苷酸序列或操縱子樣多順?lè)醋踊蛴行нB接；(b)從這樣傳粉的植物中回收種子；和(c)由所述種子培育上述植物。
25．一種在植物中產(chǎn)生海藻糖的方法，方法是在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
26．一種保護(hù)植物免于干旱、高鹽度、滲透壓協(xié)迫和極端溫度影響的方法，方法是在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
27．一種提高收獲植物的耐貯性的方法，方法是在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
28．一種延長(zhǎng)果實(shí)和蔬菜貯存時(shí)間和保存花的方法，方法是在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該果實(shí)、蔬菜和花中表達(dá)該基因的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
29．一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法，方法是在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，從該植物的核基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列，或者在能在該植物的質(zhì)體中表達(dá)該基因的啟動(dòng)子的控制下，從該植物的質(zhì)體基因組表達(dá)至少一種編碼海藻糖生物合成酶的核苷酸序列。
30．一種在植物質(zhì)體中從單一啟動(dòng)子開(kāi)始表達(dá)兩種或多種基因的方法，包括向該植物的質(zhì)體基因組中引入一種操縱子樣多順?lè)醋踊?，該基因包含與能在該植物質(zhì)體中表達(dá)該操縱子樣多順?lè)醋踊虻膯?dòng)子有效連接的所述兩種或多種基因，其中該操縱子樣多順?lè)醋踊蛄硗夂幸环N位于兩個(gè)基因之間的間插DNA序列。
31．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中位于所述間插DNA序列直接下游的基因的表達(dá)得到增強(qiáng)。
32．一種DNA分子，其含有編碼海藻糖生物合成酶或其部分的核苷酸序列。
33．根據(jù)權(quán)利要求32的DNA分子，其中所述核苷酸序列編碼海藻糖-6-磷酸合酶或其部分。
34．根據(jù)權(quán)利要求32的DNA分子，其中所述核苷酸序列編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶或其部分。
35．含有海藻糖生物合成酶或其部分的蛋白質(zhì)分子。
36．根據(jù)權(quán)利要求35的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)含有海藻糖-6-磷酸合酶或其部分。
37．根據(jù)權(quán)利要求35的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)含有海藻糖-6-磷酸磷酸酶或其部分。
38．一種植物，其含有包含根據(jù)權(quán)利要求32-34中任一項(xiàng)的DNA分子的表達(dá)盒或其部分，其中該表達(dá)盒穩(wěn)定整合于該植物的基因組中。
39．根據(jù)權(quán)利要求38的植物，其中該植物耐受逆境如干旱、滲透或溫度逆境。
40．一種植物表達(dá)盒，其含有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如創(chuàng)傷誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼海藻糖生物合成酶如海藻糖-6-磷酸合酶和/或海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列。
41．一種植物表達(dá)盒，其含有編碼海藻糖生物合成酶如海藻糖-6-磷酸合酶和/或海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列，所述核苷酸處于能引導(dǎo)該核苷酸序列在該植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下。
42．一種質(zhì)體表達(dá)盒，其含有一種由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶如核編碼聚合酶或質(zhì)體編碼聚合酶轉(zhuǎn)錄，并與編碼至少一種海藻糖生物合成酶如海藻糖-6-磷酸合酶和/或海藻糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子。
43．一種質(zhì)體表達(dá)盒，其含有一種能使海藻糖生物合成基因在植物質(zhì)體中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如由正常存在于質(zhì)體中的RNA聚合酶如核編碼聚合酶或質(zhì)體編碼聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，或由反式激活蛋白調(diào)節(jié)的反式激活蛋白介導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，當(dāng)反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶時(shí)為T(mén)7啟動(dòng)子)，它與一種含有編碼兩種海藻糖生物合成酶的核苷酸序列的操縱子樣多順?lè)醋踊蛴行нB接。
44．一種含有根據(jù)權(quán)利要求40-43中任一項(xiàng)的表達(dá)盒的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供例如在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)海藻糖生物合成基因的正常發(fā)育的新型轉(zhuǎn)基因植物,同時(shí)提供了提高所述植物逆境耐性的方法,提高食物質(zhì)量的方法,和制備和使用本發(fā)明的植物的其他方法。本發(fā)明也提供核苷酸序列編碼的新海藻糖生物合成酶。
文檔編號(hào)C12P19/12GK1292824SQ99803753
公開(kāi)日2001年4月25日 申請(qǐng)日期1999年3月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月11日
發(fā)明者E·G·利貝爾, P·B·海菲茲, S·A·高夫 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司