專利名稱：一種能源植物小桐子基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組DNA提取方法，具體為一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的植物基因組DNA提取方法中，多采用的是CTAB(2%)法，但小桐子屬于大戟 科，是多乳汁型的植物，即使是在葉片中乳汁含量也很高，含有大量的多糖和多酚成分，傳 統(tǒng)的陽(yáng)離子型去污劑十六烷及三甲基溴化銨(2%CTAB)法是無(wú)法有效去除這些雜質(zhì)以獲 得高質(zhì)量的基因組DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，提供一種能有效去除雜質(zhì)，優(yōu)化DNA提取和純化 操作流程的一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法，包括以下步驟a)DNA的提取先采集小桐子新鮮的嫩葉片，用蒸餾水清洗干凈，將葉片表面水分 擦凈；將葉片0. 1-0. 2克在研缽中加液氮磨成粉末，研磨的時(shí)候加入約IOmg聚乙烯吡咯 烷酮(PVP-40)以防止氧化；再將研磨的粉末轉(zhuǎn)移到2mL離心管，加入0.5ml 65°C預(yù)熱的 4父07^抽提緩沖液(4%07^，201111 EDTA,3. 5MNaCl, IOOmM Tris-HCl pH 8.0和2% β-巰 基乙醇)，充分搖勻，再于65°C水浴90分鐘，每5分鐘緩慢搖動(dòng)一次，使混合物進(jìn)一步充分 混勻；待混合物冷至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇(24 1，V V—1)輕柔混勻并抽提， 每次抽提時(shí)間為5分鐘；以8000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心8分鐘后取上層液體；用氯仿/異戊醇 (24 1,V V—1)重復(fù)抽提一次；定量移取上層清液于新的2ml離心管中，再加入5M NaCl (在 混合液中達(dá)到終濃度為2M)和0. 6倍體積的異丙醇，室溫孵育1小時(shí)；移取上清液，加入2 倍體積80%乙醇，并在室溫放置10分鐘，以使DNA沉淀；以10，000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心15分 鐘；棄上層液體，獲得DNA沉淀，并用70 %乙醇漂洗2次后，室溫或通氣風(fēng)干DNA，用200uLTE 溶液溶解。b) DNA的純化在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37"C處理 30分鐘以去除RNA ；加入等體積的Tris飽和酚，混合均勻(注意動(dòng)作輕柔，避免引起DNA斷 裂)，直至形成乳白狀混合物；以10，000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心5分鐘；將上清液移至新的2mL 離心管；再用氯仿/異戊醇(24 1, V V—1)抽提兩次；移取的上清液用0.6倍體積的異丙 醇(NaCl終濃度為2. 0M)孵育10分鐘；移取上清液，加入20uL醋酸鈉和1倍體積的80%乙 醇，靜置30分鐘，以10，000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心15分鐘，收獲DNA沉淀；沉淀的DNA用70% 乙醇洗滌2次，風(fēng)干后用50uL TE溶液溶解。C)于_20°C下保存?zhèn)溆?。d)用紫外分光光度計(jì)在260nm、280nm和230nm下對(duì)DNA進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)。
一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中增加了提取緩沖液CTAB的濃度，達(dá)到 了 4%。提取緩沖液的NaCl濃度達(dá)到了 3. 5M，優(yōu)化了能源植物小桐子基因組DNA的提取。一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中，在DNA的純化中增加了用Tris飽和 酚單獨(dú)抽提的步驟，純化了能源植物小桐子基因組DNA的提取。一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中，使用的是在2. OM NaCl條件下用 80%乙醇進(jìn)行DNA的沉淀，且所有步驟可以在室溫下操作這樣獲得小桐子優(yōu)質(zhì)的基因組 DNA適于各種分子遺傳研究方面應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)效果表現(xiàn)在可提取高質(zhì)量的能源植物小桐子基因組DNA，并能用 于小桐子的種群遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記輔助育種等研究。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法，包括以下步驟a)DNA的提取先采集小桐子新鮮的嫩葉片，用蒸餾水清洗干凈，將葉片表面水分 擦凈；將葉片0. 1-0. 2克在研缽中加液氮磨成粉末，研磨的時(shí)候加入約IOmg聚乙烯吡咯 烷酮(PVP-40)以防止氧化；再將研磨的粉末轉(zhuǎn)移到2mL離心管，加入0.5ml 65°C預(yù)熱的 4父07^抽提緩沖液(4%07^，201111 EDTA,3. 5MNaCl, IOOmM Tris-HCl pH 8.0和2% β-巰 基乙醇)，充分搖勻，再于65°C水浴90分鐘，每5分鐘緩慢搖動(dòng)一次，使混合物進(jìn)一步充分 混勻；待混合物冷至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇(24 1, V V—1)輕柔混勻并抽提， 每次抽提時(shí)間為5分鐘；以8000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心8分鐘后取上層液體；用氯仿/異戊醇 (24 1,V V—1)重復(fù)抽提一次；定量移取上層清液于新的2ml離心管中，再加入5M NaCl (在 混合液中達(dá)到終濃度為2M)和0. 6倍體積的異丙醇，室溫孵育1小時(shí)；移取上清液，加入2 倍體積80%乙醇，并在室溫放置10分鐘，以使DNA沉淀；以10，000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心15分 鐘；棄上層液體，獲得DNA沉淀，并用70 %乙醇漂洗2次后，室溫或通氣風(fēng)干DNA，用200uLTE 溶液溶解。b) DNA的純化在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37"C處理 30分鐘以去除RNA ；加入等體積的Tris飽和酚，混合均勻(注意動(dòng)作輕柔，避免引起DNA斷 裂)，直至形成乳白狀混合物；以10，000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心5分鐘；將上清液移至新的2mL 離心管；再用氯仿/異戊醇(24 1, V V—1)抽提兩次；移取的上清液用0.6倍體積的異丙 醇(NaCl終濃度為2. 0M)孵育10分鐘；移取上清液，加入20uL醋酸鈉和1倍體積的80%乙 醇，靜置30分鐘，以10，000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心15分鐘，收獲DNA沉淀；沉淀的DNA用70% 乙醇洗滌2次，風(fēng)干后用50uL TE溶液溶解。C)于_20°C下保存?zhèn)溆?。d)用紫外分光光度計(jì)在260nm、280nm和230nm下對(duì)DNA進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)。一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中增加了提取緩沖液CTAB的濃度，達(dá)到 了 4%。提取緩沖液的NaCl濃度達(dá)到了 3. 5M，優(yōu)化了能源植物小桐子基因組DNA的提取。一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中，在DNA的純化中增加了用Tris飽和 酚單獨(dú)抽提的步驟，純化了能源植物小桐子基因組DNA的提取。
一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法中，使用的是在2. OM NaCl條件下用 80%乙醇進(jìn)行DNA的沉淀，且所有步驟可以在室溫下操作這樣獲得小桐子優(yōu)質(zhì)的基因組 DNA適于各種分子遺傳研究方面應(yīng)用。運(yùn)用一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法可提取高質(zhì)量的能源植物小桐子 基因組DNA，并能用于小桐子的種群遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記輔助育種等研究。
權(quán)利要求
一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法，其特征在于包括以下步驟a)DNA的提取先采集小桐子新鮮的嫩葉片，用蒸餾水清洗干凈，將葉片表面水分擦凈；將葉片0.1 0.2克在研缽中加液氮磨成粉末，研磨的時(shí)候加入約10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 40)；再將研磨的粉末轉(zhuǎn)移到2mL離心管，加入0.5ml 65℃預(yù)熱的4×CTAB抽提緩沖液(4％CTAB，20mM EDTA，3.5M NaCl，100mM Tris HCl pH 8.0和2％β 巰基乙醇)，充分搖勻，再于65℃水浴90分鐘，每5分鐘緩慢搖動(dòng)一次；待混合物冷至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1，V V 1)輕柔混勻并抽提，每次抽提時(shí)間為5分鐘；以8000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心8分鐘后取上層液體；用氯仿/異戊醇(24∶1，V V 1)重復(fù)抽提一次；定量移取上層清液于新的2ml離心管中，再加入5M NaCl(在混合液中達(dá)到終濃度為2M)和0.6倍體積的異丙醇，室溫孵育1小時(shí)；移取上清液，加入2倍體積80％乙醇，并在室溫放置10分鐘，以使DNA沉淀；以10,000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心15分鐘；棄上層液體，獲得DNA沉淀，并用70％乙醇漂洗2次后，室溫或通氣風(fēng)干DNA，用200uLTE溶液溶解。b)DNA的純化在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37℃處理30分鐘以去除RNA；加入等體積的Tris飽和酚，混合均勻直至形成乳白狀混合物；以10,000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心5分鐘；將上清液移至新的2mL離心管；再用氯仿/異戊醇(24∶1，V V 1)抽提兩次；移取的上清液用0.6倍體積的異丙醇(NaCl終濃度為2.0M)孵育10分鐘；移取上清液，加入20uL醋酸鈉和1倍體積的80％乙醇，靜置30分鐘，以10,000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心15分鐘，收獲DNA沉淀；沉淀的DNA用70％乙醇洗滌2次，風(fēng)干后用50uL TE溶液溶解。c)于 20℃下保存?zhèn)溆?。d)用紫外分光光度計(jì)在260nm、280nm和230nm下對(duì)DNA進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因組DNA提取方法，具體為一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法。一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法，其特征在于包括以下步驟a)DNA的提??；b)DNA的純化；c)于-20℃下保存?zhèn)溆?；d)用紫外分光光度計(jì)在260nm、280nm和230nm下對(duì)DNA進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)。通過(guò)一種能源植物小桐子基因組DNA提取方法可提取高質(zhì)量的能源植物小桐子基因組DNA，并能用于小桐子的種群遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記輔助育種等研究。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101985618SQ200910263600
公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者尹春英, 焦娟玉, 胡尚連, 阮莉萍, 陳珂 申請(qǐng)人:陳珂