專利名稱：八角基因組dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種頑拗類植物基因組DNA的提取方法，具體涉及八角基因組DNA的提取方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
頑勘類植物(Recalcitrant plant taxa)是指那些由于特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)和高含量次生產(chǎn)物而使得基因組DNA的提取非常困難的一類植物。這些次生產(chǎn)物主要包括多糖、多酚、蛋白質(zhì)以及其他一些未知的粘性極強(qiáng)的化合物。提取DNA時，它們通常與核基因組DNA共同沉淀或者捆綁在一起，嚴(yán)重地影響了 DNA質(zhì)量，導(dǎo)致擴(kuò)增、酶切等分子操作難以進(jìn)行。有許多林木樹種屬于這一類植物，八角便是其中的一種。 )\兔(Jllicium verum Hook. f.)為八角科(Illiciaceae)八角屬(i77icia Linn.)植物，常綠喬木，是我國南亞熱帶地區(qū)特有的一種經(jīng)濟(jì)價值很高的香料樹種，也是著名的“藥食同源”的樹種之一。八角葉片中含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、莽草酸、維生素等次生物，這讓它具有了較高的利用價值，但同時給其基因組DNA的提取也帶來了較大的困難。采用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行八角種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，揭示其遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)狀況，對于高效地建立八角種質(zhì)資源基因庫、八角遺傳育種以及八角種質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)利用具有非常重要的指導(dǎo)意義?；蚪MDNA的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，常用的基因組DNA提取方法有CTAB法、改良CTAB法、SDS法、高鹽沉淀法、試劑盒等。采用上述幾種方法提取八角基因組DNA時都出現(xiàn)研磨樣加入提取液后變得非常粘稠，提取的DNA樣品由于含有大量的次生物不易溶于TE緩沖液，纏攪在其中的粘性物致使DNA檢測時上樣困難、電泳困難。凝膠電泳檢測顯示DNA得率很低，上樣孔或樣道非常亮(見圖I 4)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決八角次生物含量高導(dǎo)致的高質(zhì)量DNA提取困難的問題，本發(fā)明對常用的CTAB方法加以改良，同時結(jié)合試劑盒提取的某些步驟，獲得了一種八角基因組DNA提取的有效方法。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)一種八角基因組DNA的提取方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟
(1)按每100g八角粉末加入6 8 L提取液的量，在八角粉末中加入55 65°C的CTAB提取液，混勻，在55 65°C下保溫30 60分鐘，其間晃動3 4次，使其充分混合，得混合物；
(2)將步驟(I)的混合物在轉(zhuǎn)速為8000 12000rpm下，離心分離5 10分鐘，得到上清液A ；
(3)在步驟(2)所得上清液A中加入等體積的氯仿與異戊醇溶液，其中，氯仿異戊醇的體積比為24 1，混勻后在室溫下靜置5 10分鐘，再在8000 12000 rpm下離心分離5 10分鐘，取出上清液；在上清液中再次加入等體積的體積比為24 I的氯仿與異戊醇溶液，混勻后室溫靜置5 10分鐘，離心分離，得到上清液B ；
(4)按上清液B體積的2 3倍的量，在上清液B中，加入-30°C的無水乙醇，產(chǎn)生絮狀沉淀，離心得沉淀物；
(5)采用植物DNA提取試劑盒的吸附柱將步驟(4)所得沉淀物，按試劑盒程序進(jìn)行漂洗、室溫靜置、離心洗脫，得洗脫液； (6)將步驟(5)所得的洗脫液返回到吸附柱中，室溫下靜置5 10分鐘，再在8000 12000 rpm下離心分離2分鐘，所得的液體即為八角基因組DNA溶液。所述步驟(I)的八角粉末是在八角葉片或者枝條或者果實或者其它部位中(干樣)，按常規(guī)加入液氮研磨成的粉末。所述步驟(I)的CTAB提取液為母液是含有I. 4 mol/L的NaCI、100 mmol/L的Tris-HCI,20 mmol/L的EDTA的混合溶液，母液的pH為8. 0，常規(guī)滅菌；使用時在每IOOml母液中加入3g的CTAB，2g的PVP和2ml的β -巰基乙醇。上述母液(200mL)的配制是先稱取 16. 363g NaCI、2.428g Tris-base、I. 489gEDTA,再用HCl調(diào)pH為8· 0，然后定容至200 mL。所述步驟(5)的試劑盒為北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的Solarbio植物基因組DNA提取試劑盒。所述步驟(5)使用吸附柱時，若出現(xiàn)黃綠色，需加入無水乙醇600 UL后，再離心分離。本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果
(1)對傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行了改良，提高了提取液中CTAB的含量；同時加大了提取液的用量，由通常的干樣的10 20倍提高到60 80倍；這樣不僅去除了部分蛋白等次生物，還讓盡量多的DNA (或其螯合物)溶于上清液中，以得到量大、純度高的八角基因組DNA ；
(2)利用試劑盒吸附柱和漂洗液去除殘留的多糖、蛋白質(zhì)等次生物，提高DNA的純度。(3)如果只運用CTAB法(或SDS、高鹽法)，雖得到的八角基因組DNA量大，但雜質(zhì)太多，尤其多糖難以去除，無法得到高質(zhì)量DNA (如圖I 3);如果只運用試劑盒法，一是用的樣品量和提取液量很有限，二是樣品粉末加入提取液后變得特別粘稠，致使吸附柱完全被阻塞，此法去雜質(zhì)的效果較好，但DNA的得率卻非常的低(如圖4)。本發(fā)明綜合了 CTAB法和試劑盒提取方法的特點，得到高質(zhì)量的與雜質(zhì)徹底分離的八角基因組DNA。經(jīng)檢測用本發(fā)明方法得到的八角基因組DNA質(zhì)量較高，這可由圖5清楚看到；用該八角基因組DNA進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，得到較好的擴(kuò)增結(jié)果，如圖6所示。


圖I傳統(tǒng)CTAB法提取的八角DNA凝膠電泳檢測圖片；
圖2傳統(tǒng)SDS法提取的八角DNA凝膠電泳檢測圖片；
圖3傳統(tǒng)高鹽法提取的八角DNA凝膠電泳檢測圖片；
圖4試劑盒法提取的八角DNA凝膠電泳檢測圖片；
圖5本發(fā)明方法提取的八角DNA凝膠電泳檢測圖片；
圖6本發(fā)明方法提取的DNA的RAPD-PCR擴(kuò)增凝膠電泳檢測圖片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實施例I
(1)在O.I g八角葉片(干樣)中加入液氮研磨成粉末；
(2)在步驟(I)的八角葉片粉末中加入651的CTAB提取液6 mL，充分混勻，在65 °C水浴下保溫40分鐘，其間晃動4次，使其充分混合，得混合物；其中CTAB提取液為母液是含有 I. 4 mol/L 的 NaCIUOO mmol/L 的 Tris_HCI、20 mmol/L 的 EDTA 的混合溶液，其配制如下稱取 16. 363 g 的 NaCI、2.428 g 的 Tris-base、I. 489 g 的 EDTA，用 HCl 調(diào) pH 為 8. 0，然后定容至200 mL,并經(jīng)常規(guī)滅菌處理；使用時在200ml母液中加入3g的CTAB，4g的PVP和4ml的β -巰基乙醇；
(3)將步驟(2)所得混合物在12000rpm轉(zhuǎn)速下，離心分離10分鐘，得到上清液A ;
(4)在步驟(3)的上清液A中加入等體積的氯仿與異戊醇溶液，且氯仿異戊醇的體積比為24 I，混勻后在室溫下靜置5分鐘，再在12000 rpm下離心分離10分鐘，取出上清液；在上清液中再次加入等體積的氯仿異戊醇溶液(24 1)，混勻后室溫靜置并離心，得到上清液B ；
(5)按上清液B體積的2.O倍量，在步驟(4)所得上清液B中，加入-30 °C的無水乙醇，混勻后產(chǎn)生絮狀沉淀，離心得沉淀物；
(6)將步驟(5)的沉淀物采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的Solarbio植物基因組DNA提取試劑盒，并按該試劑盒的操作程序進(jìn)行如下操作
在12000 rpm下離心分離I分鐘，除去廢液；若出現(xiàn)黃綠色，加入無水乙醇600 uL后再離心分離；
在吸附柱中加入600 uL試劑盒中的漂洗液，再在12000 rpm下離心分離I分鐘，除去廢液；
將吸附柱放在室溫下靜置5分鐘；
在吸附柱正中加入試劑盒中的洗脫液50 uL，室溫下靜置5分鐘，再在12000 rpm下離心分離2分鐘；
(7)將步驟(6)離心后所得的洗脫液返回到吸附柱中，室溫下靜置5分鐘，再在12000rpm下離心分離2分鐘，所得的液體即為八角基因組DNA溶液。實施例2
(1)在O.I g八角葉片(干樣)中加入液氮研磨成粉末；
(2)在步驟(I)的八角葉片粉末中加入50t^^CTAB提取液8mL，充分混勻，在50 °〇水浴下保溫60分鐘，其間晃動3次，使其充分混合，得混合物；其中CTAB提取液同實施例I ;
(3)將步驟(2)的混合物在轉(zhuǎn)速為8000rpm下，離心分離8分鐘，得到上清液A ;
(4)在步驟(3)所得上清液A中加入等體積的氯仿異戊醇溶液，其中氯仿異戊醇的體積比為24 1，混勻后在室溫下靜置10分鐘，再在8000 rpm下離心分離10分鐘，取出上清液；在上清液中再次加入等體積的氯仿異戊醇溶液(24 1)，混勻后室溫靜置并離心，得到上清液B ；
(5)按上清液B體積的2.5倍量，在步驟(4)所得上清液B中，加入-30 °C的無水乙醇，混勻后產(chǎn)生絮狀沉淀，過濾分離得沉淀物；
(6)將步驟(5)的沉淀物采用與實施例I相同的試劑盒，并按試劑盒的操作程序進(jìn)行如下操作
在10000 rpm下離心I分鐘，除去廢液；
在吸附柱中加入600 uL試劑盒中的漂洗液，再在10000 rpm下離心分離I分鐘，除去廢液；
將吸附柱放在室溫下靜置5分鐘；
在吸附柱正中加入試劑盒中的洗脫液或TE 80 uL，室溫靜置5分鐘，再在10000 rpm下離心分離2分鐘；
(7)將步驟(6)離心后所得的洗脫液加回到吸附柱中，室溫靜置5分鐘，再在10000rpm下離心分離2分鐘，所得的液體即是八角基因組DNA溶液。實施例3
(1)在O.I g八葉片角樣品(干樣)中加入液氮研磨成粉末；
(2)在步驟(I)的八角粉末中加入預(yù)熱551的CTAB提取液7 mL，充分混勻，在55 V水浴下保溫30分鐘，其間晃動3次，使其充分混合，得混合物；其中CTAB提取液同實施例I ;
(3)將步驟(2)的混合物在10000rpm轉(zhuǎn)速下，離心分離8分鐘，得到上清液A ;
(4)在步驟(3)所得上清液A中加入等體積的氯仿異戊醇溶液，其中氯仿異戊醇的體積比為24 1，混勻后在室溫下靜置8分鐘，再在10000 rpm下離心分離8分鐘，取出上清液；在上清液中再次加入等體積的氯仿異戊醇溶液(24 1)，混勻后室溫靜置并離心，得到上清液B ；
(5)按上清液B體積的3.0倍量，在步驟(4)所得上清液B中，加入-30°C的無水乙醇，混勻后產(chǎn)生絮狀沉淀，過濾分離得沉淀物；
(6)將步驟(5)的沉淀物采用與實施例I相同的試劑盒，并按試劑盒的操作程序進(jìn)行如下操作
在8000 rpm下離心I分鐘，除去廢液；
在吸附柱中加入600 uL試劑盒中的漂洗液，再在8000 rpm下離心分離I分鐘，除去廢
液；
將吸附柱放在室溫下靜置8分鐘；
在吸附柱正中加入試劑盒中的TE 100 uL，室溫靜置10分鐘，再在8000 rpm下離心分離2分鐘； (7)將步驟(6)離心后所得的洗脫液返回到吸附柱中，室溫靜置5分鐘，再在8000rpm下離心分離2分鐘，所得的液體即是八角基因組DNA溶液。
權(quán)利要求
1.一種八角基因組DNA的提取方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟 (1)按每100g八角粉末加入6 8 L提取液的量，在八角粉末中加入預(yù)熱55 65 V的CTAB提取液，混勻，在55 65 °C下保溫30 60分鐘，其間晃動3 4次，使其充分混合，得混合物； (2)將步驟(I)的混合物在轉(zhuǎn)速為8000 12000rpm下，離心5 10分鐘，得到上清液A ； (3)在步驟(2)所得上清液A中加入等體積的氯仿與異戊醇溶液，其中，氯仿異戊醇的體積比為24 1，混勻后在室溫下靜置5 10分鐘，再在8000 12000 rpm下離心分離5 10分鐘，取出上清液；在上清液中再次加入等體積的體積比為24 I的氯仿與異戊醇溶液，混勻后室溫靜置5 10分鐘，離心分離，得到上清液B ; (4)按上清液B體積的2 3倍的量，在上清液B中加入-30°C的無水乙醇，產(chǎn)生絮狀沉淀，離心得沉淀物； (5)采用植物DNA提取試劑盒的吸附柱將步驟(4)所得沉淀物，按試劑盒操作程序進(jìn)行漂洗、室溫靜置、離心洗脫，得洗脫液； (6)將步驟(5)所得的洗脫液返回到吸附柱中，室溫下靜置5 10分鐘，再在8000 12000 rpm下離心2分鐘，所得的液體即為八角基因組DNA溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的八角基因組DNA的提取方法，其特征在于所述步驟(I)的CTAB提取液為母液是含有 I. 4 mol/L 的 NaCI、100 mmol/L 的 Tris_HCI、20 mmol/L 的 EDTA的混合溶液，母液的PH為8. 0，常規(guī)滅菌；使用時在每IOOml母液中加入3g的CTAB，2g的PVP和2ml的β -巰基乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供一種八角基因組DNA的提取方法，在八角粉末中加入CTAB提取液，混勻，離心后得到上清液A；在上清液A中加入等體積的氯仿︰異戊醇溶液，混勻，離心，再在所得上清液中加入等體積的氯仿︰異戊醇溶液，混勻、靜置、離心分離得上清液B；在B中加入-30℃的無水乙醇后，離心得沉淀物；采用常規(guī)試劑盒所用的吸附柱再次純化沉淀物，經(jīng)洗脫、靜置、離心后，將所得的洗脫液再次返回到吸附柱中，離心得到的液體即為八角基因組DNA溶液。本發(fā)明綜合了CTAB法和試劑盒提取方法的特點，最終得到頑拗類植物八角高質(zhì)量的基因組DNA。
文檔編號C12N15/10GK102643802SQ20121014592
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月13日
發(fā)明者吳濤, 寧德魯, 張艷麗, 李勇杰, 毛云玲, 王洋, 白平, 耿樹香, 肖良俊, 谷麗萍, 賀娜, 陳少瑜, 陳海云, 馬婷 申請人:云南省林業(yè)科學(xué)院