專利名稱：含有Sh4基因的具有增加的顆粒大小的植物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以可表達的方式引入了 sh4基因的轉化植物。本發(fā)明還涉及通過雜交 以可表達的方式引入了功能型sh4基因的植物。本發(fā)明還涉及增加植物顆粒大小的方法， 其包括將sh4基因引入植物的步驟。
背景技術：
迄今，已鑒定出了幾種與植物顆粒大小相關的基因，但使用單一已知基因改變顆 粒大小并不容易。根據Li等(非專利文獻1)和Lin等(非專利文獻2)的報道，所有栽培稻均由于 具有sh4基因的點突變而顯示相對較低的脫粒性，從而促進了它們的馴化。sh4基因已經被 分離并報道，但對其生物學功能的發(fā)現僅限于脫粒性。與本發(fā)明相關的現有技術文獻如下所述現有技術文獻非專利文獻非專禾Ij 文獻 1 =Li C, Zhou A, Sang Τ. Rice domestication by reducingshattering. Science 2006 Mar 31 ；311 (5769) 1936-9. Epub 2006 Mar 9.PMID 16527928非專利文獻2 :Lin Ζ, Griffith ME, Li X，Zhu Z, Tan L, Fu Y, Zhang W, Wang X， Xie D,Sun C. Origin of seed shattering in rice(Oryza sativa L.). Planta. 2007 Jun ； 226(1) 11-20. Epub 2007 Jan 10. PMID : 17216230

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的。本發(fā)明的目標是通過將sh4基因引入植物的步 驟或通過表達從野生稻中發(fā)現的功能型sh4基因來提供具有增加顆粒大小的植物。解決問題的手段為了解決上述問題，本發(fā)明人努力研究了涉及植物馴化的基因。作為將具有來源 于野生稻的功能型等位基因的sh4基因通過轉化引入栽培稻，本發(fā)明人發(fā)現該引入導致谷 粒(hull)大小增加、促進轉運(translocation)，從而導致顆粒大小增加。測定TO植物種 子和觀察Tl植物的穗(panicles)的結果表明谷粒增大，而糙米重量增加到約1. 5倍(圖 2和圖3)。將引入了 sh4基因的Nipponbare栽培種種系的四株自交的Tl后代植物(T0_3后 代-1，Τ0-3后代-2，Τ0-3后代-3和Τ0-5后代-1)在人工氣候的室中培育，并測定其每穗 的谷粒重量(mg)(圖7)，每個植株的總谷粒數(能育的和不育的谷粒)(圖8)和每個植株 的穗重量(圖9)。其結果，發(fā)現這些植物與載體對照和Nipponbare相比具有顯著增加的谷 粒重量和每植株的穗重量(產量)(圖7至9)。每植株的穗數和總谷粒數并無差異(圖7和圖8)。而且，并無任何降低育性的作用，相反，育性可能增加了，但仍需要進一步分析(圖 8)。如圖6所示，在照片中可察覺到Tl植物種子和穗的變化。此時，育性在T0-3后代-1 和T0-3-后代-2中顯著較高，而穗重量，其對應于每植株的產量，為Nipponbare或載體對 照的產量的大約2. 5倍。而且，當sh4基因引入其他稻栽培種“Nikomaru”和“Oochikara”時，發(fā)現在這些 栽培種轉化當代的TO植物中能育顆粒的平均谷粒重量(mg)顯著增加(

圖10和圖11)。更具體而言，本發(fā)明人通過在植物中表達具有功能型等位基因的sh4基因成功地 增加了植物的顆粒大小，并顯示每植株的產量增加，并由此完成了本發(fā)明。更具體而言，本發(fā)明提供了下述[1]至[13][1] 一種具有增加的顆粒大小的植物，其包含下述(a)至(d)中任一項的DNA (a)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :3的蛋白質的DNA ；(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO :1或2的編碼區(qū)的DNA ；(c)編碼包含在氨基酸序列SEQ ID NO 3中取代、缺失、添加和/或插入一個或多 個氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質的DNA ；(d)與包含核苷酸序列SEQ ID NO :1或2的DNA在嚴格條件下雜交的DNA ；[2] [1]的植物，其中所述植物是單子葉植物；[3] [1]的植物，其中所述植物是禾本科植物；[4] 一種載體，其中以可表達的方式引入了下述(a)至(d)中任一項的DNA (a)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :3的蛋白質的DNA ；(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO :1或2的編碼區(qū)的DNA ；(c)編碼包含在氨基酸序列SEQ ID NO 3中取代、缺失、添加和/或插入一個或多 個氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質的DNA ；(d)與包含核苷酸序列SEQ ID NO 1或2的DNA在嚴格條件下雜交的DNA ；[5] 一種宿主細胞，其中引入了 [4]的載體；[6] 一種植物細胞，其中引入了 [4]的載體；[7] 一種轉化植物，其包含[6]的植物細胞；[8] 一種轉化植物，其是[7]的轉化植物的后代或克隆；[9] [7]或[8]的轉化植物的繁殖材料；[10] 一種增加植物顆粒大小的方法，其包括將下述(a)至(d)的DNA在所述植物 的細胞中表達(a)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :3的蛋白質的DNA ；(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO :1或2的編碼區(qū)的DNA ；(c)編碼包含在氨基酸序列SEQ ID NO 3中取代、缺失、添加和/或插入一個或多 個氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質的DNA ；(d)與包含核苷酸序列SEQ ID NO 1或2的DNA在嚴格條件下雜交的DNA ；[11] [10]的方法，其中所述植物是單子葉植物；[12] [10]的方法，其中所述植物是禾本科植物；和[13] [10]至[12]任一項所述的方法，其中通過雜交將所述DNA引入植物。
附圖簡述圖1描述了引入的基因組片段的概略圖。圖2顯示獨立的TO植物所附顆粒的平均重量。其顯示來自5個能育的顆粒的平 均值。當少于5個谷粒時，顆粒數標于圓括號中。圖3顯示TO植物上谷粒和糙米的照片。圖4顯示獨立的TO植物上每穗的顆粒數。每穗的顆粒數并無顯著差異。圖5顯示Tl植物上穗的照片。圖6顯示轉化體的稻谷粒[T2種子](A)和穗[Tl植物](B)，轉化體示于左側， Nipponbare示于右側。圖7顯示對來自引入了 sh4基因的Nipponbare栽培種種系的四個自交Tl后代植 株的每個穗測定的平均谷粒重量(mean hull weight) (mg)。從左向右，顯示了 T0-3植物的 三個自交Tl后代植物，一個T0-5后代植物，三個載體對照后代植物和三個Nipponbare植 物。尖括號中的數目表示穗數目，圓括號中的數目表示該穗上能育的顆粒的數目。由于空 間限制，在條形圖中每兩個條顯示一個栽培種的解說。T0-3后代-3認為是從中分離出sh4 的后代。圖8顯示引入了 sh4基因的Nipponbare栽培種種系的四個自交Tl后代植株的每 植株總谷粒數。從左向右顯示了 T0-3植物的三個自交Tl后代植物，一個T0-5后代植物， 三個載體對照后代植物和三個Nipponbare植物。T0-5后代-1的低總谷粒數的原因不明。圖9顯示引入了 sh4基因的Nipponbare栽培種種系的十個自交Tl后代植株的每 植株總穗重量(g)。從左向右，顯示了 T0-3植物的三個自交Tl后代植物，一個T0-5后代植 物，三個載體對照后代植物和三個Nipponbare植物。圖10顯示引入了 sh4基因的Nikomaru栽培種種系的自交Tl后代植株的每植株 的谷粒重量(mg)，從左向右，顯示了 18個自交Tl后代植物和三個載體對照后代植物。穗上 能育的谷粒數顯示在圓括號中。圖11顯示引入了 sh4基因的Oochikara栽培種種系的自交Tl后代植株的每植株 的谷粒重量(mg)，從左向右，顯示了 19個自交Tl后代植物和8個載體對照后代植物。在尖 括號中的數目表示穗數，圓括號中的數目表示在該穗上能育的谷粒數。
具體實施例方式本發(fā)明提供了通過將功能型的sh4基因引入植物或表達從野生稻發(fā)現的功能型 sh4基因而具有增加的顆粒大小的植物。根據多個研究文獻，本發(fā)明的sh4基因是在所有栽培稻中都有功能障礙的基因。 人們認為在稻馴化的早期，古代人類出于減少脫粒性以便于栽培的目的，選擇了其功能缺 陷的類型，由此確立了栽培稻，在栽培稻中似乎沒有攜帶其功能型等位基因者。由于具有功 能型等位基因的sh4基因具有增加植物顆粒大小的作用，可通過用編碼所述蛋白質的DNA 轉化植物來育成具有增加的顆粒大小的植物。而且，簡單地推測，通過將具有功能型等位基 因的sh4基因借助雜交引入的近乎等基因的株系，也應可期待其具有類似的作用。在本發(fā)明中，引入所述sh4基因的植物并無特別限定，但優(yōu)選為單子葉植物，更優(yōu) 選為禾本科植物，且最優(yōu)選為栽培稻。在本發(fā)明中，禾本科植物的栽培種并無特別限定，但優(yōu)選的實例可包括 “Nipponbare”、“Nikomaru” 和 “Oochikara”。在本發(fā)明中，“增加植物的顆粒大小”意指通過在植物中表達本發(fā)明的sh4基因而 增加收獲時顆粒的體積和重量。此外，增加谷粒(hull)大小和促進轉運的效果也相當于 “增加植物的顆粒大小”。增加顆粒大小的效果可能僅在植物的顆粒發(fā)育過程中出現。而且，增加效果可在所有的顆粒中或僅在特定的顆粒中觀察到。在本發(fā)明中“植物顆粒的大小是否增加”可通過測定每穗的谷粒重量(mg)或每植 株的穗重量(g)來確證。用于本發(fā)明的功能型sh4基因的基因組DNA的核苷酸序列示于SEQ IDNO :1，所述 基因ORF區(qū)的核苷酸序列示于SEQ ID NO :2，而由該DNA編碼的蛋白質的氨基酸序列示于 SEQ ID NO :3。功能缺陷的sh4蛋白質的氨基酸序列示于SEQ ID NO :4。用于本發(fā)明的DNA包含通過雜交轉移的染色體片段中的基因組DNA、基因組DNA、 cDNA和化學合成的DNA?；蚪MDNA和cDNA可通過本領域技術人員常用的方法來制備。舉 例而言，基因組DNA和cDNA可如下所述制備從具有本發(fā)明sh4基因的稻品種中提取出基 因組DNA，構建并開發(fā)基因組文庫(質粒、噬菌體、粘粒、BAC、PAC等可用作載體)，然后可以 使用以編碼本發(fā)明的sh4蛋白(例如，SEQ ID NO 2)的DNA為基礎制備的探針進行菌落或 噬菌斑雜交?；蛘?，基因組DNA還可通過構建對編碼本發(fā)明的sh4蛋白(例如，SEQ ID NO: 2)的DNA具有特異性的引物，然后用這些引物進行PCR來進行制備。cDNA可通過，例如下 述方法制備以從包含本發(fā)明的sh4基因的稻品種中提取的mRNA為基礎合成cDNA，將這些 cDNA插入λ ZAP等的載體，制備并開發(fā)cDNA文庫，然后按照如上所述的相同方法進行菌落 或噬菌斑雜交，或者PCR。用于本發(fā)明的DNA涵蓋編碼功能上等同于SEQ ID NO :3所示的sh4蛋白質的蛋白 質的DNA。本文中，短語“功能上等同于sh4蛋白質”意指所述蛋白質具有增加顆粒大小的 功能。這樣的DNA優(yōu)選來源于單子葉植物，更優(yōu)選來源于禾本科植物，且最優(yōu)選來源于常見 的野生稻。上述DNA包含編碼下述蛋白質的突變體、衍生物、等位基因、變體和同源物，所述 蛋白質包括，例如，在SEQ ID NO :3的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入一個或多個 氨基酸而得到的氨基酸序列。本領域技術人員眾所周知用于制備具有修飾的氨基酸序列的蛋白質的編碼DNA 的方法包括，例如，定點誘變方法。由于編碼核苷酸序列的突變而造成的蛋白質氨基酸序列 的突變也可天然發(fā)生。甚至編碼在天然的功能型sh4蛋白質的氨基酸序列中發(fā)生一個或多 個氨基酸取代、缺失或添加而得到的氨基酸序列的DNA包括在本發(fā)明的DNA中，只要所述 DNA編碼功能上等同于天然的功能型sh4蛋白質(SEQ ID NO :3)的蛋白質。而且，甚至當 核苷酸序列突變時，所述突變不一定涉及蛋白質中的氨基酸突變(簡并突變)。上述簡并突 變體也包括在本發(fā)明的DNA中。DNA是否為編碼具有增加植物顆粒大小的功能的蛋白質可通過下述方法來評估。 最常用的方法是評價引入了所述DNA的植物的顆粒大小。當植物的顆粒大小增加時，表明 所引入的DNA編碼具有增加所述植物顆粒大小的功能的蛋白質。其他本領域技術人員眾所周知的用于制備編碼功能上等同于SEQ IDNO 3所述的sh4蛋白質的蛋白質的DNA的方法包括使用雜交技術和聚合酶鏈式反應(PCR)技術的方法。 即，本領域技術人員通常可從稻和其他植物通過使用sh4基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 1 或2)或其部分作為探針，或者使用與sh4基因(SEQ ID N0:1或2)特異性雜交的寡核苷酸 作為引物來分離與sh4基因高度同源的DNA。此類可通過雜交技術和PCR技術來加以分離 的、編碼功能上等同于sh4蛋白質的蛋白質的DNA也包括在本發(fā)明的DNA中。為了分離這樣的DNA，雜交反應優(yōu)選在嚴格條件下進行。本發(fā)明中的嚴格雜交條 件指6M尿素、0.4% SDS和0.5x SSC的條件，或類似嚴格度的條件。使用更高的嚴格條 件，例如，6M尿素、0.4% SDS和0. Ix SSC的條件，可期待分離同源性更高的DNA。由此分 離的DNA被認為在氨基酸水平與sh4蛋白質的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)具有高度同源 性?！案叨韧葱浴敝冈谡麄€氨基酸序列中至少50%或更高、更優(yōu)選70%或更高、或甚至更 優(yōu)選90%或更高(例如，95%、96%、97%、98%或99%或更高)的序列同一性。氨基酸序 列的同一性或核苷酸序列的同一性可使用由Karlin和Altschul開發(fā)的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :2264_2268(1990) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 5873(1993))來 確定。已經開發(fā)了稱作BLASTN和BLASTX的基于BLAST算法的程序(Altschul，S. F.等 J. Mol. Biol. 215 =403(1990)) 0為了通過BLASTN分析核苷酸序列，其參數設定為，例如得分 (score) = 100、字長(word length) = 12。而通過BLASTX分析氨基酸序列所用的參數設 定為，例如，得分=50、字長=3。當使用BLAST和Gapped BLAST程序時，每個程序使用缺 省參數。上述分析的具體技術在本領域是已知的。本發(fā)明通過從由野生稻和栽培稻雜交所得的后代中選擇在sh4基因座位上具有 野生稻的功能型等位基因的植物，可以提供具有與其親本相比其顆粒大小更大的植物、其 后代、固定品系、栽培種等。所述野生型等位基因的引入應具有可專利性，因為其可增加顆 粒大小并賦予野生稻的sh4等位基因。野生稻等位基因的擁有可通過例如下述方式來加以 評價借助PCR擴增特定基因組位點等，再使用已知技術檢查DNA序列以確證報道的功能缺 陷型的氨基酸位點被轉化為功能型的氨基酸。而且，通過使用本發(fā)明的DNA，還可提供具有增加的顆粒大小的轉化植物。當產生 上述轉化的植物時，將本發(fā)明的蛋白質的編碼DNA(其可包含調節(jié)區(qū))插入合適的載體，將 其引入植物細胞，并對所得的轉化植物細胞進行再生。由本發(fā)明人分離的sh4基因具有增 加植物顆粒大小的作用，而且，通過將該sh4基因引入任何栽培種并將其高度表達，可增加 它們的品系的顆粒大小。該轉化是有利的，因為其與常規(guī)的通過雜交等的基因轉移相比需 要的時間較短，而且不會帶來其他表現型的改變。本發(fā)明還提供插入了上述的本發(fā)明DNA的載體。本發(fā)明的載體包括供在植物細胞 表達本發(fā)明DNA從而產生轉化的植物的載體。上述載體并無特別限定，只要其包含可在植 物細胞中轉錄的啟動子序列和具有穩(wěn)定轉化產物所需的多腺苷酸化位點的終止子序列。所 述載體包括，例如，“pBI121”、“pBI221”和“ρΒΙΙΟΓ，質粒(均來自Clontech) 0用于轉化植 物細胞的載體并無特別限定，只要其可在細胞中表達插入的基因。舉例而言，也可使用攜帶 供在植物細胞中組成型基因表達的啟動子(例如，花椰菜花葉病毒的25S啟動子)或攜帶 可由外源刺激誘導激活的啟動子的載體。本文中，“植物細胞”包括多種形式的植物細胞，例 如，懸浮的培養(yǎng)細胞、原生質體、葉節(jié)和愈傷組織。本發(fā)明的載體除了 sh4基因固有的啟動子之外，還可包含用于組成型或誘導型表
7達本發(fā)明蛋白質的啟動子。用于組成型表達的啟動子包括花椰菜花葉病毒的35S啟動子， 稻的肌動蛋白啟動子和玉米的泛素啟動子。此外，用于誘導型表達的啟動子包括已知通過，例如，外界原因而表達的啟動子， 所述外界原因如絲狀真菌、細菌或病毒的感染或侵襲，低溫，高溫，干燥，紫外線輻射以及特 定化合物的擴散等。上述啟動子包括，例如，稻幾丁質酶基因的啟動子和煙草I3R蛋白質基 因的啟動子，它們通過絲狀真菌、細菌或真菌的感染或侵襲而表達；稻“l(fā)ipl9”基因的啟動 子，其可被低溫誘導；稻“hsp80”基因和“hsp72”基因的啟動子，它們可被高溫誘導；擬南 芥(Arabidopsis thaliana) “rabl6”基因的啟動子，其可被干燥誘導；歐芹查耳酮合酶基 因的啟動子，其可被紫外線輻射誘導；以及玉米醇脫氫酶基因的啟動子，其在厭氧條件下可 被誘導。而且，稻幾丁質酶基因啟動子和煙草I3R蛋白質基因啟動子亦可被特定化合物如水 楊酸所誘導，而“rabl6”基因的啟動子亦可被脫落酸(一種植物激素)的擴散所誘導。本發(fā)明還提供了其中插入了本發(fā)明載體的轉化細胞。引入了本發(fā)明的載體的細胞 包括用于產生轉化的植物的植物細胞。植物細胞并無特別限定，包括，例如，稻、擬南芥、玉 米、馬鈴薯和煙草細胞。本發(fā)明的植物細胞除了培養(yǎng)細胞之外，還包括植物體中的細胞以及 原生質體，苗原基(shootprimordial)，多芽體(multiple shoots)和須根。載體可使用本 領域技術人員已知的多種方法引入植物細胞，如聚乙二醇法，電穿孔法，農桿菌法和基因槍 法。從轉化的植物細胞再生植物體可通過本領域技術人員已知方法根據植物細胞的類型來 進行。舉例而言，在稻中，已經確立了幾種用于產生轉化的植物體的技術，包括下述用聚乙 二醇將基因引入原生質體以再生植物體的方法(適用于秈稻品種)；用電脈沖將基因引入 原生質體以再生植物體的方法(適用于粳稻品種)；通過基因槍方法將基因直接引入細胞 中以再生植物體的方法；以及通過農桿菌將基因引入細胞以再生植物體的方法等。這些方 法在本發(fā)明的技術領域中廣泛使用。在此發(fā)明中，這些方法可優(yōu)選使用。轉化的植物細胞可通過再分化再生植物體。再分化的方法取決于植物細胞的類型 而不同。所述方法包括，例如，對于稻，Fujimura等的方法(PlantTissue Culture Lett. 2 74(1995))，對于玉米，Shillito 等(Bio/Technology 7:581(1989))和 Gorden-Kamm 等 的方法(Plant Cell 2 =603(1990))的方法；對于馬鈴薯，Visser等的方法(Theor. Appl. Genet 78 594(1989))；對于煙草，Nagata 和 Takebe 的方法(Planta 99 12(1971))；對于 擬南芥，Akama等的方法(PlantCell Reports 12:7-11 (1992))；以及對于桉，Dohi等的方 法(特開平8-89113號公報)。一旦獲得了其基因組中引入了本發(fā)明的DNA的轉化植物，則可通過有性或無性繁 殖從該植物獲得其后代。還可能從所述植物及其后代或克隆獲得繁殖材料(如種子、果實、 穗、塊莖、塊根、株(stub)，愈傷組織和原生質體)并基于這些材料來大量繁殖所述植物。本 發(fā)明涵蓋引入了本發(fā)明的DNA的植物細胞；包含上述植物細胞的植物，所述植物的后代和 克隆以及所述植物的繁殖材料及其后代和克隆。由此產生的顆粒大小增加的植物與野生型植物相比產量提高。本發(fā)明的技術可導 致改善的生產力。所有在該說明書中引用的現有技術文獻均以提述的方式并入本文。實施例在本文下文中，參照實施例對本發(fā)明進行具體描述，然而本發(fā)明不應解釋為受其限制。[實施例1]從攜帶A基因組的野生稻Oryza nivara提取基因組DNA來產生BAC文庫。從該 文庫通過PCR分離攜帶sh4基因區(qū)的基因組片段的BAC克隆，具體地說，是通過設計僅擴增 sh4區(qū)的特異性引物，并基于PCR擴增的有無來分離攜帶sh4基因區(qū)的BAC克隆。在此之 后，將所述BAC克隆片段化為幾kbp的短片段，將由此產生的DNA亞克隆入pUC18載體，確 定并拼裝每個亞克隆的DNA端序列，并確定0. nivara的sh4基因組區(qū)的DNA序列。從所得 的sh4區(qū)的基因組片段序列信息和從已知的sh4基因產物的信息推測出啟動子區(qū)等。通過 消化反應使用限制性酶KpnI和BamHI切出大約8. Skbp長的sh4基因區(qū)，將該基因組片段 引入pPZP 2H-lac載體以產生用于轉化的構建體。然后，將含有分離的功能型等位基因的 sh4基因調節(jié)區(qū)和編碼區(qū)的8.8-kb基因組片段(圖1，SEQ ID NO 1)通過用于單子葉植物 的超快速轉化技術的稻轉化方法(日本專利3141084號)轉移入兩個稻品系，Nipponbare 和NIL(qSHl) (Konishi等，2006)。使用抗生素潮霉素選擇轉化體。產生了大約10個獨立 的轉化品系，并測定了多種表現型如谷粒重量和脫粒性。[實施例2]收獲完全成熟的稻種，并對來自每個轉化品系的每個植物選擇5個能育的谷粒并 測定其重量。盡管有一定幅度的表現型變化(推定這是為位置效應所致)，但確證了谷粒重 量與載體對照相比顯著增加。在一些品系中增加了大約1. 5倍(圖2)。從外觀上也確證了 谷粒大小的增加和糙米大小的增加(圖3)。而且，就對每穗的谷粒數的影響而言，與載體對 照同樣，在sh4品系中幾乎未觀察到變化(圖4)。[實施例3]觀察引入了功能型sh4的品系中表現糙米大小顯著增加的植株的自交Tl后代品 系的穗。觀察到與TO同等的谷粒大小的增加(圖5)。[實施例4]根據實施例1的方法，將引入了 sh4基因的Nipponbare栽培種品系的四株自交的 Tl后代植物在人工氣候室中培育，并測定其每穗的谷粒重量(mg)。其結果，發(fā)現谷粒重量相比載體對照(通過僅將載體引入Nipponbare而產生的品 系)和Nipponbare顯著增加(圖7)。而且，對這些植物測定每植株的總谷粒數(能育的谷粒和不育的谷粒)(圖8)，和 每植株的穗重量(圖9)，并將其與載體對照和Nipponbare的相比較。其結果，發(fā)現T0-3后代與載體對照和Nipponbare相比顯示超過兩倍的產量(圖 8和圖9)。T0-5后代具有較少的能育谷粒和每植株的總谷粒數，且發(fā)現對產量的作用為零 (圖8和圖9)。[實施例5]根據與實施例1相似的方法，將sh4基因引入具有良好轉運特性的栽培種 “Nikomaru”和具有大稻顆粒大小特性的栽培種“Oochikara”。對這些栽培種轉化當代的TO 植物測定能育的谷粒的平均谷粒重量(mg)。其結果，與Nipponbare類似，在“Nikomaru”中確證了由于sh4基因的引入而引起 的稻谷粒重量的增加(圖10)。Oochikara天然的顆粒較大，重達每谷粒30mg，而發(fā)現通過引入sh4基因得到了谷粒重量超過40mg的轉化品系(圖11)。產業(yè)應用件根據世界人口現行的增加速率和谷物產量的增長來估計，在10年間全世界將發(fā) 生嚴重的谷物不足。而且，由于生物能量生產帶來的食品與能量生產之間競爭不斷加劇，谷 物不足可能比預測還要來得更早。因此，本發(fā)明可以改善對稻這種主要糧食作物的產量，可 能帶來具有產業(yè)意義的效果。稻是世界上大約一半人口(即，30億人)的主食，簡單地計算 下來，產量增加相當于保證了 3000萬人的主食。
權利要求
1.一種具有增加的顆粒大小的植物，其包含下述(a)至(d)中任一項的DNA:(a)編碼包含氨基酸序列SEQID NO :3的蛋白質的DNA ；(b)包含核苷酸序列SEQID NO :1或2的編碼區(qū)的DNA ；(c)編碼包含在氨基酸序列SEQID NO 3中取代、缺失、添加和/或插入一個或多個氨 基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質的DNA ；以及(d)與包含核苷酸序列SEQID NO :1或2的DNA在嚴格條件下雜交的DNA。
2.權利要求1的植物，其中所述植物是單子葉植物。
3.權利要求1的植物，其中所述植物是禾本科植物。
4.一種載體，其中以可表達的方式引入了下述(a)至(d)中任一項的DNA:(a)編碼包含氨基酸序列SEQID NO :3的蛋白質的DNA ；(b)包含核苷酸序列SEQID NO :1或2的編碼區(qū)的DNA ；(c)編碼包含在氨基酸序列SEQID NO 3中取代、缺失、添加和/或插入一個或多個氨 基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質的DNA ；以及(d)與包含核苷酸序列SEQID NO :1或2的DNA在嚴格條件下雜交的DNA。
5.引入了權利要求4的載體的宿主細胞。
6.引入了權利要求4的載體的植物細胞。
7.一種轉化植物，其包含權利要求6的植物細胞。
8.一種轉化植物，其是權利要求7的轉化植物的后代或克隆。
9.權利要求7或8的轉化植物的繁殖材料。
10.一種增加植物的顆粒大小的方法，其包括在所述植物的細胞中表達下述(a)至(d) 中任一項的DNA的步驟(a)編碼包含氨基酸序列SEQID NO :3的蛋白質的DNA ；(b)包含核苷酸序列SEQID NO :1或2的編碼區(qū)的DNA ；(c)編碼包含在氨基酸序列SEQID NO 3中取代、缺失、添加和/或插入一個或多個氨 基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質的DNA ；以及(d)與包含核苷酸序列SEQID NO :1或2的DNA在嚴格條件下雜交的DNA。
11.權利要求10的方法，其中所述植物是單子葉植物。
12.權利要求10的方法，其中所述植物是禾本科植物。
13.權利要求10-12任一項所述的方法，其中所述DNA通過雜交引入植物。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供含有功能型sh4基因和具有增加的顆粒大小的植物。為了解決這個問題，本發(fā)明人對涉及植物顆粒大小的基因進行了深入研究。通過將具有來源于野生稻的功能型等位基因的sh4基因通過轉化引入栽培稻(Nihonbare、Nikomaru和Oochikara)，本發(fā)明人顯示所述引入具有導致谷粒大小增加，并促進運輸，并因此增加顆粒大小的新功能。
文檔編號C12N15/09GK102112610SQ20098012953
公開日2011年6月29日 申請日期2009年5月29日 優(yōu)先權日2008年5月29日
發(fā)明者井澤毅, 杉田左江子 申請人:獨立行政法人農業(yè)生物資源研究所