專利名稱：對dna進行定量或檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對具有目標DNA區(qū)域的DNA進行定量或檢測的方法等。
背景技術(shù)：
作為對標本中所含的具有目標DNA區(qū)域的DNA進行定量或檢測的方法，已知有例 如在從標本提取了 DNA之后，通過DNA聚合酶所致的DNA合成的鏈反應(Polymerase Chain Reaction (聚合酶鏈式反應)；以下也會記為PCR。)來使具有目標DNA區(qū)域的DNA擴增而進 行檢測的方法；使標本中的DNA所具有的目標DNA區(qū)域經(jīng)熒光標記后的寡核苷酸雜交而進 行檢測的方法等(例如參照 J. Cataract. Refract. Surg.，2007 ；33 (4) :635-641, Environ. Mol. Mutagen.，1991 ； 18 (4) :259-262)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種對具有目標DNA區(qū)域的DNA進行簡單定量或檢測的 方法。S卩，本發(fā)明提供下述發(fā)明等。[發(fā)明1]一種對標本中所含的具有目標DNA區(qū)域的DNA進行定量或檢測的方法，其特征在 于，具備(1)從標本制備要檢測目標DNA區(qū)域的DNA的第一工序；(2)用DNA甲基化酶對由第一工序制備的DNA進行處理的第二工序；(3)從經(jīng)第二工序處理后的DNA制備單鏈甲基化DNA的第三工序；(4)第四工序，其中，使由第三工序制備的單鏈甲基化DNA、甲基化DNA抗體、具有 如下堿基序列的特定寡核苷酸混合，形成具有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA、 該甲基化DNA抗體與該特定寡核苷酸的復合體，所述堿基序列不抑制單鏈甲基化DNA中的 目標DNA區(qū)域的被甲基化后的一個以上的堿基與該甲基化DNA抗體的結(jié)合，且可以通過互 補性與具有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA結(jié)合；及(5)第五工序，對由第四工序形成的復合體中所含的上述甲基化DNA抗體，利用其 識別功能進行定量或檢測，由此，對上述單鏈甲基化DNA中具有目標DNA區(qū)域的DNA進行定 量或檢測。[發(fā)明2]就發(fā)明1記載的方法而言，第四工序中，在含有二價陽離子的反應體系中使復合 體形成。[發(fā)明3]就發(fā)明2記載的方法而言，二價陽離子是鎂離子。[發(fā)明4]就發(fā)明1 3中任一項發(fā)明記載的方法而言，在第五工序開始之前，使第四工序形成的復合體中所含的抗體和支持體結(jié)合。[發(fā)明5]就發(fā)明1 3中任一項發(fā)明記載的方法而言，在第五工序開始之前，使第四工序形 成的復合體中所含的特定寡核苷酸和支持體結(jié)合。[發(fā)明6]就發(fā)明1 5中任一項發(fā)明記載的方法而言，DNA甲基化酶是胞嘧啶甲基化酶。[發(fā)明7]就發(fā)明1 6中任一項發(fā)明記載的方法而言，DNA甲基化酶是ksl甲基化酶。[發(fā)明8]就發(fā)明1 7中任一項發(fā)明記載的方法而言，甲基化DNA抗體是甲基胞嘧啶抗體。[發(fā)明9]就發(fā)明1 8中任一項發(fā)明記載的方法而言，標本是下述任一種標本(a)哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細胞溶解液或組織溶解液；(b)從選自哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細胞溶解液及組織溶解液 中的一種中提取的DNA ；(c)以從選自哺乳動物來源的組織、細胞、組織溶解液及細胞溶解液中的一種中提 取的RNA為模板而制作的DNA ；(e)從細菌、真菌或病毒中提取的DNA ；或(f)以從細菌、真菌或病毒中提取的RNA為模板而制作的DNA。[發(fā)明10]就發(fā)明1 9中任一項發(fā)明記載的方法而言，要檢測目標DNA區(qū)域的DNA是下述 的任一種DNA (a)預先用不以目標DNA區(qū)域為識別剪切位點的限制酶進行了消化處理的DNA、(b)預先精制后的DNA、(c)血液中的游離DNA、(d)微生物基因組來源的DNA、或(e)通過逆轉(zhuǎn)錄酶由RNA生成的DNA。[發(fā)明11]就發(fā)明1 10中任一項發(fā)明記載的方法而言，在第四工序中的復合體形成時，添 加反向寡核苷酸。[發(fā)明12]就發(fā)明1 11中任一項發(fā)明記載的方法而言，在第一工序中，在用于從標本制備 DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的鈉鹽的濃度為IOOmM以上IOOOmM以下。[發(fā)明13]就發(fā)明1 11中任一項發(fā)明記載的方法而言，在第一工序中，用于從標本制備DNA 的DNA提取操作中所使用的溶液中的鈉鹽的濃度為IOOmM以上200mM以下。[發(fā)明14]一種選出癌癥患者來源的標本的方法，其中，包括如下工序利用發(fā)明1 13中任一項發(fā)明記載的方法使用被檢者來源的標本而定量或檢測的DNA的定量結(jié)果或檢測結(jié)果、與利用相同方法使用健康者來源的標本而定量或檢測的 DNA的定量結(jié)果或檢測結(jié)果之間的差異如有顯著性意義，則將被檢者來源的標本作為癌癥 患者來源的標本進行評價，根據(jù)該評價的結(jié)果來鑒定癌癥患者來源的標本。[發(fā)明15]就發(fā)明14記載的方法而言，標本是哺乳動物來源的血清。[發(fā)明16]就發(fā)明14或15記載的方法而言，具有目標DNA區(qū)域的DNA是哺乳動物來源的血 清中的具有目標DNA區(qū)域的游離DNA。


圖1是表示實施例1中使用甲基胞嘧啶抗體0.5yg/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸Bl實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖2是表示實施例2中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B2實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖3是表示實施例3中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸Bl實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340歷/熒光61211111對溶液嫩(10叫 each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖4是表示實施例3中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸B2實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖5是表示實施例3中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL和5’末端生物素標記寡 核苷酸Bl及5’末端生物素標記寡核苷酸B2實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā) ；34011111/熒光61211111對溶液獻(101^ each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MD (Ong each/20 μ L TE 緩 沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖6是表示實施例4中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸Bl實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340歷/熒光61211111對溶液4(10001^ each/30 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 B (500ng each/30 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (200ng each/30 μ L TE緩沖溶液)、溶液D (Ong each/30 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測
定DNA量得到的值。圖7是表示實施例5中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡核苷酸B3實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340歷/熒光61211111對溶液4(10001^ each/30 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 B (500ng each/30 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (200ng each/30 μ L TE緩沖溶液)、溶液D (Ong each/30 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測
定DNA量得到的值。圖8是表示實施例6中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B3實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(500ng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 B (50ng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (5ng each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液D (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖9是表示實施例7中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B4實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖10是表示實施例8中使用甲基胞嘧啶抗體0.5yg/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖11是表示實施例9中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸B4實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖12是表示實施例9中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖13是表示實施例9中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL和5’末端生物素標記寡 核苷酸B4及5’末端生物素標記寡核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā) ；34011111/熒光61211111對溶液獻(101^ each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MD (Ong each/20 μ L TE 緩 沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖14是表示實施例10中使用甲基胞嘧啶抗體0.5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B4實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 AdOOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 B (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (lng each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液D (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測
定DNA量得到的值。圖15是表示實施例11中使用甲基胞嘧啶抗體0.5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液AdOOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 B (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (lng each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液D (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測
定DNA量得到的值。圖16是表示實施例12中使用甲基胞嘧啶抗體0.5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B4實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖17是表示實施例13中使用甲基胞嘧啶抗體0.5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖18是表示實施例14中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸B4實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖19是表示實施例14中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖20是表示實施例14中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL和5’末端生物素標記 寡核苷酸B4及5’末端生物素標記寡核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激 發(fā);MOnm/熒光 612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MD (Ong each/20 μ L TE 緩 沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖21是表示實施例15中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B4實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖22是表示實施例16中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖23是表示實施例17中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標 記寡核苷酸B4實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖M是表示實施例18中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液 A(10ng/20yL TE 緩沖溶液)、溶液 B (lng/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 C (0. lng/20 μ L TE 緩 沖溶液)、溶液D (0ng/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖25是表示實施例19中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸B4實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖沈是表示實施例19中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL及5’末端生物素標記寡 核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激發(fā)340nm/熒光612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE緩沖溶液)、溶液MD (Ong each/20 μ L TE緩沖溶液(陰性對照液))分別測 定DNA量得到的值。圖27是表示實施例19中使用甲基胞嘧啶抗體0. 5 μ g/mL和5’末端生物素標記 寡核苷酸B4及5’末端生物素標記寡核苷酸B5實施的結(jié)果的圖。從右側(cè)起依次示出用激 發(fā);MOnm/熒光 612nm對溶液MA (IOng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液MB (lng each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MC (0. Ing each/20 μ L TE 緩沖溶液)、溶液 MD (Ong each/20 μ L TE 緩 沖溶液(陰性對照液))分別測定DNA量得到的值。圖28是表示實施例20中通過處理1實施對目標DNA區(qū)域W進行檢測的實驗的結(jié) 果的圖。圖中，溶液A表示對使用生物素標記寡核苷酸Β6向血清樣品A實施了包括處理1 的操作后的樣品的熒光強度進行測定得到的值。溶液B表示對使用生物素標記寡核苷酸Β6 向血清樣品B實施了包括處理1的操作后的樣品的熒光強度進行測定得到的值。溶液C表 示對使用生物素標記寡核苷酸Β6向血清樣品C(陰性對照液)實施了包括處理1的操作后 的樣品的熒光強度進行測定得到的值。圖四是表示實施例20中通過處理2實施對目標DNA區(qū)域W進行檢測的實驗的結(jié) 果的圖。圖中，溶液A表示對使用生物素標記寡核苷酸B6向血清樣品A實施了包括處理2 的操作后的樣品的熒光強度進行測定得到的值。溶液B表示對使用生物素標記寡核苷酸B6 向血清樣品B實施了包括處理2的操作后的樣品的熒光強度進行測定得到的值。溶液C表 示對使用生物素標記寡核苷酸B6向血清樣品C (陰性對照液)實施了包括處理2的操作后 的樣品的熒光強度進行測定得到的值。圖30是表示實施例21中實施對目標DNA區(qū)域W進行檢測的實驗的結(jié)果的圖。圖 中，溶液A表示對使用生物素標記寡核苷酸B6向血清樣品A實施了包括處理1的操作后的 樣品的熒光強度進行測定得到的值。溶液B表示對使用生物素標記寡核苷酸B6向血清樣 品B實施了包括處理1的操作后的樣品的熒光強度進行測定得到的值。溶液C表示對使用 生物素標記寡核苷酸B6向血清樣品C(陰性對照液)實施了包括處理1的操作后的樣品的 熒光強度進行測定得到的值。圖31是表示實施例21中實施對目標DNA區(qū)域W進行檢測的實驗的結(jié)果的圖。圖 中，溶液A表示對使用生物素標記寡核苷酸B6向血清樣品A實施了包括處理2的操作后的 樣品的熒光強度進行測定得到的值。溶液B表示對使用生物素標記寡核苷酸B6向血清樣品B實施了包括處理2的操作后的樣品的熒光強度進行測定得到的值。溶液C表示對使用 生物素標記寡核苷酸B6向血清樣品C(陰性對照液)實施了包括處理2的操作后的樣品的 熒光強度進行測定得到的值。圖32是表示實施例22中實施對人血清中所含的目標DNA區(qū)域W進行檢測的實驗 的結(jié)果的圖。圖中，示出對使用甲基胞嘧啶抗體及5’末端生物素標記寡核苷酸B6進行檢 測的結(jié)果、和通過實時PCR進行定量的結(jié)果進行比較得到的圖。以檢測結(jié)果為縱軸，以通過 實時PCR的定量結(jié)果為橫軸繪圖。另外，曲線圖中的直線表示回歸直線(粗線)及標準誤 差范圍(細線)。圖33是表示實施例22中實施對人血清中所含的目標DNA區(qū)域W進行檢測的實驗 的結(jié)果的圖。對于59歲以下的人血清樣品，將使用甲基胞嘧啶抗體及5’末端生物素標記 寡核苷酸B6對DNA進行檢測得到的結(jié)果分成癌癥患者和健康者進行繪圖，對他們分別示出 平均值及標準偏差。
具體實施例方式作為本發(fā)明方法的“標本”，(a)哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細胞 溶解液或組織溶解液；(b)從選自哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細胞溶解液 及組織溶解液的之一中提取的DNA; (c)以從選自哺乳動物來源的組織、細胞、組織溶解液 及細胞溶解液的之一中提取的RNA為模板而制作的DNA ； (e)從細菌、真菌或病毒中提取的 DNA;或(f)以從細菌、真菌或病毒中提取的RNA為模板而制作的DNA;等。上述組織是指包 括血液、淋巴結(jié)等的廣義含義。“哺乳動物”是指分類成動物界脊索動物門脊椎動物亞門哺乳綱(Mammalia)的動 物，具體而言，可以舉出人、猴、狨、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、綿羊、狗、貓等。“體液”是指在構(gòu)成個體的細胞間存在的液體，具體可以舉出血漿和間質(zhì)液，在大 多數(shù)情況下，發(fā)揮個體的穩(wěn)態(tài)的維持功能。更具體而言，可以舉出淋巴液、組織液(組織間 液、細胞間液、間質(zhì)液)、體腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心包液、腦脊液(脊髓液)、關(guān)節(jié)液 (滑液)、眼房水(房水)、腦脊液等?！绑w分泌物”是指來外分泌腺的分泌液，具體而言，可以舉出唾液、胃液、膽汁、胰 液、腸液、汗、眼淚、鼻涕、精液、陰道分泌液、羊水、乳汁等。在標本是人的血液、體液或體分泌物等的情況下，可以利用在人的定期健康診斷 中用于臨床檢查收集的試樣。作為“細胞溶解液”，可以舉出將用細胞培養(yǎng)用板等培養(yǎng)的細胞例如細胞株、原代 培養(yǎng)細胞、或血細胞等粉碎而得到的含有細胞內(nèi)液的溶解液。作為粉碎細胞的方法，可以舉 出利用超聲波的方法、使用表面活性劑的方法、使用堿溶液的方法等。為了溶解細胞，可以 利用市售的試劑盒等。例如，在用IOcm板培養(yǎng)細胞直至它們?nèi)诤现螅釛壟囵B(yǎng)液，將0. 6mL的RIPA緩 沖液(lx TBS，1%諾乃洗滌劑(nonidet)P-40，0. 5%脫氧膽酸鈉(sodium deoxysholate), 0. 1% SDS,0. 004%疊氮化鈉(sodium azide)添加到該板中。在4°C下緩慢搖動15分鐘板， 然后使用刮器等剝離該板上的粘附細胞，將該板上的液體移至微管。添加該液體的1/10容 量的lOmg/mL PMSF，然后將該管在冰上放置30 60分鐘之后，在4°C下以IOOOOxg離心10分鐘，獲得上清作為細胞溶解液。作為“組織溶解液”，可以舉出通過破壞從哺乳動物等動物收集的組織中的細胞損 壞而獲得的含有細胞內(nèi)液的溶解液。具體而言，在對從動物獲得的組織的重量進行了測定之后，使用剃刀等將該組織 裁成小片。在使用凍結(jié)組織的情況下，需要裁成更小的小片。在裁斷后，以每Ig組織3mL 的比率添加冰冷RIPA緩沖液，在4°C下進行均漿。在這里，可以向RIPA緩沖液中添加蛋白 酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等，例如可以添加RIPA緩沖液的1/10容量的lOmg/mL PMSF0均漿 使用超聲波發(fā)生器、加壓型細胞粉碎裝置。在均漿的作業(yè)中，始終將均漿液維持在4°C，抑制 發(fā)熱。將均漿液移至微管，在4°C下以IOOOOxg離心10分鐘，獲得上清作為組織溶解液。作為本發(fā)明方法中的“標本”，例如還可以舉出從食品、河川、土壤、或一般市售制 品收集的試樣、表面附著物等，可以包括真菌、細菌、病毒等微生物或它們的核酸。作為用作標本的DNA，可以舉出從上述生物體試樣、上述微生物提獲得到的基因組 DNA、基因組DNA來源的DNA片段、或RNA等。為了從哺乳動物來源的試樣得到基因組DNA，可 以使用例如市售的DNA提取用試劑盒等。另外，為了從RNA得到DNA，可以使用市售的cDNA 制作試劑盒等的逆轉(zhuǎn)錄酶。另外，作為標本，還可以是人工合成的DNA。本發(fā)明方法中的“目標DNA區(qū)域”(以下也記為目標區(qū)域。)是指，標本中所含的 DNA當中用于利用本發(fā)明方法進行檢測或定量的DNA區(qū)域。關(guān)于目標DNA區(qū)域，在標本為 DNA的情況下，用DNA上的堿基序列表示。在標本為RNA的情況下，目標DNA區(qū)域通過利用 逆轉(zhuǎn)錄酶由RNA制成的DNA上的堿基序列來表示，是與RNA上的成為檢測對象的規(guī)定堿基 序列互補的堿基序列。在本發(fā)明方法中，在將胞嘧啶甲基化后進行檢測或定量的情況下，目 標區(qū)域優(yōu)選包括富含胞嘧啶或后述的CpG的區(qū)域。第一工序是從標本中制備用于檢測目標DNA區(qū)域的DNA的工序。作為在第一工序中制備的DNA，例如可以舉出用不將該DNA所具有的目標DNA區(qū)域 作為識別剪切位點的限制酶預先進行消化處理的DNA試樣、預先精制的DNA試樣、血液中的 游離DNA、微生物基因組來源的DNA、及通過逆轉(zhuǎn)錄酶由標本中的RNA制成的DNA等。作為在 第一工序中制備的DNA，例如也可以舉出根據(jù)標本的基因信息進行設(shè)計而人工合成的DNA。在將血液用作標本的情況下，基于通常的方法由血液制備血漿或血清，以所制備 的血漿或血清為標本，對其中所含的游離DNA(含有胃癌細胞等癌細胞來源的DNA)進行分 析時，可以避開血細胞來源的DNA而對胃癌細胞等癌細胞來源的DNA進行解析，可以使檢測 胃癌細胞等癌細胞、含有其的組織等的靈敏度提高。作為在第一工序中制備的DNA，可以舉出革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等細菌、真 菌、病毒、病原性原生動物等微生物等來源的DNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶由該微生物等來源的RNA 獲得的DNA。例如利用逆轉(zhuǎn)錄酶由生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)、肺炎支原體 (Mycoplasma pneumoniae)、布氏疏螺方寵體(Borrelia burgdorferi)B31、普氏立克次氏體 (Rickettsia prowazekii)、蒼白密螺方寵體(Treponema pallidum)、月市炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、沙目艮衣原體(Chlamydia trachomatis)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) J99、幽門螺桿菌沈695、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) RcU結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)H37Rv> 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、侵 月市軍團菌(Legionella pneumophila)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、 腸沙門氏菌(Salmonella enterica)、空腸彎曲桿菌空腸亞種(Campylobacter jejuni subsp. Jejuni)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、畐Ij 溶血弧菌(Vibrio parahaemo 1 yticus)、M # 芽 3 桿菌(Bacillusu cereus)、肉毒 菌(Clostridium botulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 (Yersinia enterocolitica)、假結(jié)核耳口爾森氏菌(Yersinia pseudotuberuculosis)、紅色 毛癬菌(Trichophyton ruburum)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、白色念珠 菌(Candida albicans)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、卡市月市包子蟲(Pneumocystis carinii)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)、人皰疫病毒(human herpesvirus) 5、埃巴病毒 (Epstein-Barr virus)、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)、人乳頭瘤病 毒(Human Papilloma Virus)、腸道病毒(Enterovirus)、諾如病毒(Norovirus)、流感病毒 (Influenza Virus)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、小球隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)的基因組DNA或RNA制成的DNA，可以 用于檢測標本中的感染癥病原菌、或食品中的食物中毒病原菌等。為了制備基因組DNA，例如在標本是哺乳動物來源的試樣的情況下，可以使用市 售的DNA提取用試劑盒(Genfind v2 Kit (貝克曼庫爾特(BECKMAN COULTER)公司制)、 FastPure DNA Kit (寶生物株式會社制))等。在標本是真菌等微生物的情況下，可以利用在Methods in Yeast Genetics (酵母 遺傳實驗方法)(冷泉港實驗室出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press)中記載 的通常的酵母基因組的制備法等來制備基因組DNA，在標本是大腸桿菌之類的原核生物的 情況下，可以使用Molecular Cloning(分子克隆)-A Laboratory Manual-(實驗室手冊) (冷泉港實驗室出版社)中記載的通常的微生物基因組制備法等。另外，在標本是食品試樣的情況下，可以在從食品分離微生物等后制備DNA，可以 同時獲得食品中所含的微生物以外的基因組DNA和微生物來源的基因組。另外，在標本是 哺乳動物來源的組織且目標DNA區(qū)域是病毒來源的DNA的情況下，可以使用市售的RNA提 取用試劑盒(IS0GEN(311-02501)(日本基因公司制)、或!^astRNA Pro Green Kit (船越公 司制 Ki^astRNA Pro Blue Kit (船越公司制)、!^astRNA Pro Red Kit (船越公司制)、等) 等從組織中提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶獲得DNA。另外，在標本是哺乳動物來源的標本的情況 下，可以在提取病毒粒子后提取病毒的DNA，或可以在提取病毒粒子后使用市售的試劑盒 (QuickGene RNA tissue kit S II、富士膠片公司制)等提取病毒RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶獲得 病毒來源的DNA?？梢詮母腥玖瞬《镜慕M織提取RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶獲得病毒來源的DNA， 還可以從感染了病毒的組織獲得DNA，以獲得病毒來源的DNA。需要說明的是，在利用逆轉(zhuǎn) 錄酶從RNA獲得DNA的情況下，可以使用市售的試劑盒(轉(zhuǎn)錄物高精度cDNA合成試劑盒 (Transcripter high fidelity cDNA synthesis kit)、羅氏診斷公司制)等。就“甲基化DNA”而言，構(gòu)成基因(基因組DNA)的4種堿基的任意堿基被甲基化。 例如，在哺乳動物中，已知有用5’ -CG-3’表示的堿基序列(C表示胞嘧啶，G表示鳥嘌呤。 以下也將該堿基序列記為“CpG”。)中僅是胞嘧啶被甲基化的現(xiàn)象。胞嘧啶的甲基化部位 是其5位。在細胞分裂之前的DNA復制時，就新生雙鏈DNA而言，是母細胞來源的模板鏈中的“CpG”中僅僅胞嘧啶被甲基化的狀態(tài)，通過甲基轉(zhuǎn)移酶的作用而迅速將新生的DNA鏈中 的“CpG”中的胞嘧啶也被甲基化。該胞嘧啶甲基化將與母細胞來源的DNA鏈中的包括甲基 化了的胞嘧啶的CpG相互補結(jié)合的新生DNA鏈的CpG中的胞嘧啶甲基化。因此，母細胞的 DNA的甲基化狀態(tài)在DNA復制后也被直接傳給新的2組DNA?！癈pG對”是指由CpG表示的 堿基序列和與其互補的CpG結(jié)合而成的雙鏈DNA。“單鏈甲基化DNA”是指單鏈DNA的堿基序列中用5’ -CG-3’來表示的堿基序列中 的胞嘧啶的5位被甲基化的單鏈DNA。作為“目標DNA區(qū)域”，例如可以舉出含有在賴氨酰氧化酶、HRAS樣阻抑因子、 bA305P22. 2. 1、γ -細絲蛋白、HANDl、RIKEN 2210016F16 的同系物、FLJ32130、PPARG 血管 生成素相關(guān)蛋白、凝血調(diào)節(jié)蛋白、Ρ53-應答基因2、微纖維蛋白2、神經(jīng)絲蛋白3、解聚素及金 屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域23、G-蛋白偶聯(lián)受體7、G-蛋白偶聯(lián)生長抑素及血管緊張素樣肽受體、溶質(zhì) 載體蛋白家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白去甲腎上腺素成員2等有用蛋白質(zhì)基因的啟動子區(qū)域、 非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)等，優(yōu)選可以舉出在這些堿基序列中存在的含有一個 以上CpG的DNA區(qū)域。在本發(fā)明方法中，可以對“目標DNA區(qū)域”的甲基化后的DNA分別進 行檢測或定量，例如在1個檢測體系中，檢測出更多的“目標DNA區(qū)域”的甲基化后的DNA， 則相應地提高定量精度及檢測靈敏度。具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因是賴氨酰氧化酶基因的情況下，作為在其啟動 子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG的堿 基序列，可以舉出含有人來源的賴氨酰氧化酶基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū) 域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出用序列編號1表示的堿基序列(相當于 基因庫檢索號No. AF270645記載的堿基序列的堿基編號16001 18661所示的堿基序列)。 就序列編號1所示的堿基序列而言，對人來源的賴氨酰氧化酶蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸 進行編碼的ATG密碼子用堿基編號2031 2033表示，上述外顯子1的堿基序列用堿基編 號1957 洸61表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為HRAS樣阻抑因子基因的情況下，作為 在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上 CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的HRAS樣阻抑因子基因的外顯子1和位于其5’上游 的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出用序列編號2表示的堿基序 列(相當于基因庫檢索號No. AC068162記載的堿基序列的堿基編號172001 173953表示 的堿基序列。)。就序列編號2表示的堿基序列而言，人來源的HRAS樣阻抑因子基因的外 顯子1的堿基序列用堿基編號1743 1953表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為bA305P22. 2. 1基因的情況下，作為在 其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的bA305P22. 2. 1基因的外顯子1和位于其5’上游的啟 動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號3表示的堿基序列(相 當于基因庫檢索號No. AL121673記載的堿基序列的堿基編號13001 13889表示的堿基序 列。)。就序列編號3表示的堿基序列而言，對人來源的bA305P22. 2.1蛋白質(zhì)的氨基末端 的蛋氨酸進行編碼的ATG密碼子用堿基編號849 851表示，上述外顯子1的堿基序列用 堿基編號663 889表示。
另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為Y-細絲蛋白基因的情況下，作為在其 啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的Y-細絲蛋白基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動 子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號4表示的堿基序列(相當 于基因庫檢索號No. AC074373記載的堿基序列的堿基編號635 64390表示的堿基序列 的互補序列)。就序列編號4表示的堿基序列而言，對人來源的Y-細絲蛋白質(zhì)的氨基末端 的蛋氨酸進行編碼的ATG密碼子用堿基編號572 574表示，上述外顯子1的堿基序列用 堿基編號463 863表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為HANDl基因的情況下，作為在其啟動子 區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG的堿基 序列，可以舉出含有人來源的HANDl基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因 組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號5表示的堿基序列(相當于基因庫檢 索號No. AC026688記載的堿基序列的堿基編號24303 26500表示的堿基序列的互補序 列)。就序列編號5表示的堿基序列而言，對人來源的HANDl蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸進 行編碼的ATG密碼子用堿基編號1656 1658表示，上述外顯子1的堿基序列用堿基編號 1400 2198表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為RIKEN 2210016F16基因的同系物的情 況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有 一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的RIKEN 2210016F16基因的同系物的外 顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序 列編號6表示的堿基序列(相當于基因庫檢索號No. AL354733記載的堿基序列的堿基編號 157056 159000表示的堿基序列的互補堿基序列。)。就序列編號6表示的堿基序列而 言，人來源的RIKEN 2210016F16基因的同系物的外顯子1的堿基序列用堿基編號1392 1945表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為FLJ32130基因的情況下，作為在其啟 動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG的 堿基序列，可以舉出含有人來源的FLJ32130基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū) 域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號7表示的堿基序列(相當于基 因庫檢索號No. AC002310記載的堿基序列的堿基編號1 2379表示的堿基序列的互補堿 基序列)。就序列編號7表示的堿基序列而言，對人來源的FLJ32130蛋白質(zhì)的氨基酸末端 的蛋氨酸進行編碼的ATG密碼子用堿基編號2136 2138表示，認為是上述外顯子1的堿 基序列用堿基編號2136 2379表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為PPARG血管生成素相關(guān)蛋白基因的情 況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有 一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的PPARG血管生成素相關(guān)蛋白基因的外顯 子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列 編號8表示的堿基序列。就序列編號8表示的堿基序列而言，對人來源的PPARG血管生成 素相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸進行編碼的ATG密碼子用堿基編號717 719表示，上 述外顯子1的5’側(cè)部分的堿基序列用堿基編號1957 沈61表示。
另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為凝血調(diào)節(jié)蛋白基因的情況下，作為在其 啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的凝血調(diào)節(jié)蛋白基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動 子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號9表示的堿基序列(相 當于基因庫檢索號No. AF495471記載的堿基序列的堿基編號1 6096表示的堿基序列)。 就序列編號9表示的堿基序列而言，對人來源的凝血調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氨基末端的蛋氨酸進行 編碼的ATG密碼子用堿基編號2590 2592表示，上述外顯子1的堿基序列用堿基編號 2048 6096表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為p53-應答基因2基因的情況下，作為在 其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的P53-應答基因2基因的外顯子1和位于其5’上游的 啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號10表示的堿基序列 (相當于基因庫檢索號No. AC009471記載的堿基序列的堿基編號113501 116000表示的 堿基序列的互補序列。)。就序列編號10表示的堿基序列而言，人來源的p53-應答基因2 基因的外顯子1的堿基序列用堿基編號1558 1808表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為微纖維蛋白2基因的情況下，作為在其 啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的微纖維蛋白2基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動 子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號11表示的堿基序列(相 當于基因庫檢索號No. ACl 13387記載的堿基序列的堿基編號118801 121000表示的堿基 序列的互補序列)。就序列編號11表示的堿基序列而言，人來源的微纖維蛋白2基因的外 顯子1的堿基序列用堿基編號1091 1345表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為神經(jīng)絲蛋白3基因的情況下，作為在其 啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG 的堿基序列，可以舉出含有人來源的神經(jīng)絲蛋白3基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動 子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號12表示的堿基序列(相 當于基因庫檢索號No. AF106564記載的堿基序列的堿基編號28001 30000表示的堿基序 列的互補序列)。就序列編號12表示的堿基序列而言，人來源的神經(jīng)絲蛋白3基因的外顯 子1的堿基序列用堿基編號614 1694表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為解聚素及金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域23基因的 情況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含 有一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的解聚素及金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域23基因的 外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出 序列編號13表示的堿基序列(相當于基因庫檢索號No. AC009225記載的堿基序列的堿基 編號21001 23300表示的堿基序列)。就序列編號13表示的堿基序列而言，人來源的解 聚素及金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域23基因的外顯子1的堿基序列，用堿基編號1194 1630表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為G蛋白偶聯(lián)受體7基因的情況下，作為 在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序列中存在的含有一個以上 CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的G蛋白偶聯(lián)受體7基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號14表示的堿基 序列(相當于基因庫檢索號No. AC009800記載的堿基序列的堿基編號75001 78000表示 的堿基序列)。就序列編號14表示的堿基序列而言，人來源的G蛋白偶聯(lián)受體7基因的外 顯子1的堿基序列用堿基編號1666 沈52表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為G-蛋白偶聯(lián)生長抑素及血管緊張素樣 肽受體基因的情況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū)域)的堿基序 列中存在的含有一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的G-蛋白偶聯(lián)生長抑素及 血管緊張素樣肽受體基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子區(qū)域的基因組DNA的堿基序 列，更具體而言，可以舉出序列編號15表示的堿基序列(相當于基因庫檢索號NO.AC008971 記載的堿基序列的堿基編號57001 60000表示的堿基序列的互補序列)。就序列編號15 表示的堿基序列而言，人來源的G-蛋白偶聯(lián)生長抑素及血管緊張素樣肽受體基因的外顯 子1的堿基序列，用堿基編號776 沈32表示。另外，具體而言，例如在有用蛋白質(zhì)基因為溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白去 甲腎上腺素成員2基因的情況下，作為在其啟動子區(qū)域、非翻譯區(qū)域或翻譯區(qū)域(編碼區(qū) 域)的堿基序列中存在的含有一個以上CpG的堿基序列，可以舉出含有人來源的溶質(zhì)載體 家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白去甲腎上腺素成員2基因的外顯子1和位于其5’上游的啟動子 區(qū)域的基因組DNA的堿基序列，更具體而言，可以舉出序列編號16表示的堿基序列(相當 于基因庫檢索號No. AC026802記載的堿基序列的堿基編號78801 81000表示的堿基序列 的互補序列。)。就序列編號16表示的堿基序列而言，人來源的溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì) 轉(zhuǎn)運蛋白去甲腎上腺素成員2基因的外顯子1的堿基序列，用堿基編號1479 1804表示。第二工序是用DNA甲基化酶對在第一工序中制備的DNA進行處理的工序。"DNA甲基化酶”是指將DNA中的堿基甲基化的酶，是從哺乳動物細胞、細菌等分離 多種DNA甲基化酶。DNA甲基化酶根據(jù)底物的堿基的種類被分類成腺嘌呤甲基化酶、胞嘧啶 甲基化酶等多種。胞嘧啶甲基化酶，是識別DNA堿基序列中的特定序列并將該序列附近的 胞嘧啶甲基化的酶，已知有因所識別的堿基序列而不同的胞嘧啶甲基化酶。就由DNA甲基化酶催化的DNA的甲基化反應而言，在稱為限制修飾體系的原始免 疫體系中多見。限制修飾體系是指通過細菌中發(fā)揮功能的基因組全體定期甲基化而不會被 識別特定序列的限制酶(限制內(nèi)切酶)消化，進而利用通過限制酶消化外來DNA(特別優(yōu)選 噬菌體)的功能，防御微生物基因組免受噬菌體感染的系統(tǒng)。在基因組的甲基化中發(fā)揮功 能的酶，已知將胞嘧啶或腺嘌呤甲基化，大多數(shù)情況下是將嘌呤殘基的6位的氮(N6)、或5 位的碳(C5)甲基化。作為這樣的酶當中將胞嘧啶的C5甲基化的胞嘧啶甲基化酶，已知有 SssKM. SssI)甲基化酶、AluI甲基化酶、HhaI甲基化酶、HpaII甲基化酶、MspI甲基化酶、 HaeIII甲基化酶等。另外，這些將胞嘧啶的C5位甲基化的酶，所識別的堿基序列不同，對 CpG進行識別的胞嘧啶甲基化酶僅為ksl。作為人基因組中的DNA的甲基化反應，作為外遺傳(產(chǎn)生不依賴于基因序列的基 因表達的多樣性的機制)，已知CpG的胞嘧啶的5位(C5)的甲基化，作為這樣的胞嘧啶甲基 化酶，已知有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，已知有DnmtI甲基轉(zhuǎn)移酶。在人細胞中，由于CpG序列的胞嘧啶的C5位被甲基化，所以在人為的將基因組甲 基化的情況下，通過使用SssI，可以將與人細胞內(nèi)的甲基化相同序列(CpG)的、相同胞嘧啶的、相同位置甲基化。為了通過胞嘧啶甲基化酶將DNA甲基化，具體而言，例如向DNA試樣中分別添加 最適的IOX緩沖液(NEBuffer2 (NEB公司制))5 μ L、S-腺苷甲硫氨酸(3. 2mM, NEB公司 制)0. 5 μ L、胞嘧啶甲基化酶ksI(NEB公司制)0. 5 μ L，接著，向該混合物中加入滅菌超純 水，使液量為50 μ L，在37°C下孵育30分鐘。第三工序是從在第二工序中用DNA甲基化酶處理后的DNA制備單鏈甲基化DNA制 備的工序。例如，在甲基化后的DNA為雙鏈DNA的情況下，將雙鏈DNA分離成單鏈DNA。具體 而言，用iTris-HCl緩沖液(IOmM)將在第二工序中通過DNA甲基化酶甲基化后的DNA制成 Ing/μ L 的溶液，再混合緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2, 5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，向該混合液中 添加滅菌超純水，使液量為100 μ L。隨后，在95°C下加熱10分鐘，隨后數(shù)分鐘在冰冷水上 驟冷。例如，在由標本制備的DNA是血液等中所含的游離DNA的情況下，在第二工序中被甲 基化的DNA有可能是單鏈DNA。由于這樣的單鏈DNA會形成高次結(jié)構(gòu)，因此優(yōu)選進行與雙鏈 DNA的情況一樣的處理。就第四工序而言，使在第三工序中制備的單鏈甲基化DNA、甲基化DNA抗體、具有 如下堿基序列的特定寡核苷酸混合，而形成具有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化 DNA、該甲基化DNA抗體、與該特定寡核苷酸的復合體，所述堿基序列不會抑制單鏈甲基化 DNA中的目標DNA區(qū)域的被甲基化后的一個以上的堿基和該甲基化DNA抗體的結(jié)合，且可以 通過互補性與該單鏈DNA結(jié)合。“甲基化DNA抗體”是指以DNA中甲基化后的堿基為抗原而結(jié)合的抗體。具體可 以舉出甲基胞嘧啶抗體，可以舉出具有識別單鏈DNA中的5位被甲基化后的胞嘧啶并結(jié)合 的性質(zhì)的抗體。只要是可以特異性識別本說明書中記載的甲基化狀態(tài)的DNA并特異性結(jié)合 的抗體，也可以利用市售的甲基化DNA抗體。甲基化DNA抗體可以將甲基化后的堿基、甲基 化DNA等作為抗原并利用普通的方法作成。具體而言，為了作成甲基胞嘧啶抗體，通過從以 5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等為抗原而制作的抗體中，以對 DNA中的甲基胞嘧啶的特異結(jié)合為指標而選出。如果考慮甲基化DNA抗體的性質(zhì)，即考慮在 1個甲基化后的堿基(胞嘧啶)上結(jié)合1個抗體，作為目標DNA區(qū)域，選出多數(shù)甲基化后的 堿基(胞嘧啶)即CpG存在的區(qū)域，由此可以期待定量精度及檢測靈敏度的提高。作為使動物接觸抗原而得到的抗體，有作為對動物施以抗原免疫而得到、IgG部分 的抗體(多克隆抗體)的方法、生產(chǎn)單克隆的抗體(單克隆抗體)等。本發(fā)明中優(yōu)選能夠 特異性識別甲基化DNA、或甲基胞嘧啶的抗體，所以優(yōu)選利用單克隆抗體。作為制作單克隆抗體的方法，可以舉出利用細胞融合法的方法。例如，細胞融合法 通過使免疫后的小鼠來源的脾細胞(B細胞)和骨髓瘤細胞發(fā)生細胞融合而制作雜交瘤，選 出雜交瘤生產(chǎn)的抗體，制作甲基胞嘧啶抗體(單克隆抗體)。在利用細胞融合法制作單克 隆抗體的情況下，沒有必要精制抗原，例如將5-甲基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基 胞嘧啶的DNA等的混合物作為抗原，可以給用于免疫的動物使用。作為給藥方法，將5-甲 基胞苷、5-甲基胞嘧啶、或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等直接對產(chǎn)生抗體的小鼠使用。在難 以產(chǎn)生抗體的情況下，可以使抗原與支持體結(jié)合進行免疫。另外，通過將佐劑溶液(例如混合液體石蠟和Aracel A并混合結(jié)核菌的死菌作為佐劑得到的溶液)和抗原充分混合而使 用，或?qū)⒖乖瓝饺胫|(zhì)體使其免疫，由此可以提高抗原的免疫性?；蛘?，有等量添加含有抗 原的溶液和佐劑溶液，充分成為乳液狀之后，向小鼠的皮下或腹腔內(nèi)注射的方法；在與明礬 水充分混合之后，以百日咳死菌為佐劑并添加的方法。另外，也可以在經(jīng)最初的免疫之后經(jīng) 過合適的期間后，對小鼠的腹腔內(nèi)或靜胍內(nèi)追加免疫。另外，在抗原量少的情況下，可以將 抗原懸浮的溶液直接注入小鼠脾臟進行免疫。自最終免疫起數(shù)日后摘除脾臟并剝離脂肪組 織之后，制作脾細胞懸浮液。使該脾細胞和例如HGPRT缺失骨髓瘤細胞發(fā)生細胞融合而制 作雜交瘤。作為細胞融合劑，只要是可以將脾細胞(B細胞)和骨髓瘤細胞有效融合的方法 即可，例如可以舉出使用仙臺病毒(HVJ)、聚乙二醇(PEG)的方法等。另外，可以利用使用高 電壓脈沖的方法進行細胞融合。在細胞融合操作之后，用HAT培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，選擇脾細胞 和骨髓瘤細胞融合后的雜交瘤的克隆，等待細胞發(fā)育直到可以篩選。用于選擇生產(chǎn)目標抗 體的雜交瘤的抗體的檢測法、抗體效價的測定法，可以利用抗原抗體反應體系。具體而言， 在針對可溶性抗原的抗體測定法中，可以舉出放射性同位素免疫定量法(RIA)、酶免疫定量 法(ELISA)等。如果在單鏈DNA中存在的CpG有至少一處被甲基化，則可以與抗甲基化抗體結(jié)合。 因此，本發(fā)明的方法中的“甲基化后”是指在DNA中存在的CpG至少一處被甲基化的DNA，并 非僅指在DNA中存在的CpG全部被甲基化的DNA。“特定寡核苷酸”是具有可以通過互補性與含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA結(jié)合的堿 基序列的寡核苷酸，且具有與后述的支持體結(jié)合的功能。在這里，將“可以通過互補性與含 有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA結(jié)合的堿基序列”稱為特定粘附序列?！翱梢酝ㄟ^互補性與含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA結(jié)合的堿基序列”是指具有對目 標DNA區(qū)域的單鏈DNA的堿基序列的一部分、或與目標DNA區(qū)域的5，末端相比更靠近5， 末端側(cè)的DNA區(qū)域的堿基序列的一部分、或與目標DNA區(qū)域的3’末端相比更靠近3’末端 側(cè)的堿基序列的一部分相互補的堿基序列，且是可以與含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA的一 部分互補結(jié)合的堿基序列。本發(fā)明方法的第四工序中的“不抑制單鏈甲基化DNA中的目標DNA區(qū)域的甲基化 后的一個以上的堿基和該甲基化DNA抗體的結(jié)合”是指，在甲基化DNA抗體與甲基化后的單 鏈DNA的結(jié)合所需的占有空間內(nèi)，不會發(fā)生特定寡核苷酸和上述單鏈DNA的互補結(jié)合。為 了使甲基化DNA抗體與甲基化后的堿基(胞嘧啶)結(jié)合，不僅是直接結(jié)合的甲基化后的堿 基(胞嘧啶)，而且甲基化的堿基(胞嘧啶)所存在的周邊空間也被占有。因此，關(guān)于特定 寡核苷酸，只要就在具有目標DNA區(qū)域的DNA上結(jié)合甲基化DNA抗體所需的占有空間而言， 是不與上述單鏈DNA(目標DNA區(qū)域的DNA)互補結(jié)合的堿基序列即可。在上述單鏈DNA上 結(jié)合的特定寡核苷酸，沒有必要是1種，只要不抑制甲基化DNA抗體的結(jié)合，可以使用2種 以上。只要使用多個特定寡核苷酸，就可以使定量精度及檢測靈敏度提高。第四工序的“使單鏈甲基化DNA、甲基化DNA抗體、具有如下堿基序列的特定寡核 苷酸混合，而形成具有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA、該甲基化DNA抗體、與該 特定寡核苷酸的復合體，所述堿基序列不會抑制該單鏈甲基化DNA中的目標DNA區(qū)域的被 甲基化后的一個以上的堿基和該甲基化DNA抗體的結(jié)合，且可以通過互補性與該單鏈DNA 結(jié)合”，是指使具有目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA和特定寡核苷酸互補結(jié)合，進而，使具有目標DNA區(qū)域的DNA與甲基化DNA抗體結(jié)合，形成含有具有甲基化后的目標DNA區(qū)域的 DNA、特定寡核苷酸、甲基化DNA抗體的復合體。在這里，通過使特定寡核苷酸固定于支持體 上，可以將該復合體固定于支持體上。為了在第四工序中是“具有目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA和特定寡核苷酸互補” 結(jié)合，例如使具有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA和特定寡核苷酸互補結(jié)合，使 該特定寡核苷酸固定于支持體上之后，使甲基化DNA抗體與該具有甲基化后的目酶免疫定 量法標DNA區(qū)域的DNA結(jié)合即可。為了使“具有目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA和特定寡 核苷酸互補結(jié)合”，例如，用Tris-HCl緩沖液(IOmM)將上述具有目標DNA區(qū)域的DNA的溶液 和可以與該DNA互補結(jié)合的特定寡核苷酸制成0. 02 μ M的溶液，將各溶液和緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖醇)各 10 μ L、與 IOOmM MgCl2 溶液10yL、lmg/mL BSA溶液10 μ L混合，進而向該混合液中添加滅菌超純水，使液量為 IOOyL0隨后，在95°C下加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘之后，冷 卻至50°C，保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘，然后通過恢復到室溫，可以促進具有 目標DNA區(qū)域的DNA與特定寡核苷酸的結(jié)合體的形成。“互補結(jié)合”是指通過基于堿基之間的氫鍵的堿基配對而形成雙鏈DNA。例如，形 成構(gòu)成DNA的雙鏈中各單鏈DNA的堿基，通過嘌呤和嘧啶的堿基配對形成雙鏈，更具體而 言，通過多個連續(xù)的、基于胸腺嘧啶和腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶的氫鍵的堿基配對而形成雙 鏈DNA。也將通過互補性進行結(jié)合稱為“互補結(jié)合”?！盎パa結(jié)合”也寫成“互補的結(jié)合”、“通 過互補性而結(jié)合”、“互補的(基于堿基配對)的結(jié)合”、“互補的堿基配對”、或“形成互補的 堿基配對”。還將可以互補結(jié)合的堿基序列相互寫成“具有互補性”、或“為互補性“。人工 制作的寡核苷酸中所含的肌苷與胞嘧啶、或腺嘌呤、或胸腺嘧啶通過氫鍵的結(jié)合也包括在 互補結(jié)合中。“含有相對于目標DNA區(qū)域為互補性的堿基序列的單鏈DNA”，是指為形成與含 有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA的結(jié)合體(雙鏈)所必需的堿基序列，即含有與目標DNA區(qū)域 的堿基序列的一部分互補的堿基序列的堿基序列，也寫成“互補的堿基序列”。另外，互補的 堿基序列也寫成“互補的”、“可以通過互補性結(jié)合的堿基序列”、或“互補的序列”。在本發(fā)明方法中，在具有目標DNA區(qū)域的DNA和特定寡核苷酸“通過互補性進行結(jié) 合”的情況下，也包括構(gòu)成特定寡核苷酸的特定粘附序列的堿基序列的一部分未與具有目 標DNA區(qū)域的DNA形成堿基配對的情況。例如，構(gòu)成特定粘附序列的堿基當中至少75%、優(yōu) 選80%以上的堿基與具有目標DNA區(qū)域的DNA形成堿基配對，且也包括與具有目標DNA區(qū) 域的DNA有至少75%以上、優(yōu)選80%以上的同源性的寡核苷酸和特定粘附序列可以結(jié)合的 情況。在具有目標DNA區(qū)域的DNA是后述的基因組中的重復序列的情況下，重復序列是 具有同源性的一組堿基序列，有可能發(fā)生特定粘附序列的一部分未與具有目標DNA區(qū)域的 DNA形成堿基配對的情況。即，在本發(fā)明的方法中，在具有目標DNA區(qū)域的DNA是LINE序 列、SINE(Alu)序列等重復序列的情況下，也會使用可以通過互補性與具有80%以上的同 源性的堿基序列結(jié)合的特定粘附序列。作為使含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA與特定寡核苷酸的結(jié)合體形成的優(yōu)選實施方 式，可以舉出使其在含有二價陽離子的反應體系中形成。更優(yōu)選可以舉出二價陽離子為鎂 離子。這里的“含有二價陽離子的反應體系”是指在用于使具有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA與特定寡核苷酸結(jié)合的退火緩沖液中含有二價陽離子之類的反應體系，具體而言，例如可 以舉出以ImM 600mM的濃度含有以鎂離子為構(gòu)成要素的鹽(例如MgOAc2、MgCl2等)的體 系。在本發(fā)明方法的第四工序中，可以混合針對2種以上的目標DNA區(qū)域的特定寡核 苷酸而形成復合體，另外，對于1種目標區(qū)域，可以混合2種以上的特定寡核苷酸而形成復 合體。在本發(fā)明方法中在使“形成復合體”時，由具有目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA、特 定寡核苷酸和甲基化DNA抗體形成的復合體，與后述的支持體結(jié)合而被固定。為了“形成復合體”，具體而言，例如作為可以固定于支持體的特定寡核苷酸，可以 使用末端被生物素標記的“生物素化特定寡核苷酸”，如下所示加以實施。(a)向基因組DNA來源的DNA試樣中，添加退火緩沖液(例如，33mM Tris-醋酸鹽 pH 7. 9、66mM KOAcUOmM Mg0Ac2、0. 5mM 二硫蘇糖醇)、及生物素化特定寡核苷酸，由此得到 混合物。接著，為了使基因組DNA來源的雙鏈DNA成為單鏈DNA，將得到的混合物在95°C下 加熱例如數(shù)分鐘。接著，為了形成含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和生物素化特定寡核苷酸 的結(jié)合體，迅速冷卻至比生物素化特定寡核苷酸的Tm值低約10 20°C的溫度，在該溫度下 保溫例如數(shù)分鐘，隨后，恢復至室溫。(b)向在用抗生蛋白鏈菌素被覆的支持體添加在上述(a)中得到的混合物添加， 進而將其在37°C下保溫例如數(shù)分鐘，由此使含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和生物素化特定 寡核苷酸的結(jié)合體固定在用抗生蛋白鏈菌素被覆的支持體上。隨后，進行殘余溶液的除去 及清洗。以例如300 μ L/孔的比例添加清洗緩沖液(例如含0. 05% Tween20的磷酸緩沖液 (ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4))，除去溶液。數(shù)次反復該清洗操作，使固 定于支持體上的生物素化特定寡核苷酸和含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA的結(jié)合體殘留在孔 上。(c)向孔中添加適量甲基化DNA抗體(例如溶液的添加量為IOOyL/ 孔)，隨后，室溫下靜置例如約3小時，促進形成甲基化DNA抗體、上述單鏈DNA當中含有具 有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA、和生物素化特定寡核苷酸的復合體(復合體的形 成)。隨后，進行殘余溶液的除去及清洗。以例如300 μ L/孔的比例添加清洗緩沖液(例如 含0.05%Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7·4))，除去 溶液。數(shù)次反復該清洗操作，使復合體在孔上殘留(復合體的選擇)。作為(a)中使用的退火緩沖液，只要適于使特定寡核苷酸與含有目標DNA區(qū)域的 單鏈DNA結(jié)合即可，并不限于上述退火緩沖液。只要使用以1 600mM的濃度溶解有二價 離子、優(yōu)選鎂離子的緩沖液，結(jié)合的穩(wěn)定性就增加。關(guān)于(b)及(c)中的清洗操作，是從反應溶液除去未與特定寡核苷酸結(jié)合的DNA、 未固定于支持體上的甲基化DNA抗體、或經(jīng)由后述的限制酶消化的在溶液中懸浮的DNA等， 所以比較重要。清洗緩沖液只要適于除去上述的游離的甲基化DNA抗體、在溶液中懸浮 的單鏈DNA等即可，不限于上述清洗緩沖液，可以是DELFIA緩沖液(PerkinElmer公司制、 Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80)、TE 緩沖液等。在上述(a) (c)中，使上述的含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和生物素化特定寡 核苷酸的結(jié)合，較之生物素化特定寡核苷酸和用抗生蛋白鏈菌素被覆的支持體的固定在前階段實施，但其順序可以是任何順序。例如，在固定于用抗生蛋白鏈菌素被覆的持體上的生 物素化特定寡核苷酸中，添加基因組DNA來源的DNA試樣，由此得到混合物。為了使基因組 DNA所具有的含有目標DNA區(qū)域的雙鏈DNA成為單鏈，將得到的混合物在95°C下加熱例如 數(shù)分鐘，隨后為了形成與生物素化特定寡核苷酸的結(jié)合體，迅速冷卻至比生物素化特定寡 核苷酸的Tm值低約10 20°C的溫度，在該溫度下保溫例如數(shù)分鐘。隨后，可以實施(c)的 操作而形成·選擇復合體。在該階段，含有未被甲基化的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和特定 寡核苷酸的結(jié)合體不形成復合體。也可以使用色譜條進行上述(a) (C)的操作。在該情況下，具體而言，如下所示 加以實施。使基因組DNA所具有的含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和生物素化特定寡核苷酸 的結(jié)合體得以形成的溶液，被用抗生蛋白鏈菌素被覆一部分的色譜條展開。通過本操作， 基因組DNA所具有的含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和生物素化特定寡核苷酸的結(jié)合體，被 用抗生蛋白鏈菌素被覆的部分加以固定。接著，適量的甲基化DNA抗體被上述的色譜條展 開。通過這些操作，包括基因組DNA具有的含有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA、生物 素化特定寡核苷酸、和甲基化DNA抗體的復合體，被用抗生蛋白鏈菌素被覆的部分加以固 定(復合體的形成及選擇)。就這些操作而言，用于形成復合體的操作的順序可以為任意順 序。例如，在形成了含有具有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA、生物素化特定寡核苷酸、 和甲基化DNA抗體的復合體之后，用色譜條將其展開，可以在用抗生蛋白鏈菌素被覆的部 分固定該復合體。在這些操作中，通過用色譜條展開溶液，可以除去沒有用的成分，省略清 洗操作成為可能。在各操作之間，即便實施清洗操作(通過清洗緩沖液(例如含有0.05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20U54mM NaCl ρΗ7· 4)的色譜條的展 開)也沒有問題。作為“支持體”，只要是復合體可以結(jié)合的支持體，對其材質(zhì)及形狀就沒有限制。例 如，形狀適于使用目的即可，可以舉出管狀、試驗板狀、濾器狀、盤狀、珠狀等。另外，作為材 質(zhì)，可以是通常的免疫測定法用支持體所使用的材料，例如可以是聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙 烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚丙烯腈、尼龍等合成樹脂，或向上述合成樹脂中導入了 磺基、氨基等反應性官能團得到的材料。另外，還可以是玻璃、多糖類或其衍生物(纖維素、 硝基纖維素等)、硅膠、多孔性陶瓷、金屬氧化物等。在復合體固定于支持體上的情況下，在最終形成了具有甲基化后的目標DNA區(qū)域 的單鏈DNA、特定寡核苷酸和甲基化DNA抗體的復合體的狀態(tài)下，該復合體固定于支持體上 即可，(1)在上述單鏈DNA和特定寡核苷酸互補結(jié)合的階段，特定寡核苷酸固定于支持 體上，隨后可以在該單鏈DNA上結(jié)合甲基化DNA抗體，另外，(2)在上述單鏈DNA、特定寡核苷酸和甲基化DNA抗體形成了復合體之后，特定寡 核苷酸可以固定于支持體上。為了將特定寡核苷酸固定于支持體上，具體而言，可以舉出使特定寡核苷酸的5’ 末端或3’末端生物素化而得到的生物素化寡核苷酸固定在用抗生蛋白鏈菌素被覆的支持 體(例如用抗生蛋白鏈菌素被覆的PCR管、用抗生蛋白鏈菌素被覆的磁珠、用抗生蛋白鏈菌 素被覆一部分的色譜條等)上的方法。另外，也有如下的方法，即在使特定寡核苷酸的5’ 末端或3’末端與具有氨基、硫醇基、醛基等活性官能團的分子共價結(jié)合之后，使其與表面被硅烷偶聯(lián)劑等活化后的玻璃、多糖類衍生物、硅膠、或上述合成樹脂等、或耐熱性塑料制的 支持體共價結(jié)合的方法。另外，共價結(jié)合例如可以舉出通過將5個甘油三酯串聯(lián)連結(jié)而成 的間隔區(qū)、交聯(lián)劑等而共價結(jié)合的方法。進而，還可以舉出在玻璃或硅制的支持體上直接從 特定寡核苷酸的末端側(cè)進行化學合成的方法。在“在上述單鏈DNA和特定寡核苷酸互補結(jié)合的階段，特定寡核苷酸被固定于支 持體上，隨后，在上述單鏈DNA上結(jié)合甲基化DNA抗體”的情況下，可以同時添加甲基化DNA 抗體和掩蔽寡核苷酸。本發(fā)明方法的“掩蔽寡核苷酸”，是指可以與特定寡核苷酸互補結(jié)合的寡核苷酸， 是指如下的寡核苷酸，即，在為“在單鏈DNA和特定寡核苷酸互補結(jié)合的階段，特定寡核苷 酸被固定于支持體上”的階段，通過不與作為上述單鏈DNA的具有目標DNA區(qū)域的DNA結(jié) 合、且與被固體化到支持體的單鏈狀態(tài)的特定寡核苷酸互補結(jié)合，而成為雙鏈的狀態(tài)，抑制 甲基化DNA抗體與以單鏈的狀態(tài)存在的特定寡核苷酸非特異性結(jié)合而添加的寡核苷酸。作 為掩蔽寡核苷酸，具體而言，只要具有特定寡核苷酸的互補的堿基序列即可，與特定寡核苷 酸進行了互補結(jié)合的結(jié)果，是只要為不產(chǎn)生成為單鏈的部分的寡核苷酸即可。需要說明的是，掩蔽寡核苷酸可以在使具有目標DNA區(qū)域的DNA和特定寡核苷酸 的結(jié)合體與甲基化DNA抗體結(jié)合而形成復合體之前添加，也可以在使具有目標DNA區(qū)域的 DNA和特定寡核苷酸的結(jié)合體與甲基化DNA抗體結(jié)合而形成復合體時，與甲基化DNA抗體同 時添加。第五工序是利用其識別功能對在第四工序中形成的復合體中所含的上述甲基化 DNA抗體進行定量或檢測，由此對具有上述單鏈甲基化DNA中的具有目標DNA區(qū)域的DNA進 行定量或檢測的工序。第五工序的“檢測”，是指通過甲基化DNA抗體的識別功能，可以在由第一工序獲 得的甲基化DNA和第二工序中通過DNA甲基化酶處理甲基化后的甲基化DNA的總量超過檢 測限而存在的情況下，進行判斷。在未檢測到甲基化后的DNA的情況下，就標本中的目標 DNA區(qū)域而言，表示由第一工序獲得的甲基化DNA和在第二工序中通過DNA甲基化酶處理甲 基化后的甲基化DNA不到檢測限。另外，第五工序的“定量”，是指通過甲基化DNA抗體的識別功能檢測出的檢測量 的數(shù)值化。即，是指得到與由第一工序獲得的甲基化DNA和在第二工序中通過DNA甲基化 酶處理而甲基化后的甲基化DNA的總量相關(guān)的值。例如，作為識別功能而對甲基化DNA抗 體的量進行了定量的值，是與標本中的目標DNA區(qū)域的DNA的量相關(guān)的值，例如，在標本是 ImL的血清的情況下，是指獲得與血清ImL中所含的目標區(qū)域的DNA的、由第一工序獲得的 甲基化DNA和在第二工序中通過DNA甲基化酶處理而甲基化后的甲基化DNA的總量相關(guān)的 值。第五工序的“識別功能”，只要是能對甲基化DNA抗體進行檢測或定量的功能即 可。該識別功能只要是甲基化DNA抗體具有的功能即可，例如，可以舉出基于甲基化DNA抗 體的標記的識別功能、通過與甲基化DNA抗體結(jié)合的檢測分子向甲基化DNA抗體賦予的識 別功能。具體而言，可以舉出完成了銪標記、金膠體標記、乳膠珠標記、放射性同位素標記、 熒光物質(zhì)(FITC等)標記、辣根過氧化物酶(HRP)標記、堿性磷酸酶標記、生物素標記等的 甲基化DNA抗體的熒光·發(fā)色等特性。這些標記是熒光·發(fā)色等功能，另外，通過抗體自身的特性(抗體自身與二次抗體結(jié)合的特性等)等，這些標記后的分子可以與甲基化DNA抗 體結(jié)合。與甲基化DNA抗體結(jié)合的抗體(也稱為二次抗體)，可以被實施銪標記、金膠體標 記、乳膠珠標記、放射性同位素標記、熒光物質(zhì)(FITC等)標記、辣根過氧化物酶(HRP)標 記、堿性磷酸酶標記、生物素標記等。作為二次抗體，在甲基化DNA抗體未經(jīng)任何標記的情 況下，將能使該甲基化DNA抗體為抗原的抗體作為二次抗體即可。另外，在甲基化DNA抗體 未被標記的情況下，可以將針對該標記的抗體作為二次抗體利用。具體而言，對于經(jīng)FITC 標記的甲基化DNA抗體，可以利用FITC抗體作為檢測分子二次抗體。作為這些功能的定量 或檢測機構(gòu)，例如可以舉出利用放射線檢測器、分光光度計等的測定，或目視等。在本發(fā)明方法中，將特定寡核苷酸加以固定的支持體可以是微粒，進而微?？梢?與支持體一樣結(jié)合在甲基化DNA抗體上。作為微粒，可以舉出乳膠珠、金膠體(金納米粒 子)等。在本發(fā)明方法中，在支持體和甲基化DNA抗體上結(jié)合有相同種類的微粒時，作為 支持體的微粒和與甲基化DNA抗體結(jié)合的微粒，通過被微粒加以固定的甲基化DNA和具有 目標DNA區(qū)域的DNA、及甲基化DNA抗體形成復合體而可以檢測出微粒的凝集。在該情況 下，如果微粒是乳膠珠，則凝集體可以通過濁度的變化而檢測出。另外，如果微粒為金膠體 (金納米粒子)，凝集體可以通過色調(diào)變化(粉色變成紫色)而檢測出。進而，在本發(fā)明方法中，在一個具有目標DNA區(qū)域的DNA上同時結(jié)合有多個結(jié)合了 微粒的甲基化DNA抗體的情況下，也可以檢測出微粒的凝集。在與甲基化DNA抗體結(jié)合的 微粒是乳膠珠的情況下，凝集體可以通過濁度的變化檢測出，在與甲基化DNA抗體結(jié)合的 微粒是金膠體(金納米粒子)的情況下，凝集體可以通過色調(diào)變化(粉色變成紫色)檢測 出。需要說明的是，在該情況下，即便不附加特定寡核苷酸而實施，也可以得到與添加了甲 基化DNA抗體的情況一樣的結(jié)果。S卩，是指通過甲基化DNA抗體、特定寡核苷酸、具有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單 鏈甲基化DNA結(jié)合而形成檢測復合體，特定寡核苷酸所結(jié)合的作為支持體的微粒與在甲基 化DNA抗體上結(jié)合的微粒形成凝集體。在如此通過微粒的凝集檢測甲基化后的程度的情況 下，即便不附加特定寡核苷酸而實施，也可以得到與添加了特定寡核苷酸的情況一樣的結(jié)^ ο利用微粒的凝集體檢測出的量，成為與第二工序之前的甲基化的DNA的總和相關(guān) 的值。在由第一工序獲得的DNA是組織中的細胞所含的DNA的情況下，組織中的細胞所含 的DNA的甲基化程度因組織的不同而不同，所以在第二工序中得到的DNA的甲基化程度包 括組織中的細胞的甲基化程度和在第二工序中被甲基化的程度雙方。即，在第二工序中未 實施DNA甲基化酶處理的情況下由微粒的凝集體檢測出的量，成為與組織中的細胞的甲基 化程度相關(guān)的值。在本發(fā)明方法中，“用于檢測出標本中所含的目標DNA區(qū)域的DNA”，作為優(yōu)選的實 施方式之一，可以舉出預先由不以該DNA所具有的目標DNA區(qū)域為識別剪切位點的限制酶 實施消化處理而成的DNA試樣。在使含有基因組DNA所具有的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和 特定寡核苷酸形成結(jié)合體的情況下，只要該單鏈DNA含有目標DNA區(qū)域，則鏈短的一方不僅 更容易形成復合體，而且操作性也好。為了縮短單鏈DNA，在為原始的基因組DNA時縮短是 有效的。因此，可以使不以目標DNA區(qū)域為識別剪切位點的限制酶直接作用于基因組DNA來源的DNA試樣來實施消化處理。作為通過不以目標DNA區(qū)域為識別剪切位點的限制酶實 施消化處理的方法，使用通常的限制酶處理法即可。在標本是經(jīng)預先精制而成的DNA試樣 的情況下，使用常規(guī)用量的限制酶實施處理即可，在標本是組織溶解液、細胞溶解液等的情 況下，使用大量過剩的限制酶，例如使用相對于DNA量為500倍量或其以上的的量限制酶實 施處理即可。作為對血液、尿等生物體試樣中所含的微量物質(zhì)進行定量或檢測的方法，廣泛使 用的是免疫學測定方法。在其方法當中使用了色譜法的所謂免疫色譜法法，操作簡單，檢驗 所需的時間也短，所以當前在大多數(shù)情況下廣泛用于例如醫(yī)院的臨床檢查、研究室的檢驗 試驗等。另外，近年來使用如下的所謂雜交色譜法，即，使標記過的DNA(基因)在色譜條上 展開，使用能夠捕捉目標DNA(基因)的探針進行雜交，由此檢測出目標DNA(基因)。該方 法也由于操作簡便，檢驗所需的時間也短，所以當前在大多數(shù)情況下開始廣泛用于例如醫(yī) 院的臨床檢查、研究室的檢驗試驗等。本發(fā)明方法在概念上可以是混合了上述的免疫色譜 法法和雜交色譜法的方法。在本發(fā)明方法中，關(guān)于復合體的形成及復合體的選擇，其順序沒 有特別限定，可以為各種方法。具體而言，例如，如下所示加以實施即可。方法1 向甲基化后的DNA (具有目標DNA區(qū)域通過DNA甲基化酶加以甲基化后的 胞嘧啶的DNA)中，添加作為被支持體加以固定的功能而結(jié)合了生物素的特定寡核苷酸的 生物素化特定寡核苷酸，使含有目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA和生物素化特定寡核苷酸 形成結(jié)合體，接著，添加具有識別功能的甲基化抗體，形成含有甲基化后的目標DNA區(qū)域的 單鏈DNA、生物素化特定寡核苷酸、和具有識別功能的甲基化DNA抗體經(jīng)結(jié)合而成復合體。 將得到的試樣滴加(導入)到色譜條的導入部時，上述復合體通過毛細管現(xiàn)象在展開部移 動，被預先用抗生蛋白鏈菌素被覆的部分捕捉。隨后，利用其識別功能對形成有得到的復合 體的甲基化DNA抗體進行定量或檢測，由此可以對目標DNA區(qū)域中的甲基化后的DNA進行 定量或檢測。方法2 向甲基化后的DNA (具有目標DNA區(qū)域通過DNA甲基化酶加以甲基化后的 胞嘧啶的DNA)，添加作為被支持體加以固定的功能而結(jié)合了生物素的特定寡核苷酸的生物 素化特定寡核苷酸，使含有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和生物素化特定寡核苷酸形成結(jié)合體。 將得到的試樣滴加(導入)到色譜條的導入部時，上述結(jié)合體通過毛細管現(xiàn)象在展開部移 動，被預先用抗生蛋白鏈菌素被覆的部分捕捉。隨后，將具有識別功能的甲基化抗體滴加 (導入)到導入部時，在展開部移動，與結(jié)合體的甲基化后的胞嘧啶結(jié)合，形成含有甲基化 后的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA、生物素化特定寡核苷酸和具有識別功能的甲基化DNA抗體經(jīng) 結(jié)合而成的復合體。利用其識別功能對形成有得到的復合體的甲基化DNA抗體進行定量或 檢測，由此可以對目標DNA區(qū)域中的甲基化后的DNA進行定量或檢測。方法3 在將生物素化特定寡核苷酸滴加(導入)到色譜條的導入部時，上述寡核 苷酸通過毛細管現(xiàn)象在展開部移動，被預先用抗生蛋白鏈菌素被覆的部分捕捉。接著，將單 鏈甲基化后的DNA(目標DNA區(qū)域中具有甲基化后的胞嘧啶的單鏈DNA)滴加(導入)到導 入部時，在展開部移動，通過已被捕捉的生物素化特定寡核苷酸，含有目標DNA區(qū)域的單鏈 DNA以形成結(jié)合體的形式被捕捉(在該階段形成的結(jié)合體，除了含有甲基化后的目標DNA區(qū) 域的單鏈DNA和特定寡核苷酸的結(jié)合體之外，還包括含有未被甲基化的目標DNA區(qū)域的單 鏈DNA和特定寡核苷酸的結(jié)合體)。隨后，將具有識別功能的甲基化抗體滴加(導入)到導入部時，在展開部移動，與結(jié)合體的甲基化后的胞嘧啶結(jié)合，形成由含有甲基化后的目標 DNA區(qū)域的單鏈DNA、生物素化特定寡核苷酸和具有識別功能的甲基化DNA抗體經(jīng)結(jié)合而成 的復合體(在該階段，含有未被甲基化的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和特定寡核苷酸的結(jié)合 體不形成復合體)。利用其識別功能對形成有得到的復合體的甲基化DNA抗體進行定量或 檢測，由此可以對目標DNA區(qū)域中的甲基化后的DNA進行定量或檢測。方法4 在將生物素化特定寡核苷酸滴加(導入)到色譜條的導入部時，上述寡核 苷酸通過毛細管現(xiàn)象在展開部移動，被預先用抗生蛋白鏈菌素被覆的部分捕捉。向單鏈甲 基化后的DNA(目標DNA區(qū)域中具有甲基化后的胞嘧啶的單鏈DNA)添加具有識別功能的甲 基化DNA抗體，形成具有甲基化后的胞嘧啶的單鏈DNA (其中，存在含有目標DNA區(qū)域的單 鏈DNA和目標以外的單鏈DNA)和具有識別功能的甲基化DNA抗體的結(jié)合體(在該階段形 成的結(jié)合體，除了含有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA和甲基化抗體的結(jié)合體之外，還 包括目標DNA區(qū)域以外的甲基化后的單鏈DNA和甲基化抗體的結(jié)合體)。將得到的結(jié)合體 滴加(導入)到導入部，在展開部移動，已被捕捉的生物素化特定寡核苷酸與含有甲基化后 的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA結(jié)合，形成由含有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈DNA、生物素 化特定寡核苷酸和具有識別功能的甲基化DNA抗體經(jīng)結(jié)合而成的復合體(在該階段，目標 DNA區(qū)域以外的甲基化后的單鏈DNA和甲基化抗體的結(jié)合體不形成復合體)。利用其識別 功能對形成有得到的復合體的甲基化DNA抗體進行定量或檢測，由此可以對目標DNA區(qū)域 中的甲基化后的DNA進行定量或檢測。也可以使一個色譜條上存在多個檢測部位(將能夠捕捉各不相同的目標DNA區(qū)域 這樣的特定寡核苷酸固定在支持體上)，對各目標DNA區(qū)域順次進行定量或檢測，另外，通 過能在1個檢測部位捕捉多個目標DNA區(qū)域，即，如果在1個檢測部位固定大量能夠捕捉多 個目標DNA區(qū)域這樣的特定寡核苷酸，可以飛躍性提高檢測靈敏度。在本發(fā)明的第四工序中，可以在形成復合體時添加反向寡核苷酸?！胺聪蚬押塑账帷笔侵笧榱耸闺p鏈DNA中的甲基化后的堿基即甲基化堿基容易結(jié)合 甲基化DNA抗體而制作的寡核苷酸。通常甲基化堿基是在雙鏈DNA中被甲基化的堿基，在 DNA是雙鏈的狀態(tài)下，甲基化DNA抗體難以結(jié)合。即，為了使甲基化DNA抗體可以結(jié)合的區(qū) 域為單鏈DNA，設(shè)計堿基序列與目標序列(正鏈)相同的寡核苷酸(正鏈)，使其與和目標 區(qū)域配對的堿基序列(負鏈)結(jié)合，使目標區(qū)域成為單鏈DNA，由此甲基化DNA抗體容易與 甲基化DNA堿基結(jié)合。例如，在使目標區(qū)域中的甲基胞嘧啶與甲基胞嘧啶抗體結(jié)合的情況下，添加堿基 序列與目標區(qū)域相同的反向寡核苷酸。在本發(fā)明方法中，反向寡核苷酸的特征在于，具有 不與特定寡核苷酸配對的堿基序列，不抑制特定寡核苷酸和含有目標區(qū)域的DNA片段的結(jié) 合。具體而言，反向寡核苷酸是由5 100堿基構(gòu)成的寡核苷酸，優(yōu)選由10 50堿基構(gòu)成 的寡核苷酸。需要說明的是，具有目標區(qū)域的堿基序列的反向寡核苷酸通常混合多種混合 使用。對未進行上述第二工序中DNA的通過DNA甲基化酶的甲基化而利用上述第五工序 測定的甲基化后的DNA的量(甲基化后的DNA的總量)、和在第二工序中通過DNA甲基化酶 將DNA甲基化后而利用第五工序測定的DNA的量(甲基化后的DNA及未甲基化的DNA的總 量)進行比較，由此可以算出上述目標DNA區(qū)域中甲基化后的DNA的比例(以下也記為本甲基化比例測定方法)。本甲基化比例測定方法在以下的情況下利用即可。已知各種疾病(例如癌)中發(fā)生DNA的甲基化異常，通過檢測出該DNA甲基化異 常，可以測定各種疾病的病況(程度)測。例如，就疾病來源的生物來源標本中所含的基因 組DNA而言，由100%被甲基化的DNA區(qū)域，關(guān)于該DNA區(qū)域，如果實施本發(fā)明方法或本甲基 化比例測定方法，被檢測或定量的甲基化了的DNA的量多。另一方面，就疾病來源的生物來 源標本中所含的基因組DNA而言，有100%未被甲基化的DNA區(qū)域，關(guān)于該DNA區(qū)域，如果 實施本發(fā)明方法或本甲基化比例測定方法，被檢測或定量的甲基化了的DNA的量大致成為 接近0的值。另外，例如在健康者的生物來源標本中所含的基因組DNA中，有甲基化比例低 的DNA區(qū)域，且在疾病患者的生物來源標本中所含的基因組DNA中，有甲基化比例高的DNA 區(qū)域，關(guān)于該DNA區(qū)域，如果實施本發(fā)明方法或本甲基化比例測定方法，則在健康者的情況 下，被檢測或定量的甲基化了的DNA的量示出為接近0的值。另一方面，在疾病患者的情況 下，與健康者的情況下的上述值相比示出顯著高值，根據(jù)該值的差異，可以判定“疾病的病 況(程度)”。這里的“疾病的病況”，與通常在該領(lǐng)域中使用的意思一樣，具體而言，例如在生物 來源標本是細胞的情況下，是指該細胞的惡性度，另外，在生物來源標本是組織的情況下， 是指該組織中疾病細胞的存在量等。因此，關(guān)于本發(fā)明方法或本甲基化比例測定方法，通過 檢查甲基化異常的程度(病況)，可以診斷各種疾病的程度。本發(fā)明方法中可以使用的限制酶、特定寡核苷酸、或甲基化DNA抗體，作為檢測用 試劑盒的試劑是有用的。通過本發(fā)明方法，可以提供含有這些限制酶、特定寡核苷酸、或甲 基化DNA抗體等作為試劑的血中游離DNA的檢測用試劑盒、樣品中的微生物檢測用試劑盒。上述含有目標DNA區(qū)域的DNA通過與特定寡核苷酸的互補結(jié)合而被選擇。在目標 DNA區(qū)域中的CpG的胞嘧啶被甲基化的情況下，該胞嘧啶成為甲基胞嘧啶抗體結(jié)合的檢測 對象，所以特定寡核苷酸優(yōu)選不與目標DNA區(qū)域中的胞嘧啶、CpG形成堿基配對。由此，目 標DNA區(qū)域優(yōu)選附近具有能與特定寡核苷酸的特異性堿基配對的堿基序列。另外，在目標 區(qū)域的內(nèi)部通過互補的堿基配對與特定寡核苷酸結(jié)合的情況下，特定寡核苷酸通過互補性 與目標DNA區(qū)域中的堿基序列結(jié)合的堿基序列優(yōu)選為不含CpG的序列。在目標區(qū)域是微生物來源的堿基序列的情況下，作為用于檢測目標DNA區(qū)域的 DNA，可以舉出從標本中提取的基因組DNA、DNA片段、或通過逆轉(zhuǎn)錄酶使從標本中提取的 RNA成為DNA的堿基序列。作為可以與特定寡核苷酸互補結(jié)合的堿基序列，選擇相對于該 微生物具有特異性的區(qū)域即可。例如，在本發(fā)明的目標區(qū)域是微生物的堿基序列的情況下， 為了從標本中選擇性提取目標區(qū)域，在微生物基因組DNA、或利用逆轉(zhuǎn)錄酶使從標本中提取 的RNA成為DNA等的堿基序列當中，使位于目標區(qū)域附近的微生物特有的堿基序列成為與 特定寡核苷酸特異性結(jié)合的堿基序列即可。通常在對活組織樣品、食品中是否含有病原性微生物進行檢查的情況下，針對 各微生物抗原進行基于免疫法的檢查，由此來考察有無該病原性微生物，或鑒定該病原 性微生物。但是，該免疫法中使用的抗體的制作并不容易，進而為了檢測多個病原性微 生物，有必要制作針對各病原性微生物的抗原的抗體。通過使用本發(fā)明方法，可以在不 制作這些繁瑣的抗體的情況下對病原性微生物實施簡易檢查。另外，在本發(fā)明方法中，可以同時檢查不同的病原性微生物的堿基序列，可以同時檢測出一個標本中所含的數(shù)種 病原性微生物。具體而言，已知有單核細胞增生利斯特氏菌、腸沙門氏菌、空腸彎曲桿 菌空腸亞種、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、蠟狀芽孢桿菌、肉毒梭菌 、小腸結(jié)腸炎耶爾 森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等食物中的毒菌，尚不知曉同時檢測其中的 數(shù)種食物中毒菌的技術(shù)。但是，通過使用本發(fā)明方法，可以同時檢測數(shù)種食物中毒菌的 堿基序列。另外，作為檢測對象的堿基序列，在通過特定寡核苷酸選擇CRISHU成簇的 規(guī)律間隔的短回文重復序列Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)區(qū)域那樣在基因組中多見的堿基序列的情況下，能以比檢測一個基因組中的 一個基因更高的靈敏度檢測出。這樣的技術(shù)在感染癥的診斷、食物中毒菌的迅速檢測 中也是有用的。另外，本發(fā)明方法也可以用于通過檢測環(huán)境中的微生物的基因組進行 產(chǎn)業(yè)上有用的菌的鑒定，土壤、河川、湖沼的沉積物等的微生物群的簡易調(diào)查?？梢源_ 認環(huán)境中的微生物當中例如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜熱堿甲烷 桿菌 deltaH(Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH)超嗜熱菌(Aquifex aeolicus)超嗜熱古菌 OT3(Pyrococcus horikoshii 013)閃爍古生球菌 (Archaeoglobus
fulgidus)、海棲熱袍菌 MSB8 (Thermotoga maritime MSB8)、(Aeropyrum pernix ΚΙ)、地中海富鹽菌(Haloferax mediterranei)的生存。另外，還可以用于硫 還原地桿菌(GecAacter sulfurreducens)這樣可以在工業(yè)上利用的細菌、唾液鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)這樣可以用于發(fā)酵的微生物的檢測、鑒定。例如，作為用于檢測微生物中的基因組的目標區(qū)域和特定寡核苷酸互補結(jié)合的區(qū) 域，具體而言，可以是與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當?shù)膮^(qū)域(序列編號38)、像基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母 染色體VII的堿基編號384569-384685(序列編號6 那樣不對基因進行編碼的堿基序列。 另外，以各種病原性微生物共同的特征基因的、在病原性微生物間保存的堿基序列為檢測 對象，可以提供同時檢測多個病原性微生物的方法，因此是有用的。具體而言，mce-family 基因(結(jié)核桿菌Micobacterium tuberculosis)、13號染色體上的tRNA-Tyr堿基序列(新 型隱球菌)、幾丁質(zhì)合成酶活化劑(Chs3)，是煙曲霉菌及新薩托菌(Neosartorya)屬特有的 堿基序列，所以可以用于通過檢驗在從人的痰、肺的活組織樣品中提取的DNA中是否含有 這些微生物來源的DNA來檢驗微生物所致的感染癥。另外，actA(單核細胞增生利斯特氏 菌)、DyrG(NC 002163、空腸彎曲桿菌空腸亞種)是等食物中毒菌特有的共同的基因，這些 基因可以用于檢驗食物中毒的微生物。另外，thrA具有腸沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏 菌、大腸埃希氏菌中保存的序列，也可以通過一個基因?qū)Χ鄠€微生物進行檢測?？梢詸z索數(shù)據(jù)庫上公開的堿基序列當中微生物特有的堿基序列，探索微生物特有 的堿基序列。例如，只要是在PubMed等公開數(shù)據(jù)庫上的堿基序列，就可以通過常規(guī)的手續(xù) 獲得，所獲得的堿基序列可以通過進行基于常規(guī)手續(xù)的Blast檢索來研究是否是特有的堿 基序列。需要說明的是，特有的堿基序列是指檢測對象中的堿基序列不具有與成為檢測對 象的微生物的基因組堿基序列以外的生物來源的堿基序列示出同源性的堿基序列。特別是在標本為人活組織樣品的情況下，重要的是設(shè)計不與人基因互補結(jié)合的特 定寡核苷酸。另外，同樣在標本是食品的情況下，重要的是設(shè)計不與食品中所含的檢測對象 以外的生物來源的堿基序列互補結(jié)合的特定寡核苷酸。
為了檢測血液中的游離DNA，作為目標DNA區(qū)域，是與游離DNA的量相關(guān)的區(qū)域即 可，在以游離DNA的定量或檢測為目的的情況下，優(yōu)選基因組中的相同序列特別重復數(shù)次 以上的所謂重復序列，更優(yōu)選簡單重復序列(串聯(lián)重復序列、或稱為串聯(lián)重復)、散在重復 序列。簡單重復序列的特征在于，相同序列在相同方向上相鄰存在，已知有衛(wèi)星DNA、小 衛(wèi)星、微衛(wèi)星、著絲粒、端粒、動粒、核糖體集團基因之類的一系列堿基序列等。散在重復序列的特征在于，相同序列不相鄰而散在，認為是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子來源的 DNA。散在重復序列根據(jù)堿基序列的長度分類成SINE (Short Interspersed Repetitive Element 短鏈散在重復序列)和LINE (Long Interspersed Elements 長鏈散在重復序 列)，作為人的堿基序列，Alu序列、LINE-I序列分別作為代表性的重復序列而被周知。另 外，還已知有從RNA、蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)錄的失活的加工后的假基因、通過基因重復而擴增的基因 序列。重復基因是指一個基因組上存在多個具有高同源性的基因的情況，在大多數(shù)情況 下，是在一個基因附近串聯(lián)排列而存在的堿基序列。需要說明的是，假基因也多是重復基因之一。作為重復序列的具體例，例如，作為含有比較短的堿基序列的重復，已知有(A) n、(T) η、(GA) η、(CA) η、(TAA) η、(GGA) η、(CAGC) η、(CATA) η、(GAAA) η、(TATG) η、(TTTG) η、 (TTTA) η、(TTTC) η、(TAAA) η、(TTCA) η、(TATAA) η、(TCTCC) η、(TTTCC) η、(TTTAA) η、(TTTTC) η、(TTTTA) η、(TTTTG) η、(CAAAA) η、(CACCC) η、(TATATG) η、(CATATA) η、(TCTCTG) η、(AGGGGG) η、(CCCCCA) η, (TGGGGG) η (η是指重復數(shù)量)等序列，作為轉(zhuǎn)錄因子來源的序列，hAT組可以 舉出 MERl-Charlie、Zaphod，Tc-I 組可以舉出 MER2_Tigger、iTc-I、Mariner。除此之外，具 體還已知有Tiggerl、Tigger2a、Tigger5、Charlie4a、Charlie7等。這些序列通常是短且 簡單的堿基序列，難以設(shè)定后述的特定粘附序列，只要具有本發(fā)明方法中的、可以設(shè)定為后 述的特定粘附序列及檢測用粘附序列的設(shè)定對象的序列，就可以用于本發(fā)明的方法，并不 需要作為本發(fā)明方法的對象而將其排除。另外，衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星、微衛(wèi)星等是被分類為簡單 重復序列的重復序列。另外，作為基因中有多拷貝的序列，除了作為存在于著絲粒的序列的ALR6、作為 snRNA的U2、U6、以及像tRNA、rRNA那樣已知通常在基因組中有多拷貝的基因之外，還可以 舉出通過基因重復在基因組中有存在多個拷貝的基因等。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒、末端具有LTR(長末端重復序列Lomg terminal repeat) 的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、MaLRs (哺乳類顯性LTR-反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Mammalian apparent LTR-Retrotransposons)之類的認為是病毒來源的內(nèi)源序列、逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的LTR，已知 在一個基因組中存在多個。例如，作為逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的LTR，具體而言，已知有LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、 LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E, MER48、MLT2CB 等亞家族。另外，反轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)座子來源的LTR被分類成ERV、ERVK, ERVL的各種類，具體而言，可以舉出LTR8A、LTR28、 MER21B、MER83、MER31B、MER49、MER66B、HERVH, ERVL, LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、 MLT2A1、MLT2E、MER11C、MERllC等亞家族。進而，MaLRs是指與典型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子一樣 在其序列的兩端含有LTR但夾在LTR之間的內(nèi)部序列是非來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的序列的DNA因子。例如可以舉出 MLT1A1、MLT1A2、MLTIB, MLT1C、MLTID, MLT1F、MLT1G、MLT1H、MLT1J、 MLT1K、MLTlI、MLT2CB、MSTA、MSTA-int、MSTB、THE1A、THE IB, THElB-internal、THEl 等亞家族。散在重復序列的特征在于，相同序列不相鄰而是散在，認為來源于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 子。另外，散在重復序列根據(jù)其長度被分類成SINE(Short Interspersed Repetitive Element 短鏈散在重復序列)和LINE (Long Interspersed Elements 長鏈散在重復序 列)。SINE當中大部分是屬于Alu家族的序列。作為特征，具有7SL RNA的3’側(cè)的序列或5’ 側(cè)的序列，且具有夾在稱為左單體(Left-monomer)和右單體(Right-monomer)的區(qū)域之間 AT-Rich 區(qū)域。作為 Alu 家族的亞家族，可以舉出 Alu、AluJb、AluJo、Ali^c、AluSg、AluSp、 AluSq、Alu&uAluY，進而可以舉出 FAM (Fossil Alu Monomer)、具有 FAM 序列的 FLAM (Free Left Alu Monomer)禾口 FRAM(Free Right Alu Monomer)。作為 Alu 家族以夕卜的 SINE,已 知有MIR、及Ther/iOR3，作為亞家族，已知有MR、MIR3。除此之外，作為其他生物種的Alu 家族的亞家族，已知有Bi、B2、B4、PBU PBlD等。作為LINE，報告有LINEl Line23的亞 家族，但已知LINE-1、LINE2、LINE3廣泛存在于基因組。需要說明的是，關(guān)于LINE-1，例如 已知有 L1M1、L1M2、L1M3、LlM3d、L1M4、LlM4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、LlMBU LlMBU L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、LIMCa、LlMCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、LlMC4a、L1MC5、 LIMDa, LIME、LlMEc, LlMEcU LIMEg、LlMEl、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、LlME4a、L1PB3、 L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、 L1PB1、L1PB3、L1PB4、L1PREC2、HAL1 的亞家族，作為 LINE-2，已知有 L2、L2c 的亞家族。需 要說明的是，例如，對于Alu家族或Alu的亞家族共同的序列、LINE-I家族或LINE-I的亞 家族共同的序列，只要能夠設(shè)定后述的特定粘附序列及檢測用粘附序列，一個基因組中可 以設(shè)定多個檢測對象，所以可以使基因組的檢測的靈敏度更高。作為目標DNA區(qū)域，具體而言，例如可以舉出LINE-I的部分序列(序列編號觀、序 列編號62、或序列編號63所示的堿基序列)、Alu的部分序列(序列編號64所示的堿基序 列)或與它們示出同源性的堿基序列等。例如在想要對某區(qū)域中的重復序列進行調(diào)查時，難以在PubMed等通常的序 列檢索的數(shù)據(jù)庫中進行檢索，使用R印base (http //www. girinst. org/repbase/)、 RepeatMasker (http //www. repeatmasker. org/)等數(shù)據(jù)庫即可。只要能夠設(shè)定本發(fā)明方法 的特定粘附序列，就可以提高檢測靈敏度。進而，對這些重復序列進行測定，例如可以作為 血液中的游離DNA量的替代標志進行處理，在注意到生物種特異性的重復序列的情況下， 可以用于生物種的確定等。在本發(fā)明方法中，只要對重復序列進行測定，就可以同時測定一個基因組中存在 多個的堿基序列。例如與序列編號觀所示的堿基序列具有80%以上的序列同源性的堿基 序列在人基因組中有約280拷貝；與序列編號64所示的堿基序列具有80%以上的同源性 的堿基序列在人基因組中有約820拷貝。因此，只要可以在各堿基序列中設(shè)定特定粘附序 列，那么與在1個基因組中僅對一種序列設(shè)定特定粘附序列的情況相比，理論上可以將1個 基因組的檢測靈敏度提高280 820倍。重復基因是指通過基因重復使基因組中的特定基因或基因片段加倍而產(chǎn)生的基 因或基因片段?；蛑貜褪侵负谢虻腄NA的某區(qū)域重復的現(xiàn)象。作為發(fā)生基因重復的原因，有基因重組的異常、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移、染色體全體的重復等。例如是指1個基因 被復制而插入到基因組DNA，有向不同的染色體位置插入的情況和向原始基因的附近插入 的情況。通過向原始基因附近的插入，將被拷貝的基因排列的場所稱為串聯(lián)重復，將通過基 因重復作成的基因的組稱為基因族(或基因家族)。假基因是指具有DNA的序列當中假設(shè)已對基因產(chǎn)物(特別是蛋白質(zhì))進行編碼之 類的特征性的堿基序列但當前功能喪失的基因。認為會有具有原始功能的序列發(fā)生了突 變的結(jié)果。例如，有通過突變而產(chǎn)生終止密碼子從而蛋白質(zhì)的肽鏈縮短而不能發(fā)揮作為蛋 白質(zhì)的功能的情況、通過一個堿基置換等突變使正常轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)序列喪失功能的情況 等。假基因多是原始正?；蚍珠_殘留的情況，也有單獨成為假基因。假基因可以根據(jù)基因序列的特征分成3類。有插入到通過反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄 酶從mRNA作成的DNA基因組的情況(加工型假基因)、在基因組內(nèi)原始基因序列發(fā)生重復 且其拷貝當中的一部分因突變等而功能喪失成為假基因的情況(重復假基因或非加工型 假基因)、及基因組內(nèi)的基因會因(沒有重復基因而是單基因情況)喪失功能而成為假基因 的情況。當前，在作為假基因而被周知的基因中，作為被轉(zhuǎn)錄的例子、具有基因功能的例子 (是否應被稱為假基因尚未確定)被周知，本發(fā)明方法中的“假基因”，并非指基因功能的有 無或是否可以轉(zhuǎn)錄，而是指上述的“加工型假基因”和“重復假基因(非加工型假基因)”。在本發(fā)明方法的第一工序中，優(yōu)選通過存在高濃度鈉鹽的體系從標本提取DNA。具 體而言，作為用于在本發(fā)明方法的第一工序中從標本中獲得DNA的DNA提取操作所使用的 溶液(例如緩沖液)中的鈉鹽濃度，至少為50mM以上，優(yōu)選為IOOmM以上。更具體而言，為 50mM以上IOOOmM以下，優(yōu)選IOOmM以上IOOOmM以下，更優(yōu)選IOOmM以上200mM以下。另 外，只要是含有鈉離子的鹽，可以是含有NaCl、NaC03、Na2SO4等的任意鹽，優(yōu)選指NaCl。本發(fā)明是選出癌癥患者來源的標本的方法，包括如下的工序通過發(fā)明1 13中 任意發(fā)明記載的方法對被檢者來源的標本進行定量或檢測得到的DNA的定量結(jié)果或檢測 結(jié)果、與利用相同方法對健康者來源的標本進行定量或檢測得到的DNA的定量結(jié)果或檢測 結(jié)果之間的差異如有顯著性意義，則將被檢者來源的標本作為癌癥患者來源的標本進行評 價，根據(jù)該評價的結(jié)果來鑒定癌癥患者來源的標本的工序。作為該發(fā)明的優(yōu)選實施方式，可 以舉出標本是哺乳動物來源的血清的發(fā)明，另外還可以舉出，具有目標DNA區(qū)域的DNA是哺 乳動物來源的血清中的具有目標DNA區(qū)域的游離DNA的發(fā)明。只要利用這些發(fā)明，就可以 通過血液檢查簡單確定癌癥患者。在這里，“癌癥患者”是指癌癥發(fā)病的被檢者，作為癌，包括肺癌(非小細胞肺癌、小 細胞肺癌)、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌(肝細胞癌、膽管細胞癌)、膽 囊癌、膽管癌、胰癌、結(jié)腸癌、肛門癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌、前列 腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、上頌竇癌、舌癌、(鼻、口、下)咽癌、 喉癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、惡性 淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征、甲狀腺癌、腦癌、骨肉瘤、皮膚癌(基底細胞癌、鱗狀上皮細 胞癌)等在人及哺乳類的臟器發(fā)生的實體癌和在人及哺乳類的血液發(fā)病的非實體癌的任 意癌。實施例
以下通過實施例詳細說明本發(fā)明，本發(fā)明不限于這些。實施例1以從Clontech公司購入的人血液來源基因組DNA為模板，使用序列編號17所示 的寡核苷酸引物PFl及序列編號18所示的寡核苷酸引物rai，以下的反應條件下進行PCR， 由此使序列編號19所示的DNA片段X(與基因庫檢索號No. NT_029419所示的堿基編號 25687390-25687775相當?shù)膮^(qū)域)擴增。<為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物>PFl :5，-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3，(序列編號 17)PRl :5，-CTGGCCAAACTGGAGATCGC-3，(序列編號 18)<DNA 片段〉X 5'-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCA GGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCAC CTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGC GTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCT CCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 19)混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M的上述引物溶液各3 μ 1、each 2mM dNTP 5μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8. 3、500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、 耐熱性DNA聚合酶(AmpliTaq Gold) 5U/μ 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為 50μ 1而制備了反應液。在如下的反應條件下進行PCR，即，將該反應液在95°C下保溫10分 鐘之后，將以在95°C下30秒鐘接著在61°C下30秒鐘進而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán)的 保溫進行40個循環(huán)的條件。將PCR反應液提供給2%瓊脂糖凝膠電泳，對擴增后的DNA進行確認，將其通過 Wizard SV Gel/PCR Kit(PR0MEGA 公司)精制，由此得到了 DNA 片段 X。關(guān)于DNA片段X，以下的溶液分別制備了雙份。
溶液A =DNA片段X 10ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液B =DNA片段X lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C =DNA片段X 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer 2 (NEB 公司制)5μ 1、3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液 量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。合成含有可以與含有序列編號19所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段X的正鏈互補性結(jié)合的、序列編號20所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Bi，制備了 0. 02 μ M TE緩沖溶液。<5’末端生物素標記寡核苷酸>Bl :5，-CTGGCCAAACTGGAGAT-3，(序列編號 20)向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0.05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號20所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Bl互補性結(jié)合的、序列編號21所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ1，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。<掩蔽寡核苷酸>Ml :5，-ATCTCCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 21)向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 上述的掩蔽寡核苷酸溶液ι μ l，室溫下放置ι小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗緩 沖液[含有 0.05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20U54mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 05μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以 150 μ L 的比例將促進溶液(Enhancement Solution) Perkin Elmer 公司制)添 加到各孔中，室溫下攪拌5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測 定熒光，對得到的測定值算出雙份的平均值。結(jié)果示于圖1中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸 進行高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。實施例2
以從Clontech公司購入的人血液來源基因組DNA為模板，使用以下的序列編號22 所示的寡核苷酸引物PF2及序列編號23所示的寡核苷酸引物ra2，在以下的反應條件下進 行PCR，由此使序列編號M所示的DNA片段Y (與基因庫檢索號No. ac009800所示的堿基編 號76606-76726相當?shù)膮^(qū)域)擴增。<為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物>PF2 5' -TGAGCTCCGTAGGGCGTCC-3‘(序列編號 2 PR2 :5，-GCGCCGGGTCCGGGCCC-3，(序列編號 23)<DNA 片段〉Y 5'-GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGA GGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3，(序列編號 24)作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。在如下的反應條件下 進行PCR，即，將該反應液在95°C下保溫10分鐘之后，將以在95°C下30秒鐘接著在60°C下 30秒鐘進而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán)的保溫進行50個循環(huán)的條件。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段Y進行了精制。關(guān)于DNA片段Y，以下的溶液分別制備了雙份。
溶液A =DNA片段Y 10ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液B =DNA片段Y lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C =DNA片段Y 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20 μ LJssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer 2 (NEB 公司制)5μ 1、3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液 量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。合成含有可以與含有序列編號M所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段Y的正鏈互補 性結(jié)合的、序列編號25所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B2，制備了 0. 02 μ M TE緩沖溶液。<5’末端生物素標記寡核苷酸>Β2 :5，-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3，(序列編號 25)對得到的各反應液實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號25所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β2互補性結(jié)合的、序列編號沈所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ2，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。<掩蔽寡核苷酸>Μ2 :5，-CCGAGAACGAGGCGTTGTCT-3，(序列編號 26)向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 05μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖2中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸進行高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。實施例3以從Clontech公司購入的人血液來源基因組DNA為模板，使用序列編號17所 示的寡核苷酸引物PFI及序列編號18所示的寡核苷酸引物rai，在以下的反應條件下進 行PCR，使序列編號19所示的DNA片段X (與基因庫檢索號No. NT_029419所示的堿基編號 25687390-25687775相當?shù)膮^(qū)域)擴增。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。在如下的反應條件下 進行PCR，即，將該反應液在95°C下保溫10分鐘之后，將以在95°C下30秒鐘接著在61°C下30秒鐘進而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán)的保溫進行40個循環(huán)的條件。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段X進行了精制。另外，以從Clontech公司購入的人血液來源基因組DNA為模板，使用以下的序列 編號22所示的寡核苷酸引物PF2及序列編號23所示的寡核苷酸引物冊2，在以下的反應條 件下進行PCR，使序列編號24所示的DNA片段Y (與基因庫檢索號No. ac009800所示的堿基 編號76606-76726相當?shù)膮^(qū)域)擴增。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。在如下的反應條件下 進行PCR，即，將該反應液在95°C下保溫10分鐘之后，將以在95°C下30秒鐘接著在60°C下 30秒鐘進而在72°C下45秒鐘為1個循環(huán)的保溫進行50個循環(huán)的條件。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段Y進行了精制。對于各DNA片段X及DNA片段Y，制備以下的溶液。溶液A =DNA片段X或DNA片段Y 10ng/10 μ L TE緩沖溶液溶液B =DNA片段X或DNA片段Y lng/10 μ L TE緩沖溶液溶液C =DNA片段X或DNA片段Y 0. lng/10 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)等量混合上述的DNA片段X的溶液A及DNA片段Y的溶液A而制備了 DNA片段混 合溶液ΜΑ，等量混合DNA片段X的溶液B及DNA片段Y的溶液B而制備了 DNA片段混合溶 液ΜΒ，等量混合DNA片段X的溶液C及DNA片段Y的溶液C而制備了 DNA片段混合溶液MC， 等量混合DNA片段X的溶液D及DNA片段Y的溶液D而制備了 DNA片段混合溶液MD。制備 了三套DNA片段混合溶液MA、MB、MC及MD各兩份。混合得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。另外，制備了具有可以與含有序列編號19所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段X的正 鏈互補性結(jié)合的、序列編號20所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Bl及具有可 以與含有序列編號24所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段Y的正鏈互補性結(jié)合的、序列編號25 所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B2的0.02 μ M TE緩沖溶液。另外，制備了 等量混合有具有序列編號20所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Bl及具有序列 編號25所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β2的TE緩沖溶液(各0. 02 μ Μ)。關(guān)于上述的DNA片段溶液MA MD的各反應液，分別使用上述的各5，末端生物素 標記寡核苷酸溶液，實施了以下的處理。 向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量 為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0.05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號20所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Bl互補性結(jié)合的、序列編號21所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Ml及含有可以與含有序列 編號25所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β2互補性結(jié)合的、序列編號26所 示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ2，分別制備了 0. ΙμΜ TE緩沖溶液。另外，制備了等量混合 含有可以與含有序列編號20所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Bl互補性結(jié) 合的、序列編號21所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Ml及含有可以與含有序列編號25所示 的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β2互補性結(jié)合的、序列編號26所示的堿基序列 的掩蔽寡核苷酸Μ2的TE緩沖溶液(各0. 1 μ Μ)。關(guān)于上述的DNA片段溶液MA MD的各反應液，使用上述的各掩蔽寡核苷酸溶液， 實施了以下的處理。關(guān)于添加的掩蔽寡核苷酸溶液，對于5’末端生物素標記寡核苷酸Bl 處理溶液為掩蔽寡核苷酸Ml溶液，對于5’末端生物素標記寡核苷酸Β2處理溶液為掩蔽寡 核苷酸Μ2溶液，對于5’末端生物素標記寡核苷酸Bl及5’末端生物素標記寡核苷酸Β2混 合處理溶液為掩蔽寡核苷酸Ml及掩蔽寡核苷酸Μ2混合溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0.05% Tween2O 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20U54mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[PerkinElmer公 司制、含 0. 05μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖3 圖5中?？芍狣NA片段通過甲基胞嘧啶抗體與固定后的5’末 端生物素標記寡核苷酸Bl (圖3)、固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸B2(圖4)、及將上 述2種混合后得到的5’末端生物素標記寡核苷酸(圖5)形成復合體，而被選擇，進行了高 靈敏度的定量·檢測。特別是在混合了 2種5’末端生物素標記寡核苷酸混合的情況(圖 5)下，與單獨用寡核苷酸進行檢測(圖3及圖4)相比，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成·選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行 定量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。進而通過使用多個固定后的5’末端生 物素標記寡核苷酸，與使用1種固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸的的情況相比(即， 通過不僅使用1個目標DNA區(qū)域，同時還使用多個目標DNA區(qū)域)，能夠進行高靈敏度的定 量·檢測。實施例4 混合從Clontech公司購入的人血液來源基因組DNA 7yg、限制酶AluI 48U、和最 適于 AluI 的 IOx 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、500mM NaCl)40y 1,向其中添加滅菌超純水，使液量為400 μ 1而制備了反應液。將該反應液在 37°C下孵育4小時。在進行了酶處理之后，通過1. 5%瓊脂糖凝膠電泳對剪切進行確認，通 過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對酶處理基因組DNA進行了精制。使用得到的酶處理基因組DNA，將以下的溶液分別制備了雙份。溶液A 酶處理基因組DNA 1000ng/30 μ L TE緩沖溶液溶液B 酶處理基因組DNA 500ng/30 μ L TE緩沖溶液溶液C 酶處理基因組DNA 200ng/30 μ L TE緩沖溶液溶液D :ΤΕ緩沖溶液(陰性對照液)混合上述中制備的酶處理基因組DNA溶液30yL、SssI甲基化酶(NEB公司 制)0. 5 μ 1、IOxNEBuf fer2 (NEB公司制)5 μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司 制)0. 5μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C 下孵育30分鐘。制備了具有可以與含有序列編號27所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段X’的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號20所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Bl的0.02 μ M TE 緩沖溶液?！春心繕薉NA區(qū)域的DNA片段〉X， 5，-CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCA GGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCAC CTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGC GTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCT CCAGTTTGGCCAG-3，(序列編號 2了)<5’末端生物素標記寡核苷酸>Bl :5，-CTGGCCAAACTGGAGAT-3，(序列編號 20)關(guān)于上述的酶處理基因組DNA溶液A D的各反應液，實施了以下的處理。
向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。

將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0.05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號20所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Bl互補性結(jié)合的、序列編號21所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ1，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 05μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖6中?？芍诿柑幚砗蟮娜嘶蚪MDNA溶液中，DNA片段通過甲基 胞嘧啶抗體與固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸Bl形成復合體，而被選擇，進行了高靈 敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行基因組DNA的定量·檢測。實施例5使用從Clontech公司購入的人血液來源基因組DNA，將以下的溶液分別制備了雙 份。溶液A 人血液來源基因組DNA 500ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液B 人血液來源基因組DNA 50ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C 人血液來源基因組DNA 5ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)
混合得到的各溶液20yL、限制酶XspIlOU、和最適于XspI的IOx緩沖液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1，向其中添加滅菌超純 水，使液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育1小時。混合上述中制備的酶處理基因組DNA溶液20yL、SssI甲基化酶(NEB公司 制)0. 5 μ 1、IOxNEBuf fer2 (NEB公司制)5 μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司 制)0. 5μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C 下孵育30分鐘。制備了具有可以與含有序列編號28所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段Z (與基因庫 檢索號No. M80340等所示的堿基編號115-386相當?shù)膮^(qū)域)的正鏈互補性結(jié)合的、序列編 號29所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B3的0. 02 μ M TE緩沖溶液。<DNA 片段〉Z :5， _TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAG GCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACC TGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATA TCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3，(序列編號 28)<5’末端生物素標記寡核苷酸>B3 :5，-ATAGTCTCGTGGTGCGCCGT-3，(序列編號 29)上述的酶處理基因組DNA溶液A D的各反應液，實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號29所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β3互補性結(jié)合的、序列編號30所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ3，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。<掩蔽寡核苷酸>Μ3 :5，-ACGGCGCACCACGAGACTAT-3，(序列編號 30)向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 05μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖7中?？芍诿柑幚淼娜嘶蚪MDNA溶液中，DNA片段通過甲基胞 嘧啶抗體與固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸B3形成復合體，而被選擇，進行了高靈敏 度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行基因組DNA的定量·檢測。實施例6使用從Clontech公司購入的人血液來源基因組DNA，制備了以下的溶液。溶液A 人血液來源基因組DNA 500ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液B 人血液來源基因組DNA 50ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C 人血液來源基因組DNA 5ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20yL、限制酶XspIlOU、和最適于XspI的IOx緩沖液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1，向其中添加滅菌超純 水，使液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育1小時?；旌仙鲜鲋兄苽涞拿柑幚砘蚪MDNA溶液20yL、SssI甲基化酶(NEB公司 制)0. 5 μ 1、IOxNEBuf fer2 (NEB公司制)5 μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司 制)0. 5μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C 下孵育30分鐘。制備了具有可以與含有序列編號28所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段Z (與基因庫 檢索號No. M80340等所示的堿基編號115-386相當?shù)膮^(qū)域)的正鏈互補性結(jié)合的、序列編 號29所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B3的0. 02 μ M TE緩沖溶液。制備了含有可以與含有序列編號28所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段Z的負鏈(互 補鏈)互補性結(jié)合的、序列編號31、序列編號32、序列編號33、序列編號34、及序列編號35 所示的堿基序列的反向寡核苷酸Cl、C2、C3、C4、及C5的濃度分別為0. 01 μ M的TE緩沖溶 液。<DNA 片段〉Z :5， _
TAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAG GCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCTGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGTCGCACC TGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATA TCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGC-3，(序列編號 28)〈反向寡核苷酸〉Cl:5，-CAGTGTGTGTGCGCACCGTGCGCGAGCCGA--3，(序列編號31)
C2:5，-GGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCGCA--3，(序列編號32)
C3:5，-GGTGACGGTCGCACCTGGAAAATCGGGTCA--3，(序列編號33)
C4:5，-ACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT--3，(序列編號34)
C5:5，-TCGGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGC--3，(序列編號35)關(guān)于上述的酶處理基因組DNA溶液A D的各反應液，實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ LjP lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將本PCR 管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并 保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核 苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號29所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β3互補性結(jié)合的、序列編號30所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ3，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 05μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖8中?？芍诿柑幚淼娜嘶蚪MDNA溶液中，DNA片段通過甲基胞 嘧啶抗體與固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸B3形成復合體，而被選擇，進行了高靈敏 度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行基因組DNA的定量·檢測。實施例7用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A，直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCl (pH 8. 0)飽 和]/氯仿提取處理?；厥账畬樱蚱渲刑砑覰aCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號36及序列編號37所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊3)及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA擴增用作檢測樣品的DNA片段 (S、序列編號38、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當?shù)膮^(qū)域)。<為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物>PF3 5' -AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3‘(序列編號 36)PR3 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 37)<DNA 片段〉S :5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACG ATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGC GCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGC GTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 38)作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段S進行了精制。關(guān)于DNA片段S，以下的溶液分別制備了雙份。溶液A 10ng/20 μ L TE 緩沖溶液溶液B lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C 0. lng/20 μ L TE 緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B4的0. 02 μ M TE 緩沖溶液。<5’末端生物素標記寡核苷酸>B 4 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 39)對得到的各反應液實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β4互補性結(jié)合的、序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖溶液?！囱诒喂押塑账帷礛4 :5，-ACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 40)向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖9中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸被高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。實施例8用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。
使用以下的序列編號41及序列編號42所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF4 及PR4)及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片段 (T、序列編號43、與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號 384523-384766相當?shù)膮^(qū)域)擴增。<為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物>PF4 :5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3，(序列編號 41)PR4 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 42)<DNA 片段〉T :5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGAT ATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3'(序列編號 43)作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段T進行了精制。關(guān)于DNA片段T，以下的溶液分別制備了雙份。溶液A =DNA片段T 10ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液B =DNA片段T lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C =DNA片段T 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號43所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B5的0. 02 μ M TE 緩沖溶液。<5’末端生物素標記寡核苷酸>B 5 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 44)對得到的各反應液實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β5互補性結(jié)合的、序列編號45所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ5，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。<掩蔽寡核苷酸>Μ5 :5，-CGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 45)向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖10中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸被高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。實施例9用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號36及序列編號37所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊3)及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片段 (S、序列編號38、與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段S進行精制。另外，使用以下的序列編號41及序列編號42所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物 (PF4及PR4)及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片 段(T、序列編號43、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號 384523-384766相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段T進行了精制。關(guān)于DNA片段S及DNA片段T，分別制備了以下的溶液。溶液A =DNA片段S或DNA片段T 10ng/10 μ L TE緩沖溶液溶液B =DNA片段S或DNA片段T lng/10 μ L TE緩沖溶液溶液C =DNA片段S或DNA片段T 0. lng/10 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)等量混合上述的DNA片段S的溶液A及DNA片段T的溶液A而制備了 DNA片段混 合溶液ΜΑ，等量混合DNA片段S的溶液B及DNA片段T的溶液B而制備了 DNA片段混合溶液MB，等量混合DNA片段S的溶液C及DNA片段T的溶液C而制備了 DNA片段混合溶液MC， 等量混合DNA片段S的溶液D及DNA片段T的溶液D而制備了 DNA片段混合溶液MD。制備 了三套DNA片段混合溶液MA、MB、MC及MD各兩份?；旌系玫降母魅芤?0 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與序列編號38所示的DNA片段S互補性結(jié)合的、序列編號39所示 的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B4及含有可以與序列編號43所示的DNA片段T 互補性結(jié)合的、序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B5的0. 02 μ M TE緩沖溶液。另外，制備了等量混合有含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素 標記寡核苷酸Β4及含有序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β5的 TE緩沖溶液(各0. 02 μ Μ)即生物素標記寡核苷酸溶液。關(guān)于上述的DNA片段混合溶液MA MD的各反應液，實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β4互補性結(jié)合的、序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4及含有可以與含有序列 編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β5互補性結(jié)合的、序列編號45所 示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ5，分別制備了 0. ΙμΜ TE緩沖溶液。另外，制備了等量混合 有含有序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4及含有序列編號45所示的堿基序 列的掩蔽寡核苷酸Μ5的TE緩沖溶液(各0. 1 μ Μ)。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。
以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖11 圖13中。DNA片段通過甲基胞嘧啶抗體與固定后的5’末端生 物素標記寡核苷酸B4(圖11)、固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸B5(圖12)、及混合上 述2種得到的5’末端生物素標記寡核苷酸(圖13)形成復合體，而被選擇，進行了高靈敏 度的定量 檢測。特別是在混合2種5’末端生物素標記寡核苷酸混合的情況(圖13)下， 與單獨用寡核苷酸進行檢測(圖11及圖12)相比，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。進而通過使用多個固定后的5’末端生物 素標記寡核苷酸，與使用1種固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸的情況相比(S卩，通過不 僅使用1個目標DNA區(qū)域，同時還使用多個目標DNA區(qū)域)，能夠進行高靈敏度的定量·檢 測。實施例10用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，在30°C下邊攪拌邊孵育1小時直 至溶液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B (50mM Tris-HCl.pH 7.4、20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育 30分鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離 心30分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙 醇，充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并 進行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液 添加蛋白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為1% (w/v), 在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理。回收水層，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。關(guān)于得到的酵母基因組DNA，制備了以下的溶液。溶液A 酵母基因組DNA 100ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液B 酵母基因組DNA 10ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C 酵母基因組DNA lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20yL、限制酶XspIlOU、和最適于XspI的IOx緩沖液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育1小時?；旌系玫降母魅芤?0 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號46所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S，的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B4的0. 02 μ M TE 緩沖溶液。<DNA 片段〉S' 5'-TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTAC GATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGG CGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATA GCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGG CGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC-3，(序列編號 46)<5’末端生物素標記寡核苷酸〉B4 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 39)關(guān)于上述的酵母基因組DNA溶液A D的各反應液，實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L、lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超 純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷卻至 70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10 分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β4互補性結(jié)合的、序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4，分別制備了 0. 1 μ M TE 緩沖溶液。<5’末端生物素標記寡核苷酸>Β4 :5，-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3，(序列編號 39)〈掩蔽寡核苷酸〉Μ4 :5，-ACCGTACGTGAGCACATGTCT-3，(序列編號 40)向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖14中?？芍诮湍富蚪MDNA溶液中，DNA片段通過甲基胞嘧啶抗 體與固定后的5 ’末端生物素標記寡核苷酸B4形成復合體，而被選擇，進行了高靈敏度的定 量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行基因組DNA的定量·檢測。實施例11用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母酵 母株X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。 使用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵 母基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3C00K，進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3C00Na和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理。回收水層，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。關(guān)于得到的酵母基因組DNA，制備了以下的溶液。溶液A 酵母基因組DNA 100ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液B 酵母基因組DNA 10ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C 酵母基因組DNA lng/20 μ L TE緩沖溶液
溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20yL、限制酶XspIlOU、和最適于XspI的IOx緩沖液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1，向其中添加滅菌超純 水，使液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育1小時?；旌系玫降母魅芤?0 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了具有可以與含有序列編號47所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T，的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B5的0. 02 μ M TE 緩沖溶液。<DNA 片段〉T， 5，-TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAA CACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGA GAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGA ACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC-3，(序列編號 47)<5’末端生物素標記寡核苷酸>B5 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 44)關(guān)于上述的酵母基因組DNA溶液A D的各反應液，實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β5互補性結(jié)合的、序列編號45所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ5，分別制備了 0. 1 μ M TE 緩沖溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖15中?？芍诮湍富蚪MDNA溶液中，DNA片段通過甲基胞嘧啶抗 體與固定后的5 ’末端生物素標記寡核苷酸B5形成復合體，而被選擇，進行了高靈敏度的定 量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行基因組DNA的定量·檢測。實施例12用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇， 充分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進 行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl, pH 8. OUmM EDTA)， 添加RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添 加蛋白酶K (Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，之后 在55°C下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8. 0)飽和]/氯仿提取處理?；厥账畬樱蚱渲刑砑覰aCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙 醇沉淀處理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用以下的序列編號36及序列編號37所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3 及冊3)及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片段 (S、序列編號38、與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號 271743-272083相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段S進行了精制。關(guān)于DNA片段S，添加了從Clontech公司購入的人血液基因組DNA的以下的溶液， 分別制備了雙份。溶液A =DNA片段S 10ng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液B =DNA片段S lng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液C =DNA片段S 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)混合得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。合成含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的正鏈互補 性結(jié)合的、序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B4，制備了 0. 02 μ M TE緩沖溶液。對得到的各反應液實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β4互補性結(jié)合的、序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖16中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸被高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行人基因組DNA中的酵母來源DNA片段的定量·檢測。實施例13用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用序列編號41及序列編號42所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF4及PR4) 及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA擴增用作檢測樣品的DNA片段(T、序列編 號43、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號384523-384766 相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán)的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段T進行了精制。關(guān)于DNA片段T，將添加有從Clontech公司購入的人血液基因組DNA的以下的溶 液分別制備了雙份。溶液A =DNA片段T 10ng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液B =DNA片段T lng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液C =DNA片段T 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0· 5μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB公 司制)5μ1、3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量 為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備含有可以與含有序列編號43所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T的正鏈互補 性結(jié)合的、序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B5的0.02 μ M TE 緩沖溶液。<5’末端生物素標記寡核苷酸〉Β5 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 44)對得到的各反應液實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β5互補性結(jié)合的、序列編號45所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ5，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaClPH7.4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L 將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖17中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸被高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行人基因組DNA中的酵母來源DNA片段的定量·檢測。實施例14用YPD培地(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母酵母 株X2180-1A,直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。 使用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵 母基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用序列編號36及序列編號37所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3及冊3) 及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片段(S、序列編 號38、與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號271743-272083 相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。
在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段S進行了精制。另外，使用序列編號41及序列編號42所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF4 及PR4)及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片段 (T、序列編號43、與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號 384523-384766相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段T進行了精制。關(guān)于DNA片段S及DNA片段T，制備了添加有從Clontech公司購入的人血液基因 組DNA的以下的溶液。溶液A =DNA片段S或DNA片段T 10ng/10 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液 基因組DNA)溶液B =DNA片段S或DNA片段T lng/10 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液 基因組DNA)溶液C =DNA片段S或DNA片段T 0. lng/10 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血 液基因組DNA)溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)等量混合上述的DNA片段S的溶液A及DNA片段T的溶液A而制備了 DNA片段混 合溶液ΜΑ，等量混合DNA片段S的溶液B及DNA片段T的溶液B而制備了 DNA片段混合溶 液ΜΒ，等量混合DNA片段S的溶液C及DNA片段T的溶液C而制備了 DNA片段混合溶液MC， 等量混合DNA片段S的溶液D及DNA片段T的溶液D而制備了 DNA片段混合溶液MD。制備 了三套DNA片段混合溶液MA、MB、MC及MD各兩份?；旌系玫降母魅芤?0 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的正鏈互補 性結(jié)合的、序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B4及含有可以與含 有序列編號43所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T的正鏈互補性結(jié)合的、序列編號44所示 的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B5的0.02 μ M TE緩沖溶液。另外，制備了等量 混合含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β4及含有序列編號 44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β5得到的TE緩沖溶液(各0. 02 μ Μ)。關(guān)于上述的DNA片段混合溶液MA MD的各反應液，實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸溶液 10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖 醇)10 μ LUOOmM MgCl2溶液10 μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅 菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保 溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形 成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0.05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β4互補性結(jié)合的、序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4及含有可以與含有序列 編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β5互補性結(jié)合的、序列編號45所 示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ5，分別制備了 0. ΙμΜ TE緩沖溶液。另外，制備了等量混合 有含有序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4及含有序列編號45所示的堿基序 列的掩蔽寡核苷酸Μ5的TE緩沖溶液(各0. 1 μ Μ)。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 上述的掩蔽寡核苷酸溶液ι μ L,室溫下放置ι小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖18 圖20中?？芍狣NA片段通過甲基胞嘧啶抗體與固定后的5’末 端生物素標記寡核苷酸B4(圖18)、固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸B5(圖19)、及混 合上述2種而成的5’末端生物素標記寡核苷酸(圖20)形成復合體，而被選擇，進行了高 靈敏度的定量·檢測。特別是在混合了 2種5’末端生物素標記寡核苷酸混合的情況(圖 20)下，與單獨用寡核苷酸進行檢測(圖18及圖19)相比，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成·選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的 5’末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行 定量·檢測，由此可以進行人基因組DNA中的酵母來源DNA片段的定量·檢測。進而通過 使用多個固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸，與使用1種固定后的5’末端生物素標記 寡核苷酸的的情況相比(即，通過不僅使用1個目標DNA區(qū)域，同時還使用多個目標DNA區(qū) 域)，能夠進行高靈敏度的定量·檢測。
實施例15用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理。回收水層，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用序列編號36及序列編號37所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3及冊3) 及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片段(S、序列編 號38、與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號271743-272083 相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段S進行了精制。關(guān)于DNA片段S，制備了以下的溶液。溶液A =DNA片段S 10ng/20 μ L TE緩沖溶液溶液B =DNA片段S lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C =DNA片段S 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的正鏈互補性結(jié)合的、序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B4的0. 02 μ M TE 緩沖溶液。另外，合成含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的負鏈 互補性結(jié)合的、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52、序列編號 53、序列編號54、序列編號55、及序列編號56所示的堿基序列的反向寡核苷酸C6、C7、C8、 C9、CIO、Cll、C12、C13、及C14，制備了各自的濃度為0.01 μ M的TE緩沖溶液?！捶聪蚬押塑账帷礐6 :5，-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3，(序列編號 48)C7 :5，-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3，(序列編號 49)C8 :5，-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3，(序列編號 50)C9 :5，-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3，(序列編號 51)ClO :5，-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3，(序列編號 52)Cll :5，-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3，(序列編號 53)C12 :5，-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3，(序列編號 54)C13 :5，-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3，(序列編號 55)C14 :5，-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3，(序列編號 56)對得到的各反應液實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ LjP lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR 管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并 保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核 苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0.05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β4互補性結(jié)合的、序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖21中。可知DNA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸被高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。實施例16用YPD培地(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母酵母 株X2180-1A,直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。 使用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵 母基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理?；厥账畬樱蚱渲刑砑覰aCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用序列編號41及序列編號42所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF4及PR4) 及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA擴增用作檢測樣品的DNA片段(T、序列編 號43、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號384523-384766 相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SVGel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段T進行了精制。關(guān)于DNA片段T，以下的溶液分別制備了雙份。溶液A =DNA片段T 10ng/20 μ L TE緩沖溶液
溶液B =DNA片段T lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液C =DNA片段T 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)混合得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號43所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B5的0. 02 μ M TE 緩沖溶液。另外，合成含有可以與含有序列編號43所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T的負鏈 互補性結(jié)合的、序列編號57、序列編號58、序列編號59、及序列編號60所示的堿基序列的反 向寡核苷酸C15、C16、C17、及C18，制備了各自的濃度為0.01 μ M的TE緩沖溶液?！捶聪蚬押塑账帷礐15 5' -GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3‘(序列編號 5了)C16 5' -AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3‘(序列編號 5幻C17 :5，-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3，(序列編號 59)C18 :5，-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3，(序列編號 60)對得到的各反應液實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mMTris-醋酸鹽PH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ LjP lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR 管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并 保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核 苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β5互補性結(jié)合的、序列編號45所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ5，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 上述的掩蔽寡核苷酸溶液ι μ L,室溫下放置ι小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaClρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖22中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸被高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。實施例17用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNaseA(Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCl (pH 8. 0)飽 和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用序列編號36及序列編號37所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3及冊3) 及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA擴增用作檢測樣品的DNA片段(S、序列編 號38、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號271743-272083 相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 10. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段S進行了精制。關(guān)于DNA片段S，將添加有從Clontech公司購入的人血液基因組DNA的以下的溶 液分別制備了雙份。溶液A =DNA片段S 10ng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液B =DNA片段S lng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液C =DNA片段S 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)
溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)混合得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B4的0. 02 μ M TE 緩沖溶液。另外，合成含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的負鏈 互補性結(jié)合的、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52、序列編 號53、序列編號54、序列編號55、序列編號56、及序列編號61所示的堿基序列的反向寡核 苷酸 C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、及 C19，制備了各自的濃度為 0. ΟΙμΜ 的 TE 緩 沖溶液?！捶聪蚬押塑账帷礐6 :5，-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3，(序列編號 48)C7 :5，-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3，(序列編號 49)C8 :5，-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3，(序列編號 50)C9 :5，-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3，(序列編號 51)ClO :5，-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3，(序列編號 52)Cll :5，-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3，(序列編號 53)C12 :5，-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3，(序列編號 54)C13 :5，-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3，(序列編號 55)C14 :5，-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3，(序列編號 56)C19 :5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3，(序列編號 61)對得到的各反應液實施了以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ LjP lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR 管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核 苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β4互補性結(jié)合的、序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 上述的掩蔽寡核苷酸溶液ι μ L,室溫下放置ι小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖23中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸被高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行人基因組DNA中的酵母來源DNA片段的定量·檢測。實施例18用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使 用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7.4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理。回收水層，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用序列編號41及序列編號42所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF4及PR4) 及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片段(T、序列編 號43、與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號384523-384766 相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段T進行了精制。關(guān)于DNA片段T，將添加有從Clontech公司購入的人血液基因組DNA的以下的溶 液，分別制備了雙份。溶液A =DNA片段T 10ng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液B =DNA片段T lng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液C =DNA片段T 0. lng/20 μ L TE緩沖溶液(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液)(含有5ng/ μ L人血液基因組DNA)混合得到的各溶液20 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號43所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B5的0. 02 μ M TE 緩沖溶液。另外，合成含有可以與含有序列編號43所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T的負鏈 互補性結(jié)合的、序列編號57、序列編號58、序列編號59、及序列編號60所示的堿基序列的反 向寡核苷酸C15、C16、C17、及C18，制備了各自的濃度為0.01 μ M的TE緩沖溶液?！捶聪蚬押塑账帷礐15 :5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3，(序列編號 57)C16 :5，-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3，(序列編號 58)C17 :5，-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3，(序列編號 59)C18 :5，-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3，(序列編號 60)對得到的各反應液實施了以下的處理。
向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液10 μ L、上述的反向寡核苷酸溶液10 μ L、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10 μ LjP lmg/mL BSA 溶液 10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混合。隨后，將該PCR 管在95°C下加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并 保溫10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核 苷酸和DNA片段的結(jié)合體的形成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β5互補性結(jié)合的、序列編號45所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ5，制備了 0. ΙμΜ TE緩沖 溶液。<5’末端生物素標記寡核苷酸>Β5 :5，-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3，(序列編號 44)<掩蔽寡核苷酸>Μ5 :5，-CGAGAACGCCAGATCTGTACT-3，(序列編號 45)向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后通過移液除去溶液，用清洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)] 200 μ L
將各孔清洗3次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖24中?？芍狣NA片段可以通過固定后的5’末端生物素標記寡核苷 酸被高精度選擇，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的5’ 末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定 量·檢測，由此可以進行人基因組DNA中的酵母來源DNA片段的定量·檢測。實施例19用YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖，pH 5. 6-6. 0)培養(yǎng)面包酵母株 X2180-1A直至濁度為OD600 0. 6-1. 0，以IOOOOxg離心10分鐘，制備IxlO7的酵母細胞。使用Methods in Yeast Genetics (酵母遺傳學方法)(冷泉港實驗室)中記載的常規(guī)的酵母 基因組的制備法，從所制備的酵母細胞獲得酵母基因組。使所制備的酵母細胞在緩沖液A (1M山梨醇、0. IM EDTA、pH 7. 4)中懸浮，添加 2-巰基乙醇(終濃度14mM)及100U消解酶(10mg/ml)，30°C下邊攪拌邊孵育1小時直至溶 液透明。以550xg離心10分鐘，回收原生質(zhì)體后，使其在緩沖液B(50mM Tris-HCl.pH 7.4、 20mM EDTA)中懸浮，之后添加十二烷基硫酸鈉并使其為1 % (w/v)，然后在65°C下孵育30分 鐘。接著，添加體積比2/5量的5M CH3COOK,進行混合，30分鐘冰冷后，以15000xg離心30 分鐘，回收上清。向所回收的上清中添加體積比1/10量的3M CH3COONa和等量的異丙醇，充 分混合，以15000xg在4°C下離心30分鐘得到沉淀，用70%乙醇沖洗所得到的沉淀并進行 回收。使沉淀干燥，然后溶解于Iml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCUpH 8. OUmM EDTA)，添加 RNase A (Sigma公司制)并使其為40 μ g/ml，在37°C下孵育1小時，接著，向混合液添加蛋 白酶K(Sigma公司制)使其為500 μ g/ml，添加十二烷基硫酸鈉使其為(w/v)，在55°C 下將其振蕩約16小時。在振蕩結(jié)束后，對該混合物進行苯酚[用IM Tris-HCKpH 8.0)飽 和]/氯仿提取處理?；厥账畬?，向其中添加NaCl并使其為0. 5N，然后對其進行乙醇沉淀處 理，回收所生成的沉淀。用70%乙醇沖洗所回收的沉淀，由此得到了基因組DNA。使用序列編號36及序列編號37所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物(PF3及冊3) 及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片段(S、序列編 號38、與基因庫檢索號No. NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號271743-272083 相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段S進行了精制。另外，使用以下的序列編號41及序列編號42所示的為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物 (PF4及PR4)及反應條件，進行PCR，由此從得到的基因組DNA，擴增用作檢測樣品的DNA片 段(T、序列編號43、與基因庫檢索號No.NC_001139等所示的酵母染色體VII的堿基編號 384523-384766相當?shù)膮^(qū)域)。作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的基因組DNA 10ng、5 μ M 的上述引物溶液各 3 μ 1、each 2mM dNTP 5 μ 1、10X 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8.3、 500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)5 μ 1、和耐熱性 DNA 聚合酶(AmpliTaq Gold)5U/y 1 0. 25 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ 1而得到的反應液。將該反應液在95°C下 保溫10分鐘后，在將以95°C下20秒鐘接著58°C下30秒鐘進而72°C下30秒鐘為1個循環(huán) 的保溫進行40個循環(huán)的條件下，進行PCR。在進行了 PCR之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增進行確認，通過Wizard SV Gel/PCR Kit (PR0MEGA公司)對DNA片段T進行了精制。
關(guān)于DNA片段S及DNA片段T，分別制備了以下的溶液。溶液A =DNA片段S或DNA片段T 10ng/10 μ L TE緩沖溶液溶液B =DNA片段S或DNA片段T lng/10 μ L TE緩沖溶液溶液C =DNA片段S或DNA片段T 0. lng/10 μ L TE緩沖溶液溶液D =TE緩沖溶液(陰性對照液) 等量混合上述的DNA片段S的溶液A及DNA片段T的溶液A而制備了 DNA片段混 合溶液ΜΑ，等量混合DNA片段S的溶液B及DNA片段T的溶液B而制備了 DNA片段混合溶 液ΜΒ，等量混合DNA片段S的溶液C及DNA片段T的溶液C而制備了 DNA片段混合溶液MC， 等量混合DNA片段S的溶液D及DNA片段T的溶液D而制備了 DNA片段混合溶液MD。制備 三套DNA片段混合溶液MA、MB、MC及MD各兩份?；旌系玫降母魅芤?0 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ 1,1 OxNEBuffer2 (NEB 公司制)5μ 1、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ 1，向其中添加滅菌超純水，使 液量為50 μ 1而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。制備了含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的正鏈互 補性結(jié)合的、序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B4及含有可以與 含有序列編號43所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段T的正鏈互補性結(jié)合的、序列編號44所 示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B5的0.02 μ M TE緩沖溶液。另外，制備了等 量混合有含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β4及含有序列 編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β5的TE緩沖溶液(各0. 02 μ Μ)。另外，合成含有可以與含有序列編號38所示的目標DNA區(qū)域的DNA片段S的負 鏈互補性結(jié)合的、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52、序列 編號53、序列編號54、序列編號55、序列編號56、及序列編號61所示的堿基序列的反向寡 核苷酸 C6、C7、C8、C9、CIO、Cll、C12、C13、C14、及 C19，制備了各自的濃度為 0.01 μ M 的 TE 緩沖溶液(反向寡核苷酸溶液1)。另外，合成含有可以與含有序列編號43所示的目標DNA 區(qū)域的DNA片段T的負鏈互補性結(jié)合的、序列編號57、序列編號58、序列編號59、及序列編 號60所示的堿基序列的反向寡核苷酸C15、C16、C17、及C18，制備了各自的濃度為0. 01 μ M 的TE緩沖溶液(反向寡核苷酸溶液2)。另外，關(guān)于含有序列編號48、序列編號49、序列編 號50、序列編號51、序列編號52、序列編號53、序列編號54、序列編號55、序列編號56、序列 編號57、序列編號58、序列編號59、序列編號60、及序列編號61所示的堿基序列的寡核苷 酸 C6、C7、C8、C9、CIO、Cll、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18 及 C19,制備了各自的濃度為 0. 01 μ M的TE緩沖溶液(反向寡核苷酸溶液3)?！捶聪蚬押塑账帷礐6 :5，-GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3，(序列編號 48)C7 :5，-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3，(序列編號 49)C8 :5，-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3，(序列編號 50)C9 :5，-GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3，(序列編號 51)ClO :5，-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3，(序列編號 52)Cll :5，-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT-3，(序列編號 53)C12 :5，-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3，(序列編號 54)
C13:5，-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3，(序列編號 55)
C14:5，-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3'(序列編號 56)
C15:5，-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3‘(序列編號 5了)
C16:5，-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3，(序列編號 58)
C17:5，-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3‘(序列編號 5Θ)
C18:5，-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3，(序列編號 60)
C19:5，-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3，(序列編號 61)
作為5’末端生物素標記寡核苷酸溶液和反向寡核苷酸溶液的組合，使用5’末端
生物素標記寡核苷酸B4溶液和反向寡核苷酸溶液1、5’末端生物素標記寡核苷酸B5溶液 和反向寡核苷酸溶液2、5’末端生物素標記寡核苷酸B4及5’末端生物素標記寡核苷酸B5 混合溶液和反向寡核苷酸溶液3，對上述的DNA片段混合溶液MA MD的各反應液，實施了 以下的處理。向PCR管中添加上述中制備的反應液40 μ L、上述的5’末端生物素標記寡核苷酸 溶液10yL、反向寡核苷酸溶液10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽pH 7. 9、660mM KOAc, IOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10μ L、100mM MgCl2 溶液 10 μ L、和 lmg/mL BSA 溶液 10 μ L， 進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為IOOyL,進行了混合。隨后，將該PCR管在 95°C下加熱10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C并保溫 10分鐘，進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫，促進了 5’末端生物素標記寡核苷酸 和DNA片段的結(jié)合體的形成。將得到的混合物全部移到用抗生蛋白鏈菌素被覆完的孔中，室溫下放置約30分 鐘，使上述5’末端生物素標記寡核苷酸和DNA片段的結(jié)合體固定于孔上。隨后，通過移液除 去溶液，用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。合成含有可以與含有序列編號39所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸 Β4互補性結(jié)合的、序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4及含有可以與含有序列 編號44所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸Β5互補性結(jié)合的、序列編號45所 示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ5，分別制備了 0. ΙμΜ TE緩沖溶液。另外，制備了等量混合 有含有序列編號40所示的堿基序列的掩蔽寡核苷酸Μ4及含有序列編號45所示的堿基序 列的掩蔽寡核苷酸Μ5的TE緩沖溶液(各0. 1 μ Μ)。對于用5’末端生物素標記寡核苷酸Β4溶液處理后的反應液，使用掩蔽寡核苷酸 Μ4溶液，對于用5’末端生物素標記寡核苷酸Β5溶液處理后后的反應液，使用掩蔽寡核苷 酸Μ5溶液，對于用5’末端生物素標記寡核苷酸Β4及5’末端生物素標記寡核苷酸Β5混合 溶液處理后的反應液，使用掩蔽寡核苷酸Μ4及掩蔽寡核苷酸Μ5混合溶液，實施了以下的處理。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L、 和上述的掩蔽寡核苷酸溶液1 μ L，室溫下放置1小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗 緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L對各孔清洗了 3次。
隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 25μ g/mL 0· BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4) ] 200 μ L 對各孔清洗了 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖25 圖27中。可知甲基化的DNA片段通過甲基胞嘧啶抗體與固定 后的5’末端生物素標記寡核苷酸形成復合體，而被選擇，進行了高靈敏度的定量 檢測。特 別是在混合了 2種5’末端生物素標記寡核苷酸混合的情況(圖27)下，與單獨用寡核苷酸 進行檢測(圖25及圖26)相比，進行了高靈敏度的定量·檢測。在本實驗中，可知形成·選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和固定后的 5’末端生物素標記寡核苷酸的復合體，利用其識別功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行 定量·檢測，由此可以進行DNA片段的定量·檢測。進而通過使用多個固定后的5’末端生 物素標記寡核苷酸，與使用1種固定后的5’末端生物素標記寡核苷酸的的情況相比(即， 通過不僅使用1個目標DNA區(qū)域，同時還使用多個目標DNA區(qū)域)，能夠進行高靈敏度的定 量·檢測。實施例20作為血清樣品，如下所示分別制備人血液來源基因組DNA(Human Genomic DNA, #636401、Clontech公司)的TE緩沖溶液和從大鼠(Wistar Hannover)收集的血清的混合 液各4份。血清樣品A 人血液來源基因組DNA 100ng/10 μ L TE緩沖溶液+大鼠血清10 μ L血清樣品B 人血液來源基因組DNA 10ng/10 μ L TE緩沖溶液+大鼠血清10 μ L血清樣品C :0ng/10 μ L TE緩沖溶液+大鼠血清10 μ L (陰性對照液)關(guān)于上述制備的血清樣品A C，分別進行以下的處理1或處理2各雙份。處理1 混合血清樣品2(^1^和緩沖液(5001111Tris-HCl(pH 7. 5), IOOmM MgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 4 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使其液量40 μ L，進行了混合。 隨后，將該PCR管在95°C下保溫10分鐘，在4°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫。以9100xg 離心10分鐘，然后回收上清。處理2 混合血清樣品20 μ L 和緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽(pH 7. 9)，IOOmM Mg(OAc)2, 5mM DTT, 660mM KOAc) 4 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為40 μ L，進行了混 合。隨后，將該PCR管在95°C下保溫10分鐘，在4°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫。以 9IOOxg離心10分鐘，然后回收上清?；旌贤ㄟ^上述的處理1或處理2制備的各溶液30 μ L、限制酶MspI2U、最適于MspI 的 IOx 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2、IOmM二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 5 μ L, 向其中添加滅菌超純水，使液量為50 μ L而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育1小 時。
混合通過上述的酶處理得到的溶液40 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ L、 10xNEBuffer2(NEB公司制)5μ L、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ L，向其中 添加滅菌超純水，使液量為50 μ L而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。作為用于獲得含有在作為人轉(zhuǎn)座子而周知的Alu區(qū)域設(shè)計的、序列編號66所示的 堿基序列的目標DNA區(qū)域(W、序列編號66、與基因庫檢索號No. AF458110所示的堿基編號 178-262相當?shù)膮^(qū)域)的特定寡核苷酸，合成含有與目標DNA區(qū)域W的正鏈互補性結(jié)合的、 序列編號67所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B6，制備了 0. 2pmoL/10 μ L的 TE緩沖溶液?！茨繕薉NA區(qū)域〉W5'-CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAG GAGATCGAGACCATCC-3，(序列編號 66)<5’末端生物素標記寡核苷酸>Β6 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(配列番號 67)添加在上述中得到的反應液50yL、特定寡核苷酸溶液10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7.9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶 液10 μ Ljn lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L， 進行了混合。隨后，為了使目標DNA區(qū)域和特定寡核苷酸形成雙鏈，將該PCR管在95°C下保 溫10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C，保溫10分鐘， 進而在37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫。將得到的反應液100 μ L移至抗生蛋白鏈菌素被覆完的8孔條紋(Str印taWell、 #11645692001、Roche公司)，室溫下放置約30分鐘，在8孔條紋借助生物素-抗生蛋白鏈 菌素結(jié)合將目標DNA區(qū)域和特定寡核苷酸的復合體固定化。隨后，通過傾析除去溶液，用清 洗緩沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 ·7Η20、154ι Μ NaCl pH 7. 4) ] 200 μ L將各孔清洗3次。作為用于將固定后的游離的特定寡核苷酸掩蔽的掩蔽寡核苷酸，合成含有與特定 寡核苷酸互補性結(jié)合的、序列編號68所示的堿基序列的寡核苷酸Μ，制備了 0. lpmoL/yL的 TE緩沖溶液?！囱诒喂押塑账帷礛 5，-GTCAGGAGATCGAGACCATCC-3，(序列編號 6幻向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/mL 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L， 進而添加掩蔽寡核苷酸溶液ι μ L，室溫下放置ι小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗緩 沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7. 4)] 200 μ L將各孔清洗3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 05 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸
73緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7· 4) ] 200 μ L 將各孔清洗 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖28及圖29中。就處理1及處理2的任意處理而言，人血液來源基 因組DNA的溶液A(IOOng)及溶液B(IOng)，與溶液C(Ong 對照溶液)相比，熒光強度的增 加依賴于濃度。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和5’末端生 物素標記寡核苷酸的復合體，利用該功能檢測復合體中的甲基胞嘧啶抗體，由此可以對血 清中人基因組DNA進行高靈敏度的檢測 定量。另外，與處理2相比，處理1中檢測血清中 人基因組DNA的靈敏度更高。實施例21作為血清樣品，如下所示分別制備人血液來源基因組DNA(Human Genomic DNA, #636401、Clontech公司)的TE緩沖溶液和從Kohjin Bio公司購入的人血清(不同個體 的Human Serum)的混合液各4份。血清樣品A 人血液來源基因組DNA 50ng/10 μ L TE緩沖溶液+人血清40 μ L血清樣品B 人血液來源基因組DNA 5ng/10 μ L TE緩沖溶液+人血清40 μ L血清樣品C :0ng/10 μ L TE緩沖溶液+人血清40 μ L (陰性對照液)關(guān)于上述中制備的血清樣品A C，分別進行以下的處理1或處理2各雙份。處理1 混合血清樣品50μ L、和緩沖液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5), IOOmM MgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 20 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混 合。隨后，將該PCR管在95°C下保溫10分鐘，在4°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫。以 9IOOxg離心10分鐘，然后回收上清。處理2 混合血清樣品50μ L、和緩沖液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5), IOOmM MgC12, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混 合。隨后，將該PCR管在95°C下保溫10分鐘，在4°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫。以 9IOOxg離心10分鐘，然后回收上清?；旌贤ㄟ^上述的處理制備的溶液20 μ L、限制酶MspI 2U、和最適于MspI的IOx緩 沖液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2、IOmM二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 5 μ L，向其中添 加滅菌超純水，使液量為50 μ L而分別制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育1小時?；旌贤ㄟ^上述的酶處理得到的溶液30 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ L、 10xNEBuffer2(NEB公司制)5μ L、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ L，向其中 添加滅菌超純水，使液量為50 μ L而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。作為用于獲得含有在作為人轉(zhuǎn)座子而周知的Alu區(qū)域設(shè)計的、序列編號66所示的 堿基序列的目標DNA區(qū)域(W、序列編號66、與基因庫檢索號No. AF458110所示的堿基編號 178-262相當?shù)膮^(qū)域)的特定寡核苷酸，合成含有與目標DNA區(qū)域W的正鏈互補性結(jié)合的、 序列編號67所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B6，制備了 0. 2pmoL/10 μ L的TE緩沖溶液。添加在上述中得到的反應液50yL、特定寡核苷酸溶液10yL、緩沖液(330mM Tris-醋酸鹽 pH 7.9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶 液10 μ Ljn lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L， 進行了混合。隨后，使目標DNA區(qū)域和特定寡核苷酸形成雙鏈，將該PCR管在95°C下保溫 10分鐘，迅速冷卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C，保溫10分鐘，進而 37°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫。將得到的反應液100 μ L移至抗生蛋白鏈菌素被覆完的8孔條紋(Str印taWell、 #11645692001、Roche公司)，室溫下放置約30分鐘，在8孔條紋借助生物素-抗生蛋白鏈 菌素結(jié)合將含有目標DNA區(qū)域和特定寡核苷酸的復合體固定化。隨后，通過傾析除去溶液， 用清洗緩沖液[含有 0.05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7. 4) ] 200 μ L將各孔清洗3次。作為用于將固定后的游離的特定寡核苷酸掩蔽的掩蔽寡核苷酸，合成含有與特定 寡核苷酸互補性結(jié)合的、序列編號68所示的堿基序列的寡核苷酸Μ，制備了 0. lpmoL/yL的 TE緩沖溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、和含0. 5 μ g/mL 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L， 進而添加掩蔽寡核苷酸溶液ι μ L，室溫下放置ι小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗緩 沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7. 4)] 200 μ L將各孔清洗3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 05 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7· 4) ] 200 μ L 將各孔清洗 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光，對得到的測定值算 出雙份的平均值。其結(jié)果示于圖30及圖31中。在處理1中，就人血液來源基因組DNA的溶液A(50ng) 及溶液B (5ng)，與溶液C (Ong 對照溶液)相比，熒光強度的增加依賴于濃度(圖30)。另 一方面，在處理2中，就人血液來源基因組DNA的溶液A(50ng)而言，與溶液C (Ong 對照溶 液)相比，熒光強度增加，但在溶液B(5ng)中未見熒光強度的增加(圖31)。在本實驗中，可知形成·選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和5’末端生 物素標記寡核苷酸的復合體，利用該功能檢測復合體中的甲基胞嘧啶抗體，由此檢測 定量 血清中人基因組DNA的靈敏度高。另外，與處理2相比，處理1中檢測血清中人基因組DNA 的靈敏度高。實施例22作為血清樣品，使用以下所示的人血清。從Kohjin Bio公司購入的人血清(不同個體的人血清)Lot No.N51438(健康者) N51439(健康者) N51441(健康者)
從ProMedDx公司購入的人血清(不同個體的人血清) Lot No.
11171268(健康者、56歲、男性) 11171292(健康者、62歲、男性) 11171297(健康者、67歲、男性) 11171314(健康者、75歲、男性) 11171327(健康者、70歲、男性) 11202510 (健康者、67歲、女性) 11202522 (健康者、64歲、女性) 11202527 (健康者、52歲、女性) 11202615(健康者、75歲、女性) 11202618 (健康者、78歲、女性) 10958886 (健康者、56歲、男性)
10958979(健康者、39歲、男性)
10958980(健康者、45歲、男性) 10960268 (健康者、37歲、男性) 10960272 (健康者、50歲、男性) 10960276 (健康者、30歲、男性) 10960285 (健康者、39歲、男性) 11003457 (健康者、38歲、男性)
11003479(健康者、51歲、男性)
11003480(健康者、48歲、男性) 11324997 (健康者、59歲、男性) 11325001 (健康者、61歲、男性) 10325022 (健康者、61歲、男性) 11325032 (健康者、60歲、男性) 11325062 (健康者、69歲、男性) 10870623 (乳腺癌患者、33歲、女性) 10929521 (乳腺癌患者、55歲、女性) 10989644 (乳腺癌患者、45歲、女性) 11209430 (乳腺癌患者、80歲、女性) 10929514(乳腺癌患者、57歲、女性) 10843055 (乳腺癌患者、59歲、女性) 10984680 (乳腺癌患者、64歲、女性) 11209428 (乳腺癌患者、55歲、女性) 10840414(肺癌患者、54歲、女性)
10929506肺癌患者、55歲、男性)
11091955肺癌患者、76歲、女性)
11103346肺癌患者、66歲、女性)
11142322肺癌患者、62歲、女性)
11152564肺癌患者、67歲、男性)
11152571肺癌患者、67歲、男性)
11153198肺癌患者、69歲、女性)
11209435肺癌患者、61歲、男性)
11230621肺癌患者、71歲、女性)
11153192肺癌患者、59歲、男性)
10715942肺癌患者、64歲、男性)
10840422肺癌患者、78歲、女性)
10935547前列腺癌患者、83歲、男性)
11000243前列腺癌患者、78歲、男性)
11071226前列腺癌患者、84歲、男性)關(guān)于上述的血清樣品，分別進行以下的處理各雙份?；旌涎鍢悠?0μ L、和緩沖液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5), IOOmM MgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 20 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進行了混 合。隨后，在95°C下保溫10分鐘，在4°C下保溫10分鐘之后，恢復至室溫。以9100xg或 20400xg離心10分鐘，然后回收上清?；旌贤ㄟ^上述的處理制備的各溶液20 μ L、限制酶MspI 2U、和最適于MspI的IOx 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、500mM NaCl)5yL，向其 中添加滅菌超純水，使液量為50 μ L而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育1小時。混合通過上述的酶處理得到的溶液30 μ L、SssI甲基化酶(NEB公司制)0. 5 μ L、 10xNEBuffer2(NEB公司制)5μ L、和3. 2mM S-腺苷甲硫氨酸(NEB公司制)0. 5 μ L，向其中 添加滅菌超純水，使液量為50 μ L而制備了反應液。將該反應液在37°C下孵育30分鐘。作為用于獲得含有在作為人轉(zhuǎn)座子而周知的Alu區(qū)域設(shè)計的、序列編號66所示的 堿基序列的目標DNA區(qū)域(W、序列編號66、與基因庫檢索號No. AF458110所示的堿基編號 178-262相當?shù)膮^(qū)域)的特定寡核苷酸，合成含有與目標DNA區(qū)域W的正鏈互補性結(jié)合的、 序列編號67所示的堿基序列的5’末端生物素標記寡核苷酸B6，制備了 0. 2pmoL/10 μ L的 TE緩沖溶液。添加在上述中得到的反應液50yL、特定寡核苷酸溶液10yL、緩沖液(330mM TriS-醋酸鹽pH 7.9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM二硫蘇糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2 溶液 10μ L、和lmg/mL BSA溶液10 μ L，進而向該混合物中添加滅菌超純水，使液量為100 μ L，進 行了混合。隨后，使目標DNA區(qū)域和特定寡核苷酸形成雙鏈，在95 °C下保溫10分鐘，迅速冷 卻至70°C，在該溫度下保溫10分鐘。接著，冷卻至50°C，保溫10分鐘，進而在37°C下保溫 10分鐘之后，恢復至室溫。將得到的反應液100 μ L移至抗生蛋白鏈菌素被覆完的8孔條紋(Str印taWell、 #11645692001、Roche公司)，室溫下放置約30分鐘，在8孔條紋借助生物素-抗生蛋白鏈菌素結(jié)合將含有目標DNA區(qū)域和特定寡核苷酸的復合體固定化。隨后，通過傾析除去溶液， 用清洗緩沖液[含有 0.05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7. 4) ] 200 μ L將各孔清洗3次。作為用于將固定后的游離的特定寡核苷酸掩蔽的掩蔽寡核苷酸，合成含有與特定 寡核苷酸互補性結(jié)合的、序列編號68所示的堿基序列的寡核苷酸Μ，制備了 0. lpmoL/yL的 TE緩沖溶液。向各孔中添加甲基胞嘧啶抗體[Aviva Systems Biology公司制、含0. 5 μ g/mL 0. BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP0 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]100 μ L， 進而添加掩蔽寡核苷酸溶液ι μ L，室溫下放置ι小時。隨后，通過移液除去溶液，用清洗緩 沖液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7. 4)] 200 μ L將各孔清洗3次。隨后，以100 μ L的比例向各孔中添加Eu-Nl標記小鼠IgG抗體[Perkin Elmer公 司制、含 0. 05 μ g/μ L 0. 1% BSA 的磷酸緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，室溫下放置1小時。放置后用清洗緩沖液[含有0. 05% Tween20的磷酸 緩沖液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH 7· 4) ] 200 μ L 將各孔清洗 3 次。以150 μ L的比例將促進溶液(Perkin Elmer公司制)添加到各孔中，室溫下攪拌 5分鐘，室溫下放置15分鐘。隨后，以激發(fā)340nm/熒光612nm測定熒光。通過實時PCR對經(jīng)上述的酶處理(MspI處理)得到的溶液中的DNA進行定量。作為濃度測定用標準樣品，如下所示制備了 MspI處理人基因組DNA溶液。制備人 血液來源基因組 DNA (Human Genomic DNA、#636401、Clontech 公司)的 5ng/μ L TE 緩沖溶 液，混合該溶液20 μ L、限制酶MspI 2U、和最適于MspI的IOx緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、500mM NaCl) 5 μ L，向其中添加滅菌超純水，使液量為 50 μ L而對各處理制備了反應液。將該反應液在37°C下賦予1小時。對于得到的反應液， 通過基于TE緩沖液的稀釋，制備了 10_5、10_4、10_3、10_2、10-1、1、lOng/5 μ L溶液。擴增在作為人轉(zhuǎn)座子而周知的Alu區(qū)域設(shè)計的目標DNA區(qū)域(W、序列編號66、與 基因庫檢索號No. AF458110所示的堿基編號178-262相當?shù)膮^(qū)域)擴增，為了通過實時PCR 進行定量，設(shè)計了正向引物(F1、序列編號69)及反向引物(R1、序列編號70)設(shè)計?！凑蛞铩礔l :5，-GGTGGCTCACGCCTGTAATC-3，(序列編號 69)〈反向引物〉Rl :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列編號 70)作為PCR的反應液，使用如下的反應液，即混合成為模板的上述制備的MspI處理 人基因組DNA溶液5μ L或上述制備的濃度測定用標準樣品、正向引物Fl及反向引物Rl的 5 μ M 溶液各 1. 5 μ L、SYBR Green I (Lonza 公司)0. Ix 量、each 2mM dNTP2. 5 μ L、IOxPCR 緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 8. 3、500mM KCl、15mM MgCl2、0. 01 % 明膠)2. 5 μ L、和耐熱性 DNA聚合酶(AmpliTaq Gold,5U/yL, ABI公司)0. 125 μ L，向其中添加滅菌超純水，使液量 為25 μ L而得到的反應液。實時PCR使用Mx3005P (Mratagene公司)得以實施。將該反 應液在95°C下保溫10分鐘之后，以95°C下30秒、61°C下30秒、72°C下45秒為1個循環(huán)， 重復進行40個循環(huán)，由此來擴增目標DNA區(qū)域。根據(jù)該實時PCR的結(jié)果來對血清樣品中的DNA進行定量。其結(jié)果示于圖32及圖33中。對基于本方法的測定值和通過實時PCR進行定量的 值加以比較，結(jié)果示出具有相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R = 0. 74)(圖32)。另外，對59歲以下的人 血清樣品的定量結(jié)果在癌癥患者和健康者之間加以比較，結(jié)果表示癌癥患者血清中DNA濃 度上升(圖33)。在本實驗中，可知形成 選擇了甲基胞嘧啶抗體、甲基化的DNA片段和5’末端生 物素標記寡核苷酸的復合體，利用其功能對復合體中的甲基胞嘧啶抗體進行定量 檢測，由 此能以高靈敏度對人血清中游離DNA進行檢測·定量。產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過本發(fā)明，可以提供能對具有目標DNA區(qū)域的DNA進行簡單的定量或檢測的方 法。另外，還可以提供使用被檢者來源的標本(優(yōu)選血清)并根據(jù)對該標本的結(jié)果和健康 者來源的標本的結(jié)果加以比較來選出癌癥患者來源的標本的方法等。序列表文本序列編號17 70設(shè)計的寡核苷酸
權(quán)利要求
1.一種方法，其是對標本中所含的具有目標DNA區(qū)域的DNA進行定量或檢測的方法，其 特征在于，具備(1)從標本制備要檢測目標DNA區(qū)域的DNA的第一工序；(2)用DNA甲基化酶對由第一工序制備的DNA進行處理的第二工序；(3)從經(jīng)第二工序處理后的DNA制備單鏈甲基化DNA的第三工序；(4)第四工序，其中，使由第三工序制備的單鏈甲基化DNA、甲基化DNA抗體、具有如下 堿基序列的特定寡核苷酸混合，形成具有甲基化后的目標DNA區(qū)域的單鏈甲基化DNA、該甲 基化DNA抗體與該特定寡核苷酸的復合體，所述堿基序列不抑制單鏈甲基化DNA中的目標DNA區(qū)域的被甲基化后的一個以上的堿 基與該甲基化DNA抗體的結(jié)合，且可以通過互補性與具有目標DNA區(qū)域的單鏈DNA結(jié)合；及(5)第五工序，其中，對由第四工序形成的復合體中所含的所述甲基化DNA抗體，利用 其識別功能進行定量或檢測，由此，對所述單鏈甲基化DNA中的具有目標DNA區(qū)域的DNA進 行定量或檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，第四工序中，在含有二價陽離子的反應體系中使復合體形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中， 二價陽離子是鎂離子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，其中，在第五工序開始之前，使第四工序形成的復合體中所含的抗體和支持體結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，其中，在第五工序開始之前，使第四工序形成的復合體中所含的特定寡核苷酸和支持體結(jié)I=I O
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項所述的方法，其中， DNA甲基化酶是胞嘧啶甲基化酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的方法，其中， DNA甲基化酶是ksl甲基化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項所述的方法，其中， 甲基化DNA抗體是甲基胞嘧啶抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的方法，其中， 標本是下述任一種標本(a)哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細胞溶解液或組織溶解液；(b)從選自哺乳動物來源的血液、體液、糞尿、體分泌物、細胞溶解液及組織溶解液的一 種中提取的DNA ；(c)以從選自哺乳動物來源的組織、細胞、組織溶解液及細胞溶解液的一種中提取的 RNA為模板而制作的DNA ；(e)從細菌、真菌或病毒中提取的DNA;或(f)以從細菌、真菌或病毒中提取的RNA為模板而制作的DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項所述的方法，其中， 要檢測目標DNA區(qū)域的DNA是下述的任一種DNA (a)預先用不以目標DNA區(qū)域為識別剪切位點的限制酶進行了消化處理的DNA、(b)預先精制后的DNA、(c)血液中的游離DNA、(d)微生物基因組來源的DNA、或(e)通過逆轉(zhuǎn)錄酶由RNA生成的DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 10中任一項所述的方法，其中， 在第四工序中的復合體形成時，添加反向寡核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項所述的方法，其中，在第一工序中，在用于從標本制備DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的鈉鹽的濃 度為IOOmM以上IOOOmM以下。
13.根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項所述的方法，其中，在第一工序中，在用于從標本制備DNA的DNA提取操作中所使用的溶液中的鈉鹽的濃 度為IOOmM以上200mM以下。
14.一種方法，其是篩選癌癥患者來源的標本的方法，其中，包括如下工序利用權(quán)利要求1 13中任一項所述的方法使用被檢者來源的標本而定量或檢測的DNA 的定量結(jié)果或檢測結(jié)果、與利用相同方法使用健康者來源的標本而定量或檢測的DNA的定 量結(jié)果或檢測結(jié)果之間的差異如有顯著性意義，則將被檢者來源的標本作為癌癥患者來源 的標本進行評價，根據(jù)該評價的結(jié)果來鑒定癌癥患者來源的標本。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中， 標本是哺乳動物來源的血清。
16.根據(jù)權(quán)利要求14 15中任一項所述的方法，其中，具有目標DNA區(qū)域的DNA是哺乳動物來源的血清中的具有目標DNA區(qū)域的游離DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及對標本中所含的具有目標DNA區(qū)域的DNA進行定量或檢測的方法等。
文檔編號C12N15/09GK102105585SQ20098012948
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日
發(fā)明者佐藤日出夫, 冨原祥隆, 樽井弘和 申請人:住友化學株式會社