植物基因組定點(diǎn)修飾方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了植物基因組定點(diǎn)修飾方法。具體地，本發(fā)明提供了一種RNA引導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)修飾方法。通過使用特定結(jié)構(gòu)的核酸構(gòu)建物，本發(fā)明方法可在預(yù)定的植物基因組位點(diǎn)，高效地進(jìn)行定點(diǎn)修飾。本發(fā)明方法有助于高效地篩選具有改良性狀的植物。
【專利說明】植物基因組定點(diǎn)修飾方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及RNA引導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)修飾方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 過去十多年里，序列特異性核酸酶的發(fā)明和改進(jìn)已經(jīng)在創(chuàng)建定點(diǎn)突變方面展現(xiàn)出 了強(qiáng)大威力。鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸 酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALENs)即是其中的主要代表 (Carroll et al.，2006 !Christian et al.，2010)。它們是識別一段特定核酸序列的結(jié)合 結(jié)構(gòu)域陣列與一種非特異性核酸酶Fokl組成的融合蛋白。這些蛋白切割核酸序列產(chǎn)生雙 鏈斷裂以后，生物體會通過非同源末端連接或者同源重組兩種機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，從而引入定 點(diǎn)改變或修飾。上述技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)物種里獲得成功應(yīng)用，包括線蟲，人細(xì)胞，老鼠，斑馬 魚，玉米，水稻，短柄草等（Beumer et al.，2006 ;Meng et al.，2008 ;Shukla et al.，2009 ; Meyer et al. , 2010 ；Cui et al. , 2011 ；Mahfouz et al.,2011；Li et al. , 2012 ；Meyer et al·, 2012 ;Shan et al·, 2013 ;Weinthal et al·, 2013)。然而，這些技術(shù)的最大缺陷是通過 蛋白元件來識別特定核酸序列，構(gòu)建比較麻煩，識別特異性有待提高。
[0003] 2012年人們發(fā)現(xiàn)并改進(jìn)了一種突破性的新技術(shù)，CRISPR/Cas。CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)，是一段被一種短重復(fù)序 列分隔的核酸序列，它們轉(zhuǎn)錄形成的CRISPR RNA (crRNAs)與另一種反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)部分區(qū)域配對形成二元復(fù)合體。然后，該二元 復(fù)合體一起引導(dǎo)具有非特異核酸酶活性的Cas蛋白，切割與crRNAs匹配的DNA序列，從而 形成雙鏈斷裂。
[0004] 此外，人們進(jìn)一步將crRNAs與tracrRNA融合在一起，形成單一的chimeric RNA(chiRNA)分子，并發(fā)現(xiàn)chiRNA同樣能介導(dǎo)Cas9蛋白切割目的序列（Jinek et al.，2012)。這種可編輯型CRISPR/Cas系統(tǒng)很快在多個(gè)物種里面取得成功應(yīng)用，包括人 細(xì)胞系，斑馬魚，大腸桿菌和老鼠等（Jinek et al.，2012;Hwang et al.，2013;Jiang et al.,2013 ；Jinek et al.,2013 ；Mali et al.,2013 ；Shen et al. , 2013 ；ffang et al.，2013)。這項(xiàng)技術(shù)的最大優(yōu)勢是構(gòu)建簡易，而且可以同時(shí)對多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)基因修飾。對 于動物，可將chiRNA和Cas9的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接施用（如通過注射）于動物，從而引起基 因突變。在老鼠中，已有同時(shí)對多達(dá)5個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)基因突變的成功報(bào)道。然而，由于種種未 知的原因，目前尚未在植物中成功開發(fā)和應(yīng)用類似的技術(shù)。
[0005] 綜上所述，為了植物基因工程的需要，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)簡便高效的植物基因 組的定點(diǎn)修飾方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是簡便高效的植物基因組的定點(diǎn)修飾方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供適用于植物的CRISPR/Cas技術(shù)，并在穩(wěn)定植株中實(shí)現(xiàn) 特異DNA序列的切割。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種植物基因組定點(diǎn)修飾方法，包括步驟：
[0009] (a)將一表達(dá)嵌合RNA和Cas蛋白的核酸構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的 植物細(xì)胞，其中所述嵌合RNA是由特異性識別待定點(diǎn)修飾（或待切割位點(diǎn)）的CRISPR RNA(crRNAs)和反式作用型 crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)所構(gòu)成的嵌合體 (chimera);和
[0010] (b)在合適的條件下，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的所述核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄形成嵌合 RNA(chiRNA)，并且使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞表達(dá)所述的Cas蛋白，從而使得在所述嵌合RNA 的引導(dǎo)下，在所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中，通過所述Cas蛋白對基因組DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，從而 進(jìn)行基因組定點(diǎn)修飾。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的定點(diǎn)修飾包括定點(diǎn)隨機(jī)修飾和定點(diǎn)非隨機(jī)修飾（定點(diǎn)精 確修飾）。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，在嵌合RNA和Cas蛋白對基因組DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割之前，向植物 細(xì)胞中導(dǎo)入供體DNA，從而進(jìn)行基因組定點(diǎn)精確修飾，所述供體DNA為單鏈或雙鏈DNA，并包 含待插入或待替換的DNA序列，所述DNA序列可以為單個(gè)核苷酸、或多個(gè)核苷酸（包括DNA 片段或者編碼基因）。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述核酸構(gòu)建物包括第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物， 其中第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物是相互獨(dú)立的，或是一體的；
[0014] 其中，第一亞核酸構(gòu)建物包括從5'至3'的以下元件：
[0015] 第一植物啟動子；
[0016] 與所述第一植物啟動子操作性相連的嵌合RNA的編碼序列，所述嵌合RNA的編碼 序列的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0017] A-B (I)
[0018] 式中，
[0019] A 為編碼 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列；
[0020] B 為編碼反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列；
[0021] 表示A和B之間的連接鍵或連接序列；其中，由所述嵌合RNA的編碼序列轉(zhuǎn)錄 形成一個(gè)完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和
[0022] RNA轉(zhuǎn)錄終止子；
[0023] 第二亞核酸構(gòu)建物包括5'至3'的以下元件：
[0024] 第二植物啟動子；
[0025] 與所述第二植物啟動子操作性相連的Cas蛋白的編碼序列，并且所述Cas蛋白的 是N端、C端或兩側(cè)與核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；和
[0026] 植物轉(zhuǎn)錄終止子。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述第一亞核酸構(gòu)建物的數(shù)量為一個(gè)或者多個(gè)（針對多個(gè)待切 割位點(diǎn)），并與第二亞核酸構(gòu)建物是相互獨(dú)立的，或是一體的。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，各第一亞核酸構(gòu)建物與第二亞核酸構(gòu)建物的相對位置是任意 的。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的第二植物啟動子和與所述所述Cas蛋白的編碼序列之間 5'至3'還操作性相連有：
[0030] 第三亞核酸構(gòu)建物，較佳地，所述的第三亞核酸構(gòu)建物為來源于番茄矮壯病毒 (TBSV)的p 19蛋白編碼序列；和
[0031] 自剪切序列，較佳地，所述的自剪切序列為2A多肽編碼序列（SEQ ID NO. : 98)。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的pl9蛋白編碼序列包括pl9基因的全長序列或cDNA序 列。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的2A多肽序列如SEQ ID NO. : 99所示
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的pl9蛋白編碼序列如SEQ ID NO. : 100所示。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的pl9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 101所示。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述定點(diǎn)修飾包括：
[0037] (i)在沒有供體DNA的情況下，對植物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)插入和缺失；和
[0038] (ii)在存在供體DNA的情況下，以供體DNA為模板，對植物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行精 確插入、缺失或者替換DNA序列；
[0039] 較佳地，所述定點(diǎn)修飾包括對植物基因組的基因敲除，基因敲入（轉(zhuǎn)基因）以及調(diào) 控（上調(diào)或下調(diào)）內(nèi)源基因的表達(dá)水平。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的RNA轉(zhuǎn)錄終止子為U6轉(zhuǎn)錄終止子，為至少連續(xù)的7個(gè) T(TTTTTTT)〇
[0041 ] 在另一優(yōu)選例中，第一植物啟動子為來自于待改造植物的內(nèi)源啟動子。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，第一植物啟動子為來自于待改造植物的RNA聚合酶III依賴的 啟動子。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述RNA聚合酶III依賴的啟動子包括AtU6-26、0sU6-2、 AtU6-l、AtU3-B、At7SL 或其組合。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物轉(zhuǎn)錄終止子為Nos。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的第二植物啟動子為RNA聚合酶II依賴的啟動子，較佳地， 包括組成型表達(dá)的啟動子或擬南芥生殖細(xì)胞特異性表達(dá)的sporocyteless(SPL)啟動子。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述第二亞核酸構(gòu)建物中，在所述Cas蛋白的編碼序列后，自5' 至3'還依次操作性連接有SPL基因的表達(dá)框架。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的SPL基因表達(dá)框架包括SPL基因的內(nèi)含子、外顯子、非翻 譯區(qū)、和終止子。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的SPL基因表達(dá)框架自5'至3'依次操作性連接有一個(gè)或 多個(gè)選自SEQ ID NO. :103(內(nèi)含子1)、104(外顯子2)、105(內(nèi)含子2)、106(外顯子3)、 107(3'非翻譯區(qū)）、108(終止子）所示的序列。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的第二亞核酸構(gòu)建物中的植物轉(zhuǎn)錄終止子序列如SEQ ID NO. : 108 所示。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述的核酸構(gòu)建物是一個(gè)同時(shí)表達(dá)嵌合RNA和Cas蛋白的質(zhì)粒。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括單子葉植物、雙子葉植物和裸子植物；
[0052] 較佳地，所述的植物包括林業(yè)植物、農(nóng)用植物、經(jīng)濟(jì)作物、觀賞植物。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括以下科的植物：十字花科、禾本科。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括但不限于擬南芥、水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、 燕麥、黑麥、甘鹿、油菜、白菜、棉花、大豆、苜猜、煙草、番爺、辣椒、南瓜、西瓜、黃瓜、蘋果， 桃、李、海棠、甜菜、向日葵、萵苣、萵輿、青蒿、菊芋、甜葉菊、楊樹、柳樹、桉樹、丁子香、橡膠 樹、木薯、蓖麻、花生、豌豆、黃芪、煙草，番茄，辣椒等。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，所述的cas蛋白包括cas9蛋白。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述的第二植物啟動子為RNA聚合酶II依賴的啟動子。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述的RNA聚合酶II依賴的啟動子包括組成型啟動子和擬南芥 生殖細(xì)胞特異性表達(dá)的sporocyteless(SPL)啟動子。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一植物啟動子包括AtU6-26、0sU6-2、AtU6-l、AtU3-B、 At7SL或其組合。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的第二植物啟動子包括35s、UBQ、SPL啟動子或其組合。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：在步驟（b)之前或之后，將所述的轉(zhuǎn)化的植物 細(xì)胞再生成植株。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：檢測所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中基因組的突變或 修飾情況。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述植物細(xì)胞包括來自培養(yǎng)物、愈傷組織、或植株的植物細(xì)胞。
[0063] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于植物基因組定點(diǎn)修飾的核酸構(gòu)建物，所述 核酸構(gòu)建物包括第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物，其中第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞 核酸構(gòu)建物是相互獨(dú)立的，或是一體的；
[0064] 其中，第一亞核酸構(gòu)建物包括從5'至3'的以下元件：
[0065] 第一植物啟動子；
[0066] 與所述第一植物啟動子操作性相連的嵌合RNA的編碼序列，所述嵌合RNA的編碼 序列的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0067] A-B (I)
[0068] 式中，
[0069] A 為編碼 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列；
[0070] B 為編碼反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列；
[0071] 表示A和B之間的連接鍵或連接序列；其中，由所述嵌合RNA的編碼序列轉(zhuǎn)錄 形成一個(gè)完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和
[0072] RNA轉(zhuǎn)錄終止子；
[0073] 第二亞核酸構(gòu)建物包括5'至3'的以下元件：
[0074] 第二植物啟動子；
[0075] 與所述第二植物啟動子操作性相連的Cas蛋白的編碼序列，并且所述Cas蛋白的 是N端、C端或兩側(cè)與核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；和
[0076] 植物轉(zhuǎn)錄終止子。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，所述的第二植物啟動子和與所述所述Cas蛋白的編碼序列之間 5'至3'還操作性相連有：
[0078] 第三亞核酸構(gòu)建物，較佳地，所述的第三亞核酸構(gòu)建物為來源于番茄矮壯病毒 (TBSV)的p 19蛋白編碼序列；和
[0079] 2A 序列。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述的pl9蛋白編碼序列包括pl9基因的全長序列或cDNA序 列。
[0081] 在另一優(yōu)選例中，所述的pl9蛋白編碼序列如SEQ ID NO. :98所示。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述的RNA轉(zhuǎn)錄終止子為U6轉(zhuǎn)錄終止子，為至少連續(xù)的7個(gè) T(TTTTTTT)〇
[0083] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物轉(zhuǎn)錄終止子為Nos。
[0084] 在另一優(yōu)選例中，所述的核酸構(gòu)建物為DNA構(gòu)建物。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物是一體的。
[0086] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一亞核酸構(gòu)建物的數(shù)量為一個(gè)或者多個(gè)（針對多個(gè)待 切割位點(diǎn)）。
[0087] 在另一優(yōu)選例中，第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物位于同一個(gè)質(zhì)粒中。
[0088] 在另一優(yōu)選例中，第一亞核酸構(gòu)建物位于第二亞核酸構(gòu)建物的上游或下游。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一植物啟動子和/或第二植物啟動子是組成型或誘導(dǎo) 型啟動子。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述的Cas蛋白的編碼序列還包括位于ORF兩側(cè)的NLS序列。
[0091] 在另一優(yōu)選例中，所述第二亞核酸構(gòu)建物還包括：位于Cas蛋白編碼序列下游的 Nos終止子。
[0092] 在另一優(yōu)選例中，所述的Cas蛋白還帶有標(biāo)簽序列。
[0093] 在另一優(yōu)選例中，所述第二亞核酸構(gòu)建物還包括：位于第二植物啟動子與位于 Cas蛋白編碼序列之間的標(biāo)簽序列（如3XFlag序列）。
[0094] 在另一優(yōu)選例中，位于N端的NLS序列位于所述的標(biāo)簽序列的下游。
[0095] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體攜帶本發(fā)明第二方面所述的核 酸構(gòu)建物；
[0096] 本發(fā)明還提供一種載體組合，所述載體組合包括第一載體和第二載體，其中第一 載體攜帶本發(fā)明第二方面所述的核酸構(gòu)建物的第一亞核酸構(gòu)建物，而第二載體攜帶本發(fā)明 第二方面所述的核酸構(gòu)建物的第二亞核酸構(gòu)建物。
[0097] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一亞核酸構(gòu)建物的數(shù)量為一個(gè)或者多個(gè)。
[0098] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一載體可以為一個(gè)或者多個(gè)，并攜帶一個(gè)或者多個(gè)本 發(fā)明第二方面所述的核酸構(gòu)建物的第一亞核酸構(gòu)建物。
[0099] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種基因工程的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有本發(fā)明第三方 面中所述的載體或載體組合。
[0100] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種植物細(xì)胞，所述的植物細(xì)胞的基因組中整合有 本發(fā)明第二方面所述的核酸構(gòu)建物。
[0101] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備植物的方法，包括步驟：將本發(fā)明第五方面 所述的植物細(xì)胞再生成形成植株。
[0102] 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種植物，所述植物的植物細(xì)胞的基因組中整合有 本發(fā)明第二方面所述的核酸構(gòu)建物。
[0103] 在本發(fā)明的第八方面，提供了一種植物，所述植物是第六方面所述的方法制備的。
[0104] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0105] 圖1顯示來自釀膿鏈球菌SF370的SpCas9可以在擬南芥原生質(zhì)體中造成DNA的 定點(diǎn)雙鏈斷裂。（A) SpCas9的表達(dá)由2 X 35S啟動子驅(qū)動，而引導(dǎo)RNA(chiRNA)則由擬南芥 中的AtU6-26啟動子驅(qū)動。NLS，核定位序列；Flag, Flag標(biāo)簽序列；Nos, Nos終止子。（B) 基于同源重組的YF-FP報(bào)告系統(tǒng)。圖中顯示了設(shè)計(jì)的chiRNA目標(biāo)位點(diǎn)。PAM序列標(biāo)記為 紫紅色，20個(gè)堿基的目的序列標(biāo)記為藍(lán)綠色。（C) YF-FP報(bào)告系統(tǒng)檢測的CRISPR/Cas活性。 YFP陽性細(xì)胞由流式細(xì)胞儀檢測。
[0106] 圖2顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體和目的基因 chiRNA設(shè)計(jì)位點(diǎn)示意圖。（A)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化水稻和擬南芥的雙元載體示意圖，其同時(shí)帶有chiRNA和Cas9表達(dá)框。SpCas9的 表達(dá)由2 X 35S啟動子驅(qū)動，擬南芥chiRNA由AtU6-26啟動子驅(qū)動，水稻chiRNA為0sU6-2 啟動子驅(qū)動。（B) Cas9/chiRNA目標(biāo)位點(diǎn)示意圖。PAM序列標(biāo)記為紫紅色，chiRNA目標(biāo)位點(diǎn) 標(biāo)記為藍(lán)綠色。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)由方框標(biāo)注。用于RFLP檢測的酶切位點(diǎn)用黑框標(biāo)注。
[0107] 圖3顯示SpCas9可以在擬南芥和水稻植株中多個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行DNA的定點(diǎn)切割。 (A)和（B)BRIl位點(diǎn)1的代表性Tl代轉(zhuǎn)基因植株。左邊顯示的是生長正常的植株，右邊的 是顯示與bril突變體類似表型的植株。植株在MS培養(yǎng)基上篩選5天后移栽到培養(yǎng)土中生 長1周㈧或3周⑶后拍照。（C)GAI位點(diǎn)1的代表性Tl代轉(zhuǎn)基因植株。左邊顯示的是 生長正常的植株，右邊的是顯示與gai突變體類似表型的植株。植株在MS培養(yǎng)基上篩選5 天后移栽到培養(yǎng)土中生長4周后拍照。（D)處于生根期的R0C5位點(diǎn)1的代表性Tl轉(zhuǎn)基因 植株。（E)BRIl位點(diǎn)1的12株Tl代轉(zhuǎn)基因苗的限制性酶切分析。PCR產(chǎn)物由EcoRV進(jìn)行酶 切。M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。（F) R0C5位點(diǎn)1的14株Tl代轉(zhuǎn)基因苗的限制性酶切分析。PCR產(chǎn) 物由AhdI進(jìn)行酶切。M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。（G)和⑶從BRIl位點(diǎn)I (G)和R0C5位點(diǎn)I (H) 的一株Tl代轉(zhuǎn)基因苗中檢測到的目標(biāo)位點(diǎn)區(qū)域突變代表類型。野生型對照序列在頂部， PAM序列標(biāo)記為紫紅色，目標(biāo)位點(diǎn)標(biāo)記為藍(lán)綠色。紅線表示缺失的堿基，紅色字母表示插入 或者突變的堿基。序列的完整變化情況標(biāo)注在右側(cè)，+表示插入，D表示缺失。（I)水稻和 擬南芥的Tl代轉(zhuǎn)基因苗觀察到表型和突變情況鑒定統(tǒng)計(jì)。標(biāo)尺長度為lcm(A，B，C，D)。
[0108] 圖4顯示在擬南芥中BRIl基因位點(diǎn)1上由工程化的chiRNA :Cas9誘導(dǎo)產(chǎn)生的靶 向位點(diǎn)缺失突變。所示突變類型是來自于12個(gè)獨(dú)立Tl代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA擴(kuò)增并 克隆到載體后進(jìn)行測序得到。最上面顯示的是野生型對照的序列，PAM序列標(biāo)記為紫紅色， 目標(biāo)位點(diǎn)標(biāo)記為藍(lán)綠色。紅線表示缺失的堿基，紅色字母表示插入或者突變的堿基。序列 的完整變化情況標(biāo)注在右側(cè)，+表示插入，D表示缺失。值得注意的是有的序列既有插入又 有缺失。98個(gè)克隆中檢測到了 75個(gè)突變。
[0109] 圖5顯示在擬南芥中BRIl基因位點(diǎn)2上由工程化的chiRNA :Cas9誘導(dǎo)產(chǎn)生的靶 向位點(diǎn)缺失突變。所示突變類型是來自于3個(gè)獨(dú)立Tl代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA擴(kuò)增并 克隆到載體后進(jìn)行測序得到。野生型序列如頂部所示，PAM序列標(biāo)記為紫紅色，目標(biāo)位點(diǎn)標(biāo) 記為藍(lán)綠色。紅線表示缺失的堿基，紅色字母表示插入或者突變的堿基。序列的完整變化 情況標(biāo)注在右側(cè)，+表示插入，D表示缺失。檢測到的次數(shù)標(biāo)記在括號中。71個(gè)克隆中檢測 到了 28個(gè)突變。
[0110] 圖6顯示在擬南芥中BRIl基因位點(diǎn)3上由工程化的chiRNA :Cas9誘導(dǎo)產(chǎn)生的靶 向位點(diǎn)缺失突變。所示突變類型是來自于4個(gè)獨(dú)立Tl代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA擴(kuò)增并 克隆到載體后進(jìn)行測序得到。野生型序列如頂部所示，PAM序列標(biāo)記為紫紅色，目標(biāo)位點(diǎn)標(biāo) 記為藍(lán)綠色。紅線表示缺失的堿基，紅色字母表示插入或者突變的堿基。序列的完整變化 情況標(biāo)注在右側(cè)，+表示插入，D表示缺失。檢測到的次數(shù)標(biāo)記在括號中。34個(gè)克隆中檢測 到了 22個(gè)突變。
[0111] 圖7顯示在擬南芥中GAI基因位點(diǎn)1上由工程化的chiRNA :Cas9誘導(dǎo)產(chǎn)生的靶向 位點(diǎn)缺失突變。所示突變類型是來自于3個(gè)獨(dú)立Tl代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA擴(kuò)增并克 隆到載體后進(jìn)行測序得到。野生型序列如頂部所示，PAM序列標(biāo)記為紫紅色，目標(biāo)位點(diǎn)標(biāo)記 為藍(lán)綠色。紅線表示缺失的堿基，紅色字母表示插入或者突變的堿基。序列的完整變化情 況標(biāo)注在右側(cè)，+表示插入，D表示缺失。檢測到的次數(shù)標(biāo)記在括號中。53個(gè)克隆中檢測到 了 17個(gè)突變。
[0112] 圖8顯示在水稻中R0C5基因位點(diǎn)1上由工程化的chiRNA :Cas9誘導(dǎo)產(chǎn)生的靶向 位點(diǎn)缺失突變。所示突變類型是來自于5個(gè)獨(dú)立Tl代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA擴(kuò)增并克 隆到載體后進(jìn)行測序得到。野生型序列如頂部所示，PAM序列標(biāo)記為紫紅色，目標(biāo)位點(diǎn)標(biāo)記 為藍(lán)綠色。紅線表示缺失的堿基，紅色字母表示插入或者突變的堿基。序列的完整變化情 況標(biāo)注在右側(cè)，+表示插入，D表示缺失。檢測到的次數(shù)標(biāo)記在括號中。165個(gè)克隆中檢測 到了 136個(gè)突變。
[0113] 圖9顯示了 Pa7_YFP的載體圖譜。
[0114] 圖10顯示了 AtU6-26chiRNA序列（未插入目的位點(diǎn)識別序列SEQ ID NO. : 1)。其 中，灰色標(biāo)注的為AtU6-26啟動子，下劃線標(biāo)注的為插入目的位點(diǎn)oligo的兩個(gè)BbsI酶切 位點(diǎn)，方框標(biāo)注的為與目的位點(diǎn)融合的反式作用型crRNA區(qū)域。
[0115] 圖11顯示了 AtU6-26chiRNA序列（已插入目的位點(diǎn)識別序列SEQ ID NO. :2)。
[0116] 圖12顯示了 0sU6-2chiRNA序列（未插入目的位點(diǎn)識別序列SEQ ID NO. :3):其 中，灰色標(biāo)注的為0sU6-2啟動子，下劃線標(biāo)注的為插入目的位點(diǎn)oligo的兩個(gè)BbsI酶切位 點(diǎn)，方框標(biāo)注的為與目的位點(diǎn)融合的反式作用型crRNA區(qū)域。
[0117] 圖13顯示了 0sU6-2chiRNA序列（已插入目的位點(diǎn)識別序列SEQ ID NO. :4)。
[0118] 圖 14 顯示了 2X35S-Cas9_Nos 序列（SEQ ID NO. :39)。
[0119] 圖15A-B顯示了 CRISPR-Cas同時(shí)在Tl代擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中同時(shí)造成CHLIl和 CHLI2基因定點(diǎn)突變。所示突變類型是來自于3個(gè)獨(dú)立T1代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA擴(kuò)增 并克隆到載體后進(jìn)行測序得到。最上面顯示的是野生型對照的序列，目標(biāo)位點(diǎn)用下劃線標(biāo) 記。序列的完整變化情況標(biāo)注在右側(cè)，+表示插入，-表示缺失。
[0120] 圖16顯示了 CRISPR-Cas在Tl代擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中同時(shí)造成TT4基因內(nèi)兩個(gè) 位點(diǎn)的定點(diǎn)突變及位點(diǎn)之間大片度序列缺失。所示突變類型是來自于11個(gè)獨(dú)立Tl代轉(zhuǎn)基 因植株的基因組DNA擴(kuò)增并克隆到載體后進(jìn)行測序得到。最上面顯示的是野生型對照的序 列，目標(biāo)位點(diǎn)用下劃線標(biāo)記。兩個(gè)目的位點(diǎn)的序列完整變化情況及檢測到的比例標(biāo)注在右 偵牝用"；"分隔，+表示插入，-表示缺失。
[0121] 圖17顯示了植物基因打靶載體構(gòu)建示意圖。pSPL-Cas9-SgR:生殖系特異表達(dá)的 植物基因打靶載體。pUBQ-Cas9-sgR:組成型表達(dá)的植物基因打靶載體。pAtU6:擬南芥U6 基因的啟動子；sgRNA:單鏈引導(dǎo)RNA ;PAtSPL:擬南芥SPL基因的啟動子；pAtUBQ:擬南芥 UBQ基因的啟動子；HspCas9 :人源化的鏈霉菌Cas9基因 ；SPL intron:SPL基因的內(nèi)含子； SPL exon:SPL基因的外顯子；tSPL:SPL基因的終止子；tUBQ:UBQ基因的終止子。
[0122] 圖18顯示了 Cas9基因的原位雜交。A, B，C:pSPL-Cas9-sgR的Tl代轉(zhuǎn)基因植物； D，E，F(xiàn):pUBQ-Cas9-SgR的Tl代轉(zhuǎn)基因植物。A，D:花藥發(fā)育的V期；B，E:花藥發(fā)育的VII 期；C，F(xiàn):胚珠發(fā)育的II期。標(biāo)尺=20 μ M。
[0123] 圖19顯示了生殖系專一性基因打靶系統(tǒng)的效率統(tǒng)計(jì)。Α:測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)， pSPL-Cas9-sgR-APl-27/194的Tl代轉(zhuǎn)基因植物沒有檢測到突變，但在相應(yīng)的T2代植物中 卻可以檢測到突變。B:組成型基因敲除系統(tǒng)和生殖細(xì)胞專一性基因敲除系統(tǒng)在不同組織和 不同世代中敲除效率的比較。
[0124] 圖20顯示了不同植物打靶系統(tǒng)T2代轉(zhuǎn)化子的突變類型統(tǒng)計(jì)。對于轉(zhuǎn)化不同的載 體構(gòu)建的T2代群體，隨機(jī)選取8個(gè)發(fā)生突變的株系，分別檢測12個(gè)單株用于突變類型的統(tǒng) 計(jì)。
[0125] 圖21顯示了高效植物基因打靶載體示意圖。A:常規(guī)擬南芥基因打靶載體 psgR-Cas9。B:共表達(dá)植物轉(zhuǎn)錄后基因沉默抑制蛋白的基因打靶載體pSgR-Cas9-pl9。 pAtU6:擬南芥U6基因啟動子；sgRNA:單鏈引導(dǎo)RNA;pUBQ:擬南芥UBQ基因啟動子； hSpCas9:人源化的鏈霉菌Cas9基因；tUBQ:擬南芥UBQ基因的終止子；TBSV-pl9:番茄矮 壯病毒（TBSV)的pl9蛋白編碼基因；2A肽：蛋白順式切割元件；BbsI = BbsI內(nèi)切酶識別位 點(diǎn)。
[0126] 圖22顯示了利用原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，檢測pl9共表達(dá)載體的基因打靶效率。 A:pl9的作用機(jī)制以及檢測原理示意圖。pl9蛋白在植物細(xì)胞中以二聚體形式存在，可以起 到抑制sgRNA的降解，提高sgRNA與Cas9的結(jié)合活性的功能。sgRNA-Cas9復(fù)合體能夠結(jié)合 YFFP報(bào)道基因上的識別序列并剪切，產(chǎn)生雙鏈DNA的斷裂（DSB)。部分重復(fù)的YFP序列會 發(fā)生單鏈退火，從而被DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)切除并修復(fù)正確。B = YFFP瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)地?zé)晒鈾z 測。a，c，e，g，I，k:YFP熒光通道下的陽性細(xì)胞信號。b，d，f，h，j，1:RFP熒光通道下的葉綠 體自發(fā)熒光信號。左下方的數(shù)值代表YFP陽性細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞群體中所占的比例。
[0127] 圖23顯示了 sgR-Cas9_pl9轉(zhuǎn)基因植物的基因表達(dá)分析。A:在sgR-Cas9_pl9的 轉(zhuǎn)基因群體中出現(xiàn)三種不同程度的發(fā)育表型：1/- :葉片平展，2/+:葉片卷曲，3/++:葉片鋸 齒。B = Northern結(jié)果表明，在葉片出現(xiàn)鋸齒的轉(zhuǎn)基因植物總，sgRNA和miRNAmel68的表達(dá) 水平都有明顯的提高。C，D = Realtime PCR的結(jié)果顯示，葉發(fā)育表型與pl9的表達(dá)水平正相 關(guān)，但是Cas9基因的表達(dá)量相對穩(wěn)定。
[0128] 圖24顯示了 sgR-Cas9_pl9轉(zhuǎn)基因 Tl代植物的表型分析。在sgR-Cas9-pl9_APl 和SgR-Cas9-pl9-TT4這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因群體中，根據(jù)葉發(fā)育表型的嚴(yán)重程度，共分為三類，沒 有表型（P19/-)，葉卷曲（pl9/+)和葉鋸齒（pl9/++)。同時(shí)根據(jù)靶基因突變的程度，也分為 三類，野生型（WT)，嵌合體（chimera)和突變體（mutant)。分類統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的植株數(shù)目，計(jì)入 表格。

【具體實(shí)施方式】
[0129] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，采用特定結(jié)構(gòu)的核酸構(gòu)建物，從而首次在植物 中成功實(shí)現(xiàn)了 RNA引導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾。本發(fā)明方法不僅可進(jìn)行定點(diǎn)切割和修飾，而且 可以在特定位點(diǎn)高效引入各種不同類型的突變，從而有利于篩選具有經(jīng)改造的新植物，而 采用了生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)的啟動子還能提高從子代中的獲得基因定點(diǎn)修飾植物的比 例，此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明核酸構(gòu)建物中引入特定的序列后，能夠有效地改善植 物打靶的效率并影響植物的發(fā)育表型。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0130] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明特別適用于植物，可在穩(wěn)定植株中對基因組實(shí)現(xiàn)特異的定點(diǎn)DNA 序列的切割和基因修飾。
[0131] 定義
[0132] 如本文所用，術(shù)語" crRNA"指負(fù)責(zé)識別目標(biāo)位點(diǎn)的CRISPR RNA。
[0133] 如本文所用，術(shù)語"tracrRNA"指與crRNA配對的反式激活crRNA。
[0134] 如本文所用，術(shù)語"植物啟動子"指能夠在植物細(xì)胞中啟動核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。 該植物啟動子可以是來源于植物、微生物（如細(xì)菌、病毒）或動物等，或者是人工合成或改 造過的啟動子。
[0135] 如本文所用，術(shù)語"植物轉(zhuǎn)錄終止子"指能夠在植物細(xì)胞中可使轉(zhuǎn)錄停止的終止 子。該植物轉(zhuǎn)錄終止子可以是來源于植物、微生物（如細(xì)菌、病毒）或動物等，或者是人工 合成或改造過的終止子。代表性的例子包括（但并不限于）=Nos終止子。
[0136] 如本文所用，術(shù)語"Cas蛋白"指一種核酸酶。一種優(yōu)選的Cas蛋白是Cas9蛋白。 典型的Cas9蛋白包括（但并不限于）：來源于釀膿鏈球菌SF370的Cas9。
[0137] 如本文所用，術(shù)語"Cas蛋白的編碼序列"指編碼具有切割活性的Cas蛋白的核苷 酸序列。在插入的多聚核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄和翻譯從而產(chǎn)生功能性Cas蛋白的情況下，技術(shù) 人員會認(rèn)識到，因?yàn)槊艽a子的簡并性，有大量多聚核苷酸序列可以編碼相同的多肽。另外， 技術(shù)人員也會認(rèn)識到不同物種對于密碼子具有一定的偏好性，可能會根據(jù)在不同物種中表 達(dá)的需要，會對Cas蛋白的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，這些變異體都被術(shù)語"Cas蛋白的編碼序列"所 具體涵蓋。此外，術(shù)語特定地包括了全長的、與Cas基因序列基本相同的序列，以及編碼出 保留Das蛋白功能的蛋白質(zhì)的序列。
[0138] 如本文所用，術(shù)語"植物"包括全植株、植物器官（如葉、莖、根等）、種子和植物細(xì) 胞以及它們的子代?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物的種類沒有特別限制，一般包括任何可進(jìn)行 轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物類型，包括單子葉、雙子葉植物和裸子植物。
[0139] 如本文所用，術(shù)語"異源序列"是來自不同種的序列，或者如果來自同一種則是對 其最初形式經(jīng)過充分修飾的序列。例如，可操作地連于啟動子的異源結(jié)構(gòu)基因可以是來自 不同于獲得該結(jié)構(gòu)基因的種，或者，如果來自同一種，則其中之一或兩者都對它們的最初形 式進(jìn)行了充分的修飾。
[0140] 如本文所用，"可操作地連于"或"操作性相連"指這樣一種狀況，即線性DNA序列 的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體 表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽（分泌前導(dǎo)序列）DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如 果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于 能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相 鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0141] 如本文所用，術(shù)語"2A多肽編碼序列"、"自剪切序列"、"2A序列"指的是是發(fā)現(xiàn)于 病毒中的一段不依賴于蛋白酶的自剪切氨基酸序列，類似于IRES，利用2A可以實(shí)現(xiàn)單一啟 動子同時(shí)表達(dá)兩個(gè)基因。它也廣泛存在于各類真核細(xì)胞。與IRES不同的是，下游蛋白表達(dá) 量不會減少。但剪切后2A多肽殘基與上游蛋白連為一體，可在上游蛋白和2A多肽間加入 一種Furin蛋白酶剪切點(diǎn)（4個(gè)堿性氨基酸殘基，如Arg-Lys-Arg-Arg)以從上游蛋白末端 完全切除2A多肽殘基。
[0142] 如本文所用，術(shù)語"嵌合RNA(chiRNA) "、"單鏈引導(dǎo)RNA(SgRNA) "可互換使用，均指 由具有式I所示結(jié)構(gòu)編碼序列的并能夠轉(zhuǎn)錄形成一個(gè)完整的RNA分子的RNA序列。
[0143] 核酸構(gòu)建物
[0144] 本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物包括第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞 核酸構(gòu)建物，其中第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物是相互獨(dú)立的，或一體的；
[0145] 其中，第一亞核酸構(gòu)建物包括從5'至3'的以下元件：
[0146] 第一植物啟動子；
[0147] 與所述第一植物啟動子操作性相連的嵌合RNA的編碼序列，所述嵌合RNA的編碼 序列的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0148] A-B (I)
[0149] 式中，
[0150] A 為編碼 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列；
[0151] B 為編碼反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列；
[0152] 表示A和B之間的連接鍵或連接序列；其中，由所述嵌合RNA的編碼序列轉(zhuǎn)錄 形成一個(gè)完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和
[0153] RNA轉(zhuǎn)錄終止子（包括但并不限于：U6轉(zhuǎn)錄終止子，為至少連續(xù)的7個(gè)T);
[0154] 第二亞核酸構(gòu)建物包括5'至3'的以下元件：
[0155] 第二植物啟動子；
[0156] 與所述第二植物啟動子操作性相連的Cas蛋白的編碼序列，并且所述Cas蛋白的 是N端、C端或兩側(cè)與核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；
[0157] 植物轉(zhuǎn)錄終止子（包括但并不限于Nos等終止子）。
[0158] 在本發(fā)明中，第一植物啟動子和第二植物啟動子的強(qiáng)度分別能夠啟動產(chǎn)生有效量 的chiRNA和Cas蛋白，以實(shí)現(xiàn)對植物基因組的定點(diǎn)修飾。
[0159] 應(yīng)理解，在本發(fā)明中，第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物可以位于同一或不 同的多核苷酸上，也可以位于同一或不同的載體上。
[0160] 將本發(fā)明構(gòu)建好的上述核酸構(gòu)建物，通過常規(guī)的植物重組技術(shù)（例如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)讓 技術(shù)），可以導(dǎo)入植物細(xì)胞，從而獲得攜帶所述核酸構(gòu)建物（或帶有所述核酸構(gòu)建物的載 體）的植物細(xì)胞，或獲得基因組中整合有所述核酸構(gòu)建物的植物細(xì)胞。
[0161] 在所述植物細(xì)胞中，本發(fā)明核酸構(gòu)建物所轉(zhuǎn)錄形成的chiRNA以及所表達(dá)形成Cas 蛋白，可以配合對基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割，進(jìn)而引入各種不同的突變。
[0162] 此外，為了獲得更多含有突變基因的種子，并進(jìn)一步提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生 殖細(xì)胞中的活性，減小基因打靶技術(shù)對植物發(fā)育過程可能產(chǎn)生的不良影響，本發(fā)明采用了 擬南芥SPOROCYTELESS(SPL)基因的表達(dá)框架來驅(qū)動Cas9基因的表達(dá)。
[0163] SPL基因在擬南芥的生殖細(xì)胞系，包括大孢子母細(xì)胞和小孢子母細(xì)胞中都有特異 的表達(dá)。原位雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，SPL基因的表達(dá)框架能有效地啟動Cas9在生殖細(xì)胞系 中的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，突變體檢測的結(jié)果也證明，由SPL啟動子驅(qū)動的Cas9表達(dá)系統(tǒng)，并不影響 Tl代轉(zhuǎn)基因植物的基因功能和生長發(fā)育，但在T2代的轉(zhuǎn)基因群體中卻可以獲得大量靶向 基因發(fā)生突變的雜合子，這說明目的基因的突變是在生殖細(xì)胞中發(fā)生的。
[0164] 為了進(jìn)一步提高SgRNA在植物中的穩(wěn)定性，以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因打靶效 率，構(gòu)建了 TBSV-p 19蛋白與Cas9蛋白共表達(dá)的基因打靶載體pSgR-Cas9-p 19。通過在擬南 芥的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中檢測重組正確的YFFP基因的蛋白活性，實(shí)驗(yàn)證明，pl9蛋白可以顯著 提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因打靶效率。
[0165] 此外，同時(shí)構(gòu)建了以擬南芥內(nèi)源基因?yàn)榘悬c(diǎn)的pl9共表達(dá)載體，在得到的Tl代植 物中，約1/3出現(xiàn)了明顯的葉發(fā)育表型，提示pl9對受miRNA調(diào)控的植物發(fā)育過程有抑制 作用。Northern檢測及基因表達(dá)定量分析的結(jié)果表明，pl9蛋白的表達(dá)水平與miR168和 sgRNA的累積量呈正相關(guān)性。同時(shí)，對靶向位點(diǎn)的表型和基因型分析也說明，pl9表達(dá)量高 的轉(zhuǎn)基因植物，靶基因發(fā)生突變的概率也更高，這為進(jìn)一步改進(jìn)基于CRISPR/Cas9的植物 基因打靶系統(tǒng)提供了重要的依據(jù)和手段。
[0166] 定點(diǎn)切割的方法
[0167] 本發(fā)明還提供了一種對植物的基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割或定點(diǎn)修飾的方法。
[0168] (a)將表達(dá)嵌合RNA和表達(dá)Cas蛋白的核酸構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的植物 細(xì)胞；和
[0169] (b)在合適的條件下，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的所述核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄形成嵌合 RNA(chiRNA)，并且使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞表達(dá)所述的Cas蛋白，從而使得在所述嵌合RNA 的引導(dǎo)下，在所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中通過所述Cas蛋白進(jìn)行基因組定點(diǎn)切割，從而進(jìn)行基 因組定點(diǎn)修飾。
[0170] 在本發(fā)明方法中，步驟（a)中的表達(dá)嵌合RNA和表達(dá)Cas蛋白的核酸構(gòu)建物可以 是同一核酸構(gòu)建物，也可以是不同的核酸構(gòu)建物。
[0171] 另外，如果待處理的植物或植物細(xì)胞中已經(jīng)含有了 Cas蛋白表達(dá)盒，那么可以僅 導(dǎo)入表達(dá)嵌合RNA的核酸構(gòu)建物。
[0172] 此外，如果需要同時(shí)在多個(gè)特定位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)切割或定點(diǎn)修飾，那么可以將表達(dá) 多個(gè)不同chiRNA的核酸構(gòu)建物（可以是同一或不同的核酸構(gòu)建物）導(dǎo)入植物細(xì)胞。
[0173] 在定點(diǎn)切割后，植物細(xì)胞會通過多種機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，并常常會在修復(fù)過程中引入 各種不同的突變?；诖?，人們可以篩選出具有所需突變或所需表現(xiàn)的植物或植物細(xì)胞，以 便用于后續(xù)研究或生產(chǎn)。
[0174] 定點(diǎn)精確修飾的方法
[0175] 如果需要在植物基因組中進(jìn)行定點(diǎn)精確插入、缺失或者替換DNA序列，那么可以 在嵌合RNA和Cas蛋白對基因組進(jìn)行定點(diǎn)切割之前，導(dǎo)入供體DNA，所述供體DNA可以為單 鏈或雙鏈DNA，并包含待插入或待替換的DNA序列，所述DNA序列可以為單個(gè)核苷酸、或多個(gè) 核苷酸（包括DNA片段或者編碼基因）。在定點(diǎn)切割后，植物細(xì)胞可以通過同源重組介導(dǎo) 的DNA修復(fù)系統(tǒng)，以供體DNA為模板，對植物基因組進(jìn)行定點(diǎn)精確插入、缺失或者替換修飾。 所述供體DNA可以用于在植物基因組特定位置插入或置換特定DNA序列；也可以用于替換 啟動子，插入增強(qiáng)子等DNA順式調(diào)控元件，以調(diào)控植物內(nèi)源基因的表達(dá)水平；還可以用于插 入編碼完整蛋白的多核苷酸序列。導(dǎo)入供體DNA的方法包括但不限于：顯微注射，農(nóng)桿菌介 導(dǎo)轉(zhuǎn)染，基因槍法，電擊法，超聲波法，脂質(zhì)體介導(dǎo)法，聚乙二醇（PEG)介導(dǎo)法，激光微束穿 刺孔法，供體DNA經(jīng)化學(xué)修飾（添加親脂性基團(tuán)）后直接導(dǎo)入等。
[0176] 應(yīng)用
[0177] 本發(fā)明可應(yīng)用于植物基因工程領(lǐng)域，用于改造各種不同的植物，尤其是具有經(jīng)濟(jì) 價(jià)值的農(nóng)作物和林業(yè)植物。
[0178] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0179] (a)可特異性地在植物基因組的特定位置，進(jìn)行定點(diǎn)切割和修飾。
[0180] (b)可高效地在特定位置引入各種不同形式的修飾。
[0181] (C)可高效地在特定位置引入新的基因。
[0182] (d)可高效地敲除植物基因組的特定基因。
[0183] (e)可有效地調(diào)控植物內(nèi)源基因的表達(dá)水平。
[0184] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0185] 通用材料和方法
[0186] 擬南芥和水稻植物生長
[0187] 試驗(yàn)中采用擬南芥野生型Col-O (購自美國ABRC中心）。種子播種到MS培養(yǎng)基上 先在4°C春化3天，然后放入22°C長光照生長室（16h光照/8h黑夜），5-10天后移苗到營 養(yǎng)土。
[0188] 實(shí)驗(yàn)中采用的水稻為Kasalath品種（購自中國水稻所），植株移栽到土中后生長 于溫室中（16h光照，30度/8h黑夜，22度）。
[0189] 目的位點(diǎn)的設(shè)計(jì)
[0190] 合適的chiRNA目的位點(diǎn)為UGG的形式，其中Np2tl為chiRNA載體構(gòu)建物所需 要提供的識別序列，NGG為CRISPR/Cas9復(fù)合體與DNA目的位點(diǎn)結(jié)合所需要的識別序列，稱 為PAM序列。
[0191] 因?yàn)閁6型小RNA的轉(zhuǎn)錄以G作為起始信號，因此，選用對GN19NGG這種形式的序列 作為目的位點(diǎn)。此外，因?yàn)檠芯勘砻鰿RISPR/Cas系統(tǒng)可以容忍目的位點(diǎn)遠(yuǎn)離PAM序列一側(cè) 多達(dá)5個(gè)堿基的錯(cuò)配，因此如果N 1^的第一個(gè)核苷酸是G，則合成目的位點(diǎn)oligo引物為接 頭加 Nn ;如果Np2tl的第一個(gè)核苷酸不是G，則本實(shí)施例中也將之當(dāng)做為G，合成目的位點(diǎn) oligo引物為接頭加 GN2_2。。
[0192] 載體構(gòu)建
[0193] 從載體pX260中，用引物Cas9_F和Cas9_R，通過PCR擴(kuò)增SpCas9的編碼序列， 亞克隆到PA7-GFP載體的XhoI和BamHI位點(diǎn)之間替換掉其原來的GFP基因，這樣就分別 在N端和C端獲得了 2x35S啟動子和Nos終止子。pX260和A7-GFP載體的詳細(xì)構(gòu)建方法 見文獻(xiàn)（Voelker et al·，2006 ;Cong et al·，2013)。隨后用 Hindlll/EcoRI 酶切位點(diǎn)將 2x35S啟動子到Nos終止子這段完整的Cas9表達(dá)盒亞克隆到pBluescript SK+載體（購自 Stratagene Inc.，San Diego, CA)，命名為 35S_Cas9_SK。
[0194] 以擬南芥野生型Col-O基因組DNA為模板，用AtU6-26F和AtU6-26R引物通過 PCR擴(kuò)增獲得AtU6-26啟動子，然后亞克隆到pEasy-Blunt載體（購自全式金生物，北京） 中，挑選KpnI在啟動子前端的克隆。隨后利用KpnI/XhoI酶切位點(diǎn)亞克隆到pBluescript SK+(購自 Stratagene Inc.，San Diego, CA)載體中。用 AtU6-26-85F 和 AtU6-26-85R 引物 通過PCR擴(kuò)增的方法從載體pX330中獲得85bp的chiRNA誘導(dǎo)序列并與AtU6-26啟動子融 合，從而獲得完整的chiRNA表達(dá)載體（見圖10)，獲得的載體命名為At6-26SK。根據(jù)設(shè)計(jì) 的目標(biāo)位點(diǎn)合成上下游寡聚核苷酸鏈（見表1)，退火形成的帶有接頭的雙鏈小片段通過連 接反應(yīng)克隆到BbsI酶切后的At6-26SK的兩個(gè)BbsI位點(diǎn)之間。
[0195] 隨后用KpnI/EcoRI酶切將chiRNA表達(dá)盒亞克隆到35S-Cas9-SK中用于瞬時(shí)表達(dá) 分析，或者用KpnI/Sall酶切后與帶有完整Cas9表達(dá)框的Sall/EcoRI片段一起亞克隆到 pCambial300 載體的 KpnI/EcoRI 區(qū)域（Cambia, Canberra, Australia)以用于擬南芥轉(zhuǎn)基 因。
[0196] 以水稻野生型Nipponbare基因組DNA為模板用0sU6-2F和0sU6-2R引物通過PCR 擴(kuò)增獲得〇sU6-2啟動子，然后亞克隆到pEasy-Blunt載體（全式金生物，北京）中。
[0197] 隨后用 TPCR-〇sU6F 和 TPCR-〇sU6R 引物通過 Transfer PCR 的方法將 0sU6-2 轉(zhuǎn) 移到At6-26SK載體中替換AtU6-26啟動子，獲得載體0sU6-2SK(見圖12)。根據(jù)設(shè)計(jì)的 目標(biāo)位點(diǎn)合成上下游寡聚核苷酸鏈，退火形成的帶有接頭的雙鏈小片段通過連接反應(yīng)克隆 到BbsI酶切后的0sU6-2SK的兩個(gè)BbsI位點(diǎn)之間。隨后用KpnI/EcoRI酶切將chiRNA表 達(dá)盒亞克隆到35S-Cas9-SK中用于瞬時(shí)表達(dá)分析，或者用KpnI/Hindlll酶切后與帶有完 整Cas9表達(dá)框的Hindlll/EcoRI片段一起亞克隆到pCambial300載體的KpnI/EcoRI區(qū)域 (Cambia, Canberra, Australia)以用于水稻轉(zhuǎn)基因。
[0198] 以擬南芥野生型Col-O基因組為模板，用pAtU6-F-HindIII和pAtU6-R引物通 過PCR擴(kuò)增得到AtU6-26啟動子片段pAtU6-26。以pX330載體為模板，用sgR-F-U6和 SgR-R-SmaI引物通過PCR擴(kuò)增得到chiRNA (即sgRNA)片段。隨后以chiRNA和pAtU6 的PCR產(chǎn)物的混合物為模板，用pAtU6-F-HindIII和sgR-R-Smal引物進(jìn)行重疊 PCR獲得 pAtU6-chiRNA 片段（SEQ ID NO. :40)，經(jīng)過 HindIII 和 XmaI 酶切后插入 pMD18T 載體相應(yīng) 位置得到PsgR-At載體。
[0199] 以擬南芥野生型Col-O基因組為模板，分別用pAtUBQl-F-Smal和pAtUBQl-R-Cas 與tUBQl-F-BamHI和tUBQ-R-Kpnl為引物通過PCR擴(kuò)增獲得AtUBQl的啟動子pAtUBQl和 終止子。以PX330載體為模板，以Cas9-F-pUBQ和Cas9-R-BamHI為引物通過PCR擴(kuò)增獲得 Cas9基因片段。將上述pAtUBQl，Cas9基因和AtUBQl的終止子片段分別用XmaI和NcoI， NcoI和BamHI以及BamHI和KpnI酶切后共同連入用XmaI和KpnI雙切的psgR-At載體，最 終得到插入片段為 pAtUBQ-Cas9-tUBQ(SEQ ID NO. :41)的 psgR-Cas9-At 骨架載體。
[0200] 選擇符合5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3'的序列作為靶標(biāo)。對于 psgR-Cas9-At 載體，分別合成正義鏈 5' -GATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' 和反義鏈 5' -AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'。隨后將兩條合成的人工序列鏈變性退火形成帶接頭 的雙鏈DNA小片段，插入psgR-Cas9-At的兩個(gè)BbsI酶切位點(diǎn)之間，獲得針對特定目標(biāo)位 點(diǎn)的psgR-Cas9-At載體。從已插入有靶標(biāo)基因片段的psgR-At載體上，用pAtU6-F-KpnI 和SgR-EcoRI引物，擴(kuò)增得到完整的pAtU6-chiRNA元件，并用KpnI和EcoRI酶切后 插入已經(jīng)帶有針對另一個(gè)祀標(biāo)基因的pAtU6-chiRNA元件的psgR-Cas9_At載體，得到 p2XsgR-Cas9-At載體。隨后用HindIII和EcoRI酶切，將完整的2XsgR-Cas9-At亞克隆 到 pCambial300 (Cambia, Canberra, Australia)載體得到雙兀載體 p2 X 130〇-sgR_Cas9 用 于擬南芥轉(zhuǎn)基因。
[0201] pUBQ_Cas9_sgR系列載體的構(gòu)建
[0202] 合成引物sgR-Bsa I -F/R，用PNK激酶將引物加磷，緩慢退火，連入psgR-Cas9_At 的Bbs I位點(diǎn)。將所得到的psgR_Cas9_Bsa載體用EcoR I和Hind III酶切連入pBinl9 載體。即得 pUBQ-Cas9-sgR 載體。將合成的引物 sgR-APl-S27/A27 和 sgR-APl-S194/A194 也按照上述方法連入pUBQ-Cas9-sgR載體的Bsa I位點(diǎn)，即得pUBQ-Cas9-sgR-APl-27和 pUBQ-Cas9-sgR-APl-194。
[0203] pSPL_Cas9_sgR系列載體的構(gòu)建
[0204] 合成引物SPL5' -F-Xma I和SPL5' -R-Bsa I，從擬南芥基因組上擴(kuò)增SPL基因 的5'端啟動子序列。該片段用Xma I和Bsa I酶切后，連入psgR_Cas9_Bsa的Xma I 和 Nco I 位點(diǎn)，得到 pSPL-Cas9-5'。合成引物 SPL3' -F-BamH I 和 SPL3' -R-Kpn I，從 擬南芥基因組上擴(kuò)增SPL基因的3'端序列，該序列包括SPL基因的后個(gè)外顯子（SEQ ID NO. :104、106)和兩個(gè)內(nèi)含子（SEQ ID NO. :103、105)以及終止子（SEQ ID NCX :108)，用 BamH I和Kpn I酶切后連入pSPL-Cas9-5'，得到pSPL-Cas9-53'。所得質(zhì)粒用Xma I和Kpn I酶切后，連入pUBQ-Cas9-sgR，即得pSPL-Cas9-sgR載體。將合成的引物sgR-APl-S27/ A27和sgR-APl-S194/A194也按照上述方法連入pSPL-Cas9-sgR載體的Bsa I位點(diǎn)，即得 pSPL-Cas9-sgR-APl-27 和 pSPL-Cas9-sgR-APl-194。
[0205] psgR_Cas9_pl9 載體的構(gòu)建
[0206] 含有Nco I位點(diǎn)的TBSV-pl9-2A基因由金唯智公司合成。將該基因片段用NcoI 酶切后插入psgR_Cas9載體的NcoI位點(diǎn)，用pl9-F和Cas9-378R引物鑒定片段的插入方向， 即得 psgR_Cas9_pl9 載體。
[0207] psgR-Cas9_MRSl/2 載體的構(gòu)建
[0208] 分別合成引物 sgR-MRSl-S/A 和 sgR-MRS2_S/A。連入 psgR-Cas9_At 的 Bbs I 位 點(diǎn)，即得 psgR-Cas9-MRSl 和 psgR-Cas9-MRS2 載體
[0209] psgR-Cas9-MRSl/2_pl9 載體的構(gòu)建
[0210] 分別合成引物 sgR-MRSl-S/A 和 sgR-MRS2-S/A。連入 psgR-Cas9-pl9 的 Bbs I 位 點(diǎn)，即得 psgR-Cas9-MRSl-pl9 和 psgR-Cas9-MRS2-pl9 載體
[0211] 1300-psgR-Cas9-pl9_APl/TT4 載體的構(gòu)建
[0212] 分別合成引物 sgR-APl-S27/A27, sgR-APl-S194/A194, sgR-TT4-S65/A65 和 sgR-TT4-S296/A296。用 PNK 激酶將引物加磷，退火，連入 psgR-Cas9-pl9 的 Bbs I 位點(diǎn)，即得 psgR-Cas9-pl9-APl-27, psgR-Cas9-pl9-APl-194, psgR-Cas9-pl9-TT4-65 和 psgR-Cas9-pl9-TT4-296。用 AtU6_F_KpnI 和 SgR-R-EcoRI 引物分別擴(kuò)增 psgR-Cas9-APl-194-pl9 和 psgR-Cas9-pl9-TT4-296,所得片段用 Kpn I 和 EcoR I 酶 切連入 psgR-Cas9-pl9-APl-27 和 psgR-Cas9-pl9-TT4-65,即得 psgR-Cas9-pl9-APl 和 psgR-Cas9-pl9-TT4。將這兩個(gè)質(zhì)粒用Hind III和EcoR I酶切，回收，連入pCAMBIA1300載 體，即得 1300-psgR-Cas9-pl9-APl 和 1300-psgR-Cas9-pl9-TT4 載體。
[0213] 基于同源重組的瞬時(shí)YF-FP報(bào)告系統(tǒng)分析
[0214] 在pA7-YFP的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)基于同源重組的瞬時(shí)YF-FP報(bào)告系統(tǒng)。pA7-YFP 載體圖譜見圖9,它以pUC18載體為骨架，在多克隆位點(diǎn)處插入了一個(gè)2X35S啟動 子-EYFP-NOS終止子的完整表達(dá)盒。以pA7-YFP載體為模板，分別用表1中的兩對引物 YF-FPlF和YF-FPlR與YF-FP2F和YF-FP2R通過PCR擴(kuò)增的方法分別獲得YFP基因的 l-510bp和229-720bp這兩段編碼序列，然后通過一個(gè)18bp的酶切接頭（GGATCC ACTAGT GTCGAC) (SEQ ID NO. :103)或一個(gè) 55bp 的多重識別序列（MRS :ACTAGTTCCCTTTATCTCTTAG GGATAACAGGGTAATAG AGATAAAGGGAGGCCT) (SEQ ID NO. : 104)連接起來，并利用 XhoI/SacI 放回到ρΑ-YFP載體上以替換原來的YFP編碼區(qū)。該載體的YFP編碼區(qū)域在酶切接頭兩側(cè) 有282bp的重疊區(qū)域。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的方法制備擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體和PEG轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (Yoo et al.，2007)。轉(zhuǎn)化后室溫暗培養(yǎng)16-24小時(shí)的樣品用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測。
[0215] 創(chuàng)建擬南芥和水稻穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植株
[0216] 將帶有SpCas9完整表達(dá)盒和chiRNA完整表達(dá)盒的pCambial300載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿 菌GV3101中。選取正在盛花期的健壯野生型Col-O植株用浸花法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因 （Clough and Bent，1998)。正常護(hù)理轉(zhuǎn)基因植株至收獲種子，收到的Tl代種子，用5%次氯酸鈉消毒后 10分鐘后，無菌水漂洗4次，播撒在含20 μ g/L潮霉素或50 μ M卡那霉素的MSO培養(yǎng)基上篩 選。4°C放置2天后，移入12小時(shí)光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天后，移栽到16小時(shí)光照的溫室 中，繼續(xù)培養(yǎng)。。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株（Hiei et al.，1994)。
[0217] 基因組修飾的酶切和測序分析
[0218] 提取潮霉素篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA。用目標(biāo)位點(diǎn)對應(yīng)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并回收。每個(gè)樣品取大約400ng PCR回收產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切過夜。酶切 反應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳（1. 2-2% )進(jìn)行分析。對酶切后殘留的未被切割的條帶進(jìn)行割膠回 收，連接到pZeroBack/blunt載體（天根生物，北京）中，對單克隆搖菌制備質(zhì)粒后用M13F 引物進(jìn)行桑格法測序分析。
[0219] 生殖細(xì)胞打靶的突變體鑒定
[0220] 對四種不同的轉(zhuǎn)基因 Tl代群體，隨機(jī)選取32個(gè)株系，分別在生長2周后和開花后 各選取1枚葉片和一個(gè)花序，用CTAB法提取DNA基因組。以AP1-F133/271R為引物，PCR 擴(kuò)增目的基因片段并測序，突變體會從剪切位點(diǎn)起出生套峰。對于T2代的轉(zhuǎn)基因群體，隨 機(jī)選取8個(gè)發(fā)生突變的株系，各檢測12個(gè)單株。將測序結(jié)果為套峰的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行TA克 隆，并挑取10個(gè)單克隆測序以確定突變基因的類型。
[0221] 含pl9蛋白的突變體鑒定
[0222] 對Tl代的1300-psgR-Cas9-pl9-APl/TT4轉(zhuǎn)基因植物群體，各隨機(jī)選取60個(gè) 株系，在生長2周后取1枚葉片，用CTAB法提取DNA基因組。分別以AP1-F133/271R和 TT4-F159/407R為引物，PCR擴(kuò)增目的基因片段，電泳檢測PCR的條帶，統(tǒng)計(jì)發(fā)生片段確實(shí)植 物株系和相關(guān)的發(fā)育表型。
[0223] 原位雜交
[0224] 1.材料包埋：選用抽薹后的轉(zhuǎn)基因植物的花序?yàn)椴牧希?%的多聚甲醛固定12 小時(shí)，梯度酒精脫水，二甲苯透明后石蠟包埋。
[0225] 2.探針制備：Cas9基因以引物dCas9-F3_F/R擴(kuò)增后，所得片段用PstI和BamHI 酶切連入PTA2載體。所得載體用Sal I線性化后，作為DNA模板，分別用T7和SP6RNA聚 合酶在體外轉(zhuǎn)錄出反義和正義的Biotin標(biāo)記RNA探針（Roche, 11175025910)。產(chǎn)物經(jīng)過 DNase I消化，堿裂和純化后溶解于甲酰胺中保存。
[0226] 3.原位雜交按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法操作。（Brewer PB, Heisler MG, Hejatko J, Friml J, Benkova E (2006)In situ hybridization for mRNA detection in Arabidopsis tissue sections. Nat Protocl:1462-1467.)
[0227] Northern 雜交
[0228] 取開花期植物的花序，用Trizol法提取總RNA(Invitrogen)。每個(gè)樣品上 樣50 μ g，用15 %的PAGE膠分離目的RNA條帶并用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 (Hybond, Amersham)。紫外交聯(lián)2分鐘后，在雜交液（DIG EASY Hyb, Roche)中預(yù)雜交1小 時(shí)，加入20μΜ地高辛標(biāo)記的人工序列探針（Invitrogen)，42°C雜交過夜。2XSSC，0.1% 的SDS洗膜兩次，每次10分鐘，0. I X SSC，0. 1 %的SDS洗膜兩次，每次10分鐘。用地高辛 檢測試劑盒（Thermo Fisher)檢測目的條帶，壓片15分鐘后，用X光片顯影。
[0229] Realtime PCR
[0230] 將提取的植物總RNA用DNase I (Takara)處理30分鐘，酚氯仿純化后，取5 μ g做 反轉(zhuǎn)錄（Takara)。產(chǎn)物稀釋1倍后，取1 μ 1做模板，配置Realtime-PCR反應(yīng)體系（Biorad)。 每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，以ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，Col野生型為對照，用2-Λ ACt法計(jì)算基因表 達(dá)的相對變化。
[0231] 序列信息
[0232] 表1序列信息
[0233]

【權(quán)利要求】
1. 一種植物基因組定點(diǎn)修飾方法，其特征在于，包括步驟： (a) 將一表達(dá)嵌合RNA和Cas蛋白的核酸構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞， 其中所述嵌合RNA是由特異性識別待定點(diǎn)修飾（或待切割位點(diǎn)）的CRISPR RNA(crRNAs) 和反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)所構(gòu)成的嵌合體（chimera);和 (b) 在合適的條件下，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的所述核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄形成嵌合 RNA(chiRNA)，并且使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞表達(dá)所述的Cas蛋白，從而使得在所述嵌合RNA 的引導(dǎo)下，在所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中，通過所述Cas蛋白對基因組DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，從而 進(jìn)行基因組定點(diǎn)修飾。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸構(gòu)建物包括第一亞核酸構(gòu)建物和 第二亞核酸構(gòu)建物，其中第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物是相互獨(dú)立的，或是一體 的； 其中，第一亞核酸構(gòu)建物包括從5'至3'的以下元件： 第一植物啟動子； 與所述第一植物啟動子操作性相連的嵌合RNA的編碼序列，所述嵌合RNA的編碼序列 的結(jié)構(gòu)如式I所示： A-B (I) 式中， A 為編碼 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列； B 為編碼反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列； 表示A和B之間的連接鍵或連接序列；其中，由所述嵌合RNA的編碼序列轉(zhuǎn)錄形成 一個(gè)完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和 RNA轉(zhuǎn)錄終止子； 第二亞核酸構(gòu)建物包括5'至3'的以下元件： 第二植物啟動子； 與所述第二植物啟動子操作性相連的Cas蛋白的編碼序列，并且所述Cas蛋白的是N 端、C端或兩側(cè)與核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；和 植物轉(zhuǎn)錄終止子。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一亞核酸構(gòu)建物的數(shù)量為一個(gè)或者 多個(gè)（針對多個(gè)待切割位點(diǎn)），并與第二亞核酸構(gòu)建物是相互獨(dú)立的，或是一體的。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的第二植物啟動子和與所述所述Cas蛋 白的編碼序列之間5'至3'還操作性相連有： 第三亞核酸構(gòu)建物，較佳地，所述的第三亞核酸構(gòu)建物為來源于番茄矮壯病毒（TBSV) 的p 19蛋白編碼序列；和 自剪切序列，較佳地，所述的自剪切序列為2A多肽編碼序列（SEQ ID NO. : 98)。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述定點(diǎn)修飾包括： (i) 在沒有供體DNA的情況下，對植物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)插入和缺失；和 (ii) 在存在供體DNA的情況下，以供體DNA為模板，對植物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行精確插 入、缺失或者替換DNA序列； 較佳地，所述定點(diǎn)修飾包括對植物基因組的基因敲除，基因敲入（轉(zhuǎn)基因）以及調(diào)控 (上調(diào)或下調(diào)）內(nèi)源基因的表達(dá)水平。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括單子葉植物、雙子葉植物和 裸子植物； 較佳地，所述的植物包括林業(yè)植物、農(nóng)用植物、經(jīng)濟(jì)作物、觀賞植物。
7. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的第一植物啟動子為RNA聚合酶III依 賴的啟動子。
8. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的第二植物啟動子為RNA聚合酶 II依賴的啟動子，較佳地，包括組成型表達(dá)的啟動子或擬南芥生殖細(xì)胞特異性表達(dá)的 sporocyteless(SPL)啟動子。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：檢測所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞 中基因組的突變或修飾情況。
10. -種用于植物基因組定點(diǎn)修飾的核酸構(gòu)建物，其特征在于，所述核酸構(gòu)建物包括第 一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物，其中第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物是相互 獨(dú)立的，或是一體的； 其中，第一亞核酸構(gòu)建物包括從5'至3'的以下元件： 第一植物啟動子； 與所述第一植物啟動子操作性相連的嵌合RNA的編碼序列，所述嵌合RNA的編碼序列 的結(jié)構(gòu)如式I所示： A-B (I) 式中， A 為編碼 CRISPR RNA(crRNAs)的 DNA 序列； B 為編碼反式作用型 crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)的 DNA 序列； 表示A和B之間的連接鍵或連接序列；其中，由所述嵌合RNA的編碼序列轉(zhuǎn)錄形成 一個(gè)完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA);和 RNA轉(zhuǎn)錄終止子； 第二亞核酸構(gòu)建物包括5'至3'的以下元件： 第二植物啟動子； 與所述第二植物啟動子操作性相連的Cas蛋白的編碼序列，并且所述Cas蛋白的是N 端、C端或兩側(cè)與核定位序列（NLS序列）融合的融合蛋白；和 植物轉(zhuǎn)錄終止子。
11. 如權(quán)利要求10所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，所述的第一亞核酸構(gòu)建物和第二 亞核酸構(gòu)建物是一體的。
12. 如權(quán)利要求10所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，所述的第一亞核酸構(gòu)建物的數(shù)量 為一個(gè)或者多個(gè)（針對多個(gè)待切割位點(diǎn)）。
13. -種載體，其特征在于，所述載體攜帶權(quán)利要求10所述的核酸構(gòu)建物； 或一種載體組合，其特征在于，所述載體組合包括第一載體和第二載體，其中第一載體 攜帶權(quán)利要求10所述的核酸構(gòu)建物的第一亞核酸構(gòu)建物，而第二載體攜帶權(quán)利要求10所 述的核酸構(gòu)建物的第二亞核酸構(gòu)建物。
14. 一種基因工程的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有權(quán)利要求13中所述的載體或載 體組合；或所述的植物細(xì)胞的基因組中整合有權(quán)利要求10所述的核酸構(gòu)建物。
15. -種制備植物的方法，其特征在于，包括步驟： 將權(quán)利要求14所述的植物細(xì)胞再生成形成植株。
【文檔編號】C12N5/10GK104293828SQ201410334460
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】朱健康, 毛妍斐, 馮爭艷, 張波濤 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院