AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及 AtNF-YB-1 基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用，其特征在于：具有如SEQ.ID. NO.1所示的核苷酸序列，或至少80%同源性的序列，以及上述DNA片段編碼的蛋白或經(jīng)過修飾改造的具有相同功能的蛋白，將 AtNF-YB-1 基因轉(zhuǎn)入植物中獲得了抽穗開花明顯提前的品種，且不受長日照或短日照影響，均表現(xiàn)穩(wěn)定。為培育適應(yīng)性廣、生育期短的水稻提供了新的基因資源。
【專利說明】AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基因在促進植物抽穗提 前、縮短生育期中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物生長過程中抽穗（開花）期是植物生態(tài)適應(yīng)性的重要農(nóng)藝性狀，決定植物品種 適應(yīng)地區(qū)和季節(jié)的關(guān)鍵性狀。植物抽穗開花的早晚直接決定了生育期的長短，一般認(rèn)為在 最佳生長條件下，晚開花使得營養(yǎng)生長期延長，能夠積累更多的干物質(zhì)，產(chǎn)量更高；而在生 長季節(jié)較短或不可預(yù)知的環(huán)境中早開花則更有利。在水稻品種選育中，生育期的長短與品 種栽培適應(yīng)范圍也密切相關(guān)。因此，研究調(diào)控植物抽穗開花的基因及其作用機制對植物品 種選育具有重要的指導(dǎo)意義。
[0003] 其中比如水稻L.)是世界上最重要的禾谷類作物之一，全世界約 40%的人口，其主要食物來源于水稻。水稻同樣也是我國最重要的糧食作物之一，水稻產(chǎn)量 的高低，直接影響到我國的糧食安全以至國家安全。
[0004] 目前，已有20多個控制水稻抽穗期的基因被克隆，比較經(jīng)典的就是故//(Masahiro ei a乂 The Plant Cell, 2000，12: 2473-2483.)在長日照條件下，抑制水稻抽穗， 短日照條件下，促進抽穗；/-- (Shoko ei Plant Cell Physiol, 2002，43(10): 1096-1105)能促進水稻抽穗；如7) (Wei Plant Physiology, 2010， 153(4):1747-1758; Yan et al. Molecular Plant, 2011,4(2): 319-330 ；Dai et al. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 790-799; Gao et al. PNAS, 2013，110 (35): 14492-14497.)在長日照條件下，延遲抽穗，短日照條件下，促進抽穗開 花。對于抽穗期基因來說，由于各地光周期的差異，不同地區(qū)就需要選擇不同類型的光敏感 材料以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐墓庹諚l件。在這種情況下，篩選不受光周期影響的控制抽穗期的基因就 顯得尤為重要。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種控制植物抽穗期基因具有如 SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列，或至少80%同源性的序列，以及上述DNA片段編碼的蛋 白或經(jīng)過修飾改造的具有相同功能的蛋白，將基因轉(zhuǎn)入植物中獲得了抽穗開花 明顯提前的品種，且不受長日照或短日照影響，均表現(xiàn)穩(wěn)定。為培育適應(yīng)性廣、生育期短的 水稻提供了新的基因資源。
[0007] 本發(fā)明中，基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用，通過 基因，SEQ. ID. No. 1或與其功能等同的同源基因在水稻植株中超量表達(dá)，使其 蛋白基因的序列具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列至少80%同源性的序列，來達(dá)到調(diào)控植 株的抽穗期從而提高農(nóng)作物地區(qū)適應(yīng)性、雜交親本的花期調(diào)節(jié)和提高作物產(chǎn)量。
[0008] 所述AtNF-YB-I基因序列是通過植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，所述植物表達(dá)載體為 在載體pCXUN的多點克隆位點間插入所述AtNF-YB-I基因得到的植物過表達(dá)載體。
[0009] 所述植物為水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜蓿等。
[0010] 本發(fā)明中AtNF-YB-I基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用，其特征在 于：包括以下步驟： (1) 根據(jù)AtNF-YB-I基因序列設(shè)計PCR擴增引物對，其引物序列為：002-F : 5'-GGGTTTCCATCTTCCCCAATCTAG-3'，002-R :5'-GCAACTTCTTTTACCA GCTCGGC-3，； (2) 以擬南芥cDNA為模板，利用上述引物，通過PCR擴增獲得AtNF-YB-I基因全序列； (3) 將PCR產(chǎn)物克隆至pCXUN載體上，經(jīng)測序正確，得到植物表達(dá)載體 VCWM-AtNF-YB-U (4) 采用凍融法將植物表達(dá)載體pCXUN-AtNF-YB-1導(dǎo)入農(nóng)桿菌中成工程菌； (5) 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、直接DNA轉(zhuǎn)化法將載體pCXUN- J?Λ^-7^-7導(dǎo)入植物中，篩 選獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0011] 步驟（5)中采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為利用將帶有AtNF-YB-I基因的植物表達(dá)載體 轉(zhuǎn)入植物愈傷組織中，轉(zhuǎn)化后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)、脫菌、篩選、分化、生根、壯苗和移栽，篩選 轉(zhuǎn)基因植物植株。
[0012] 所述AtNF-YB-I基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中應(yīng)用的工程菌，其特征 在于：所述工程菌含有植物表達(dá)載體PCXUN-AtNF-YB-I的工程菌。
[0013] 所述工程菌含有植物表達(dá)載體pCXUN-AtNF-YB-1的農(nóng)桿菌LBA4404,具體為 LBA4404- pCXUN-AtNF-ΥΒ-Ι〇
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點在于： (1) 利用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化植物，可培育出抽穗開花早的植物品種，為調(diào)控植 物生育期提供了新的基因資源； (2) 利用基因進行轉(zhuǎn)基因育種可縮短育種周期； (3) 本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物，比如水稻，不管是在長日照地區(qū)還是短日照地區(qū)， 均能促進抽穗開花10-15天，因而利用該基因所培育的植物適應(yīng)性廣、生育期短，能適應(yīng)不 同生態(tài)型和季節(jié)性。
[0015] 本發(fā)明將基因轉(zhuǎn)入植物，比如水稻中獲得了抽穗開花明顯提前的品 種，且不受長日照或短日照影響，均表現(xiàn)穩(wěn)定。為培育適應(yīng)性廣、生育期短的水稻提供了新 的基因資源。
[0016] 本發(fā)明利用基因在植物，比如水稻中過表達(dá)，得到了生育期明顯縮短 (10-15天）的植株，且不受長日照或短日照的光周期影響。為培育短生育期、適應(yīng)不同生態(tài) 型和季節(jié)型的水稻品種提供了一條新的途徑。
[0017]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為J基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜，其中M為DNA marker。
[0019] 圖2為重組質(zhì)粒pCXUN-J ?Λ^-7Α-7檢測目的基因 J 的PCR擴增產(chǎn)物電 泳圖譜，其中M為DNA marker ;Ρ為回收產(chǎn)物為模板的陽性對照；N為不加模板的空白對照； 1，2分別為不同的單菌落。
[0020] 圖3為重組質(zhì)粒pCXUN-JiM^-7沒-7經(jīng)feMl I的酶切驗證電泳圖，其中M為DNA marker〇
[0021] 圖4為pCXUN-J質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
[0022] 圖5為水稻遺傳轉(zhuǎn)化流程圖，其中A為誘導(dǎo)的愈傷組織；B為抗性愈傷組織篩選； C為抗性愈傷分化初期；D為抗性愈傷分化出苗；E為生根培養(yǎng)。
[0023] 圖6為用φ?/J引物和對TO代分化植株進行PCR檢測的電泳圖譜， 其中A為φ? JJ PCR檢測結(jié)果；B為PCR檢測結(jié)果；M為DNA marker ;Ρ為質(zhì)粒 pCXUN-A，H7為模板；N為非轉(zhuǎn)基因水稻Kasalath總DNA為模板；1、2、3、4為4個獨立 的潮霉素抗性再生植株。
[0024] 圖7為轉(zhuǎn)基因植株mRNA表達(dá)水平的檢測，其中WT為非轉(zhuǎn)基因水稻 Kasalath總RNA雜交結(jié)果；Pl、P2、P3、P4為4個獨立的轉(zhuǎn)基因株系。
[0025] 圖8為6-BA和Hyg溶液處理葉片結(jié)果，其中A為二葉齡葉片處理結(jié)果；B為四葉 齡葉片處理結(jié)果。
[0026] 圖9為T-DNA在水稻基因組的整合情況示意圖，其中002A、002B、002C分別表示不 同轉(zhuǎn)基因株系，A、B、C、D、E分別表示水稻基因組上的不同編碼基因。
[0027] 圖10為轉(zhuǎn)基因水稻盆栽試驗，其中WT為非轉(zhuǎn)基因水稻Kasalath品種；002C為一 個轉(zhuǎn)基因株系。
[0028] 圖11為轉(zhuǎn)基因水稻在田間表型，其中A為在成都種植；B為在海南種植；WT為非轉(zhuǎn) 基因水稻Kasalath品種；002A為一個轉(zhuǎn)基因株系。
[0029] 圖12為轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株抽穗時間比較，其中WT為非轉(zhuǎn)基因植株； 002A、002B、002C :為不同的轉(zhuǎn)化株系；A表示2013年夏季在四川省成都市取樣調(diào)查結(jié)果；B 表示2012年冬季在海南省陵水縣取樣調(diào)查結(jié)果。
[0030]

【具體實施方式】
[0031] 實施例1 基因的克隆 按照如下步驟進行： 目的基因片段的擴增根據(jù)Genbank上基因序列，利用Primer5. 0軟件分別 設(shè)計目標(biāo)基因的上游和下游引物，以擬南芥cDNA為模板，進行PCR擴增，所述引物序列為： 002-F :5'-GGGTTTCCATCTTCCCCAATCTAG-3'，002-R :5'-GCAACTTCTTTTACCA GCTCGGC-3'。PCR 反應(yīng)體系為：擬南芥 cDNA 2 μ L，10XPCR Buffer 5 μ L，dNTP Mixture (2.5 mM) 4 μ L，002 引物（10 μ Μ,北京華大基因）1 μ L，ExTaq (5 U/μ L) 0.5 μ L，補ddH20至50 μ L，所用PCR試劑購自TakaRa公司。PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4 min ; 94°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸30 s，30個循環(huán)；72°C總延伸8 min。電泳檢測， 結(jié)果(見圖1)所得PCR擴增產(chǎn)物大小約為500 bp，切下目的條帶，用膠回收試劑盒(Axygen 公司）進行膠回收，按照試劑盒說明書進行。
[0032] 實施例2 植物表達(dá)載體pCXUN-Ji#/^-7A-7的構(gòu)建 按照如下步驟進行： (1)重組質(zhì)粒pCXUN-Ji#/^-7A-7的連接 用ZcM (美國NEB公司)雙酶切pCXUN質(zhì)粒4h將質(zhì)粒上cco?因切除，并獲得含T的 粘性末端，酶切反應(yīng)體系：10 XNEBuffer2 5 μ L，ZcM 1 μ L, pCXUN 質(zhì)粒 15 μ L，加 CldH2O 至50 μ L，電泳檢測酶切后為兩條帶，一條大帶11000 bp左右，另一條小帶約700 bp，切膠 回收大條帶，用膠回收試劑盒(Axygen公司）進行。將回收后的質(zhì)粒大條帶(含T的粘性末 端）與實施例1所得基因片段回收產(chǎn)物(含A尾）進行連接：質(zhì)粒DNA和基因片段DNA的摩 爾數(shù)比為0. 03 pmol:0. 1~0. 3 pmol，按照測定濃度加入相應(yīng)體積的回收產(chǎn)物混合至5 yL， 再加入5 yL等體積的SolutionI (TakaRa公司DNA Ligation試劑盒）充分混勻，16 °C 連接過夜。
[0033] (2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 操作步驟如下： ① 取上述方法新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，或從-70 °C冰箱中取出一管感受態(tài)細(xì)胞（50 μ L)，冰上自然融化； ② 將5-10 μ L DNA的連接物加入一管感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后放置冰上30 min ; ③ 42 °C水浴中熱激恰恰45 sec，迅速取出立即放于冰上2 min; ④ 室溫恢復(fù)3~5 min左右，加入800 --L 37 °C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37 °C、180 rpm 培養(yǎng)1-2 h ; ⑤ 培養(yǎng)菌液于室溫4000 rpm離心10 min，去掉800 --L上清液，將剩余的50 --L菌 液混勻，全部加入含相應(yīng)抗生素的LB固體平板上； ⑥ 用無菌的涂布棒將菌液均勻涂布，晾于超凈臺上30 min左右至菌液完全被培養(yǎng)基 吸收； ⑦ 37 °C倒置暗培養(yǎng)12-14 h。
[0034] (3)重組質(zhì)粒的鑒定 于轉(zhuǎn)化次日挑取轉(zhuǎn)化子于LB+Kan進行液體培養(yǎng)，同時進行菌落PCR檢測，引物為002， PCR反應(yīng)體系同實施例1中，將反應(yīng)條件中預(yù)變性時間增至8 min，選取菌落PCR檢測為陽 性(如圖2)的克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒(步驟按Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒操作)，用I進 行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致（如圖3)，初步表明基因片段已經(jīng)整 合進pCXUN載體，再將質(zhì)粒送去測序，經(jīng)測序結(jié)果驗證插入的片段正確。將構(gòu)建好的植物表 達(dá)載體命名為pCXUN- 沒-7 (其構(gòu)建示意圖見圖4)。
[0035] (4)重組質(zhì)粒pCXUN-JiM^-7S-7轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 首先是制備農(nóng)桿菌感受態(tài)，操作步驟如下：取本實驗室-70 °C保存的農(nóng)桿菌LBA4404 用YEP+40 mg.L-1 Rif+50 mg· L-1 Str固體培養(yǎng)基劃單菌落活化第一次，再挑取單菌落 用YEP+40 mg.171 Rif+50 mg· Γ1 Str液體培養(yǎng)基活化至第二次0D600=0.3~0.5可用于 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：①將菌液冰浴30 min ;②取I mL菌液于I. 5 mL EP管中，4 °C 5000 rpm離心5 min，去上清；(D用滅菌的0. I M CaCl2 (預(yù)冷）400 μ L懸浮菌體(用移液 槍輕輕打勻）;@冰上放置30 11^11，4 1：5000印111離心5 1^11，去上清；?用50~100以1^預(yù) 冷的0.1 M CaCl2懸浮菌體，4 °C保存10 h備用或者加20-30%的滅菌甘油混勻，液氮速凍 后于-70 °C保存。
[0036] 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCXUN-J采用凍融法導(dǎo)入制備好的農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞中：①取重組質(zhì)粒10 μ L (3-5 μ g)，加入一管100 μ L的LBA4404感受態(tài)細(xì) 胞中，輕輕混勻；②立即冰上放置30 min，迅速投入液氮中2 min;③迅速放入37 °C水浴至 完全融化；?加入800 μ L無抗生素的YEP液體培養(yǎng)基，輕輕混勻；振蕩培養(yǎng)活化（28 °C， 200 rpm, 3-5 h);⑤室溫離心（4000 rpm, 5 min),去上清，余下100 μ L菌液重懸菌體混勻； ⑥將100 μ L重懸活化菌液均勻涂布到Y(jié)EP+40 mg · Γ1 Rif+50 mg · Γ1 Str+100 mg · Γ1 Kan固體篩選培養(yǎng)基平板上；⑦28 °C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2~3天至長出菌落大小適中，挑選 抗性單菌落在含YEP+40 mg *L 1 Rif+50 mg · L 1 Str+100 mg · L 1 Kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 ③當(dāng)培養(yǎng)菌液達(dá)到一定濃度后做目的基因(引物為002)和抗性標(biāo)記基因潮霉素 Hygr的PCR檢測(檢測目的基因的PCR體系和條件同前，潮霉素 Hygr的PCR檢測方法與目 的基因類似，引物為 HptII-F :5' -CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3' ；HptII-R :5' -CGATGTAGGA GGGCGTGGATATG-3'）。將構(gòu)建好的工程菌命名為 LBA4404- pCXUN-JiM^-Z沒-7。
[0037] 實施例3 遺傳轉(zhuǎn)化水稻 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將導(dǎo)入水稻愈傷組織，經(jīng)潮霉素 B篩選獲得轉(zhuǎn) 基因植株，所用基本培養(yǎng)基Ν6和MS salts購自PhytoTechnology Laboratories。
[0038] 轉(zhuǎn)化步驟如下(轉(zhuǎn)化流程見圖5): ①水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)：去殼的水稻成熟種子先用70%乙醇浸泡30秒，然 后用〇. 1%升汞浸泡8-10 min，進行表面滅菌（最好在搖床上進行），無菌水沖洗7-8次，再 將種子放在無菌濾紙上吸干水分后，放在成熟胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CM上，光照周期為：33°C 光照14 h，30 °C暗培養(yǎng)10 h。約10-15天后，剝下成熟胚盾片長出的愈傷組織，轉(zhuǎn)入成熟 胚繼代培養(yǎng)基CIM上，在相同條件下繼代培養(yǎng)。以后每兩周繼代培養(yǎng)一次。浸染前三天，將 愈傷組織切成2-4毫米大小轉(zhuǎn)至新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行預(yù)培養(yǎng)。
[0039] ②農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和準(zhǔn)備：將農(nóng)桿菌LBA4404- pCXUN-JiM^-ZS-i在LB+50 mg/L Str+100 mg/L Kan平板上劃線，19°C暗培養(yǎng)三天。用接種環(huán)挑取少量菌懸浮于15毫升浸染 培養(yǎng)基頂+100 μ M AS中，調(diào)整菌體濃度0D550=0. 06-0. 08,即為轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮 液。
[0040] ③農(nóng)桿菌浸染與共培養(yǎng)：將預(yù)培養(yǎng)的水稻愈傷組織接入15毫升浸染培養(yǎng)基 +100 μ M乙酰丁香酮中預(yù)洗一遍倒掉液體，再將準(zhǔn)備好的15毫升農(nóng)桿菌懸浮液倒入，輕輕 搖動2分鐘。倒掉菌液，將愈傷組織放在無菌濾紙上吸去多余菌液，隨即轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基上， 19 °C暗培養(yǎng)三天。
[0041] ④洗菌與抗性愈傷組織的篩選：將共培養(yǎng)三天后的愈傷組織，先用無菌水洗7-8 次，再用浸染培養(yǎng)基+250mg/L羧芐青霉素+10mg/L萬古霉素洗一次，將愈傷組織放在無菌 濾紙上吸去多余的液體，轉(zhuǎn)入加篩選培養(yǎng)基SM上（33°C光照14 h，30 °C暗培養(yǎng)10 h)，每14 天繼代一次，篩選2次。
[0042] ⑤抗性愈傷組織的分化：從經(jīng)兩輪篩選后長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色致 密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含有分化培養(yǎng)基RMI上，約14-20天左右有綠點出現(xiàn)，30天左右進一 步分化成小苗。
[0043] ⑥轉(zhuǎn)基因苗生根、壯苗、移栽：當(dāng)抗性愈傷組織分化的芽長至約2-4厘米時，將小 苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右再轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周。選擇高約10厘米、 根系發(fā)達(dá)的小苗，用溫水洗去培養(yǎng)基，在溫室內(nèi)移栽入土。水面以不淹沒小苗為度，如果天 晴，需要遮蔭到小苗成活（以吐水為準(zhǔn))。
[0044] 實施例4 TO代轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測 (1)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測 經(jīng)實施例3 -共獲得42株轉(zhuǎn)化植株，用CTAB法提取DNA (操作步驟參照《分子克隆實 驗指南》（第二版）（J.薩姆布魯克等人，1992))，以潮霉素抗性基因盡J/和沒-7 的特異引物對轉(zhuǎn)化植株進行常規(guī)PCR檢測。分別以非轉(zhuǎn)基因水稻Kasalath總DNA和質(zhì)粒 pCXUN-Ji，H7為模板，在相同條件下進行PCR擴增作為陰性和陽性對照。經(jīng)鑒定篩選獲 得了 38株陽性植株(部分植株P(guān)CR檢測結(jié)果見圖6)。
[0045] (2)陽性植株的Northern檢測 對PCR鑒定為陽性的部分植株，取葉片提取RNA (步驟按天根生化科技有限公司 TRNzol-A+總RNA提取試劑說明書進行)，進行Northern雜交(步驟按Roche DIG-Northern Starter試劑盒說明書進行)，檢測目的基因 mRNA表達(dá)水平，以非轉(zhuǎn)基因水稻 Kasalath為陰性對照(部分結(jié)果見圖7)。
[0046] 實施例5轉(zhuǎn)基因植株后代遺傳分析及田間性狀調(diào)查 (1)轉(zhuǎn)基因植株后代遺傳分析 對轉(zhuǎn)基因植株后代進行分離比鑒定，采用6-芐氨基腺嘌呤（6-BA)和潮霉素 B (Hyg) 溶液浸泡葉片的方法，每個株系隨機選取20株植株，剪取I cm左右的葉子浸泡在I. 0 mg/ L 6-BA +50 mg/L Hyg溶液中，25 °C，16h光照/8h黑暗放置4天后觀察葉片狀況，記錄葉 片綠色和黃色的比例，轉(zhuǎn)基因陽性植株的葉片仍為綠色，而非轉(zhuǎn)基因植株葉片部分或全部 變黃或變褐。篩選符合3:1孟德爾遺傳規(guī)律的株系(單拷貝植株)。并隨機選取Hyg浸泡后 為綠色和黃色的植株提取DNA，進行PCR驗證結(jié)果。對T2代植株采用同法鑒定，篩選全部為 陽性的株系，即為單拷貝的純合株系，用于后續(xù)實驗。最終篩選獲得了 11個單拷貝轉(zhuǎn)基因 株系，部分Hyg溶液處理葉片結(jié)果見圖8。
[0047] (2) T-DNA插入轉(zhuǎn)基因植株基因組位置的確定 對得到的11個單拷貝純合轉(zhuǎn)基因株系，通過Tl代和T2代田間小量種植，我們發(fā)現(xiàn) 這些株系相對非轉(zhuǎn)基因水稻Kasalath均有不同程度提前抽穗開花的特性。選取三個表型 最明顯的株系，命名為002A、002B、002C，對其進行T-DNA在基因組上的整合位置的分析。 分別提取基因組DNA，采用feoRI和歷·α1ΙΙΙ雙酶切DNA，再在酶切片段的兩端連入接頭， 通過用接頭引物和T-DNA上特異引物PCR，將PCR產(chǎn)物測序，從而獲得T-DNA在基因組上 側(cè)翼序列信息（具體步驟參照 O'Malley RC, Alonso JM, Kim CJ, et al. An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome. Nature protocols, 2007，2(11): 2910-2917·)。結(jié)果顯不， 這三個株系T-DNA整合在水稻基因組的不同位置，插入位置示意圖如9。結(jié)果證明，這三個 株系為不同的獨立轉(zhuǎn)化事件，并且其共有表型(抽穗提前)不是由T-DNA插入突變所致，而是 由轉(zhuǎn)入的基因引起的。
[0048] (3)田間性狀調(diào)查 將002A、002B、002C三個株系的T3代種子和非轉(zhuǎn)基因水稻Kasalath分別種植在四川 省成都市(夏季，自然長日照）和海南省陵水縣英州鎮(zhèn)(冬季，自然短日照)，種10X10株，三 個重復(fù)。隨機各取30株調(diào)查抽穗時間，結(jié)果表明，無論在成都還是海南，轉(zhuǎn)基因株系都比對 照提前抽穗10-15天左右（圖10)。證明基因能促進水稻抽穗提前、縮短生育期， 而且不受光周期調(diào)控，具有很好的地區(qū)適應(yīng)性。
[0049] 我們還對2013年在成都種植材料進行了其他農(nóng)藝性狀調(diào)查，如株高、有效分蘗 數(shù)、穗長、枝梗數(shù)等(如表1)。由表1可知，轉(zhuǎn)AtHAP3a基因的植株平均株高比對照矮20多 cm，呈極顯著差異（P < 0. 01)，且穗長、枝梗數(shù)、穗粒數(shù)、單株谷粒重和千粒重都極顯著低于 非轉(zhuǎn)基因植株，但是有效穗數(shù)與對照差別不明顯(除002C株系)。所有這些變化可能都是由 于抽穗期縮短，使得營養(yǎng)生長期縮短，從而積累的營養(yǎng)物質(zhì)也減少所致。
[0050] 表1.轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀調(diào)查表

【權(quán)利要求】
1. AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用，所述AtNF-YB-1基因 的序列如SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用， 其特征在于：所述AtNF-YB-1蛋白基因的序列如SEQ. ID. NO. 2所示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用， 其特征在于：所述AtNF-YB-1基因序列是通過植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，所述植物表達(dá)載 體為在載體PCXUN的多點克隆位點間插入所述AtNF-YB-1基因得到的植物表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用， 其特征在于：所述植物為水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜蓿。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育 期中的應(yīng)用，其特征在于：包括以下步驟： (1) 根據(jù)AtNF-YB-1基因序列設(shè)計PCR擴增引物對，其引物序列為：002-F :5'-GGGTTTCCATCTTCCCCAATCTAG-3'，002-R :5'-GCAACTTCTTTTACCA GCTCGGC-3，； (2) 以擬南芥cDNA為模板，利用上述引物，通過PCR擴增獲得AtNF-YB-1基因全序列； (3) 將PCR產(chǎn)物克隆至pCXUN載體上，經(jīng)測序正確，得到植物表達(dá)載體 vC\\M-AtNF-YB-U (4) 采用凍融法將植物表達(dá)載體pCXUN-AtNF-YB-1導(dǎo)入農(nóng)桿菌中成工程菌； (5) 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將載體pCXUN- 導(dǎo)入植物中，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植 物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中的應(yīng)用， 其特征在于：步驟（5)中采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為利用將帶有AtNF-YB-1基因的植物表達(dá) 載體轉(zhuǎn)入植物愈傷組織中，轉(zhuǎn)化后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)、脫菌、篩選、分化、生根、壯苗和移栽， 篩選轉(zhuǎn)基因植物植株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中應(yīng)用的 工程菌，其特征在于：所述工程菌含有植物表達(dá)載體pCXUN-AtNF-YB-1的工程菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的AtNF-YB-1基因在促進植物抽穗提前、縮短生育期中應(yīng)用的 工程菌，其特征在于：所述工程菌含有植物表達(dá)載體pCXUN-AtNF-YB-1和農(nóng)桿菌LBA4404， 具體為 LBA4404- pCXUN-AtNF-YB-1。
【文檔編號】C12N1/21GK104498505SQ201410742140
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】陳克貴, 彭梅芳 申請人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所