本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及可調(diào)控植物早花的早實(shí)枳ptagl24基因的分離及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

開(kāi)花結(jié)實(shí)是開(kāi)花植物生命周期中重要的生物學(xué)過(guò)程，是植物自身發(fā)育過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，亦是果樹(shù)生產(chǎn)及果業(yè)產(chǎn)品加工的基礎(chǔ)。柑橘是一種在熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的常綠果樹(shù)，也是居于世界第一位的水果，其產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益決定了它在整個(gè)果樹(shù)生產(chǎn)中的地位。由于柑橘有著相對(duì)較長(zhǎng)的童期，再加上傳統(tǒng)的柑橘育種中存在著珠心胚干預(yù)、部分生殖器官敗育、在遺傳方面極度雜合等問(wèn)題，使得柑橘的雜交育種比較困難，育種周期延長(zhǎng)，柑橘新品種的選育工作進(jìn)展緩慢，短時(shí)期內(nèi)難以滿足市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)柑橘的需求。因此探索柑橘成花轉(zhuǎn)變的內(nèi)在機(jī)理，縮短童期，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)柑橘花期的調(diào)控，改變果實(shí)的成熟期，對(duì)于加速柑橘遺傳改良、提高柑橘經(jīng)濟(jì)效益有著潛在的重大意義。

植物成花發(fā)育過(guò)程受眾多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，mads‐box家族是其中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，它的成員幾乎遍及所有真核生物(shoreetal.1995)。在擬南芥中，絕大多數(shù)控制成花轉(zhuǎn)變和花器官發(fā)育的基因都屬于mads‐box家族，如兩個(gè)關(guān)系密切的成員agl24和svp，它們?cè)谥参锇l(fā)育的各階段都起著重要作用(gregisetal.2008)。盡管agl24和svp同屬mads‐box基因家族，有著很高的序列相似性，且都在成花轉(zhuǎn)變前的營(yíng)養(yǎng)組織中有表達(dá)，但它們?cè)谡{(diào)控成花方面卻起著相反的作用(hartmannetal.2000；yuetal.2002)。agl24是一個(gè)成花促進(jìn)因子，它的表達(dá)受到光周期、春化作用的誘導(dǎo)，在成花轉(zhuǎn)變期的花序頂端被逐步上調(diào)；svp則在營(yíng)養(yǎng)發(fā)育時(shí)期的莖端分生組織中表達(dá)，以維持莖端營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)特性，svp能夠感受環(huán)境溫度的變化并影響microrna172的表達(dá)(leeetal.2010；michaelsetal.2003)。svp通過(guò)與flc形成復(fù)合體直接作用于成花整合因子soc1、ft的dna序列并下調(diào)它們的表達(dá)，進(jìn)而起到抑制成花的作用。相反，agl24與soc1形成一個(gè)相互調(diào)控的反饋環(huán)，通過(guò)直接互作形成復(fù)合體直接激活下游lfy的表達(dá)。同時(shí)，它還參與植物開(kāi)花的表觀調(diào)控過(guò)程，agl24、soc1通過(guò)與組蛋白去乙?；竤ap1的互作，抑制sep3組蛋白h3的乙?；?，促進(jìn)成花轉(zhuǎn)變(liuetal.2009)。

目前，agl24/svp的同源基因在各物種中相繼被分離，在功能上存在著一定差別。例如，金魚草的incomposita(inco)基因控制先出葉的發(fā)育及花分生組織的特征(masieroetal.2004)；洋酸漿的mpf1影響植株結(jié)構(gòu)及種子的發(fā)育(heetal.2010)；大麥的bm1在節(jié)間和節(jié)點(diǎn)部位具有高水平的轉(zhuǎn)錄(schmitzetal.2000)；水稻中osmads55和osmads22協(xié)同參與油菜素內(nèi)酯的響應(yīng)調(diào)控(leeetal.2008)。然而，這些基因的過(guò)表達(dá)均表現(xiàn)出類似35s::agl24或35s::svp的表型(liuetal.2007)，說(shuō)明stmads亞家族成員在控制成花方面可能存在共有的機(jī)制。因此，研究與擬南芥關(guān)系較遠(yuǎn)的物種，尤其是多年生木本植物中成花相關(guān)基因的功能，對(duì)于了解其成花機(jī)制具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是從早實(shí)枳(梁遂權(quán)等，1999；zhangetal.2011)中分離出擬南芥agl24的同源基因及調(diào)控其表達(dá)的啟動(dòng)子，并對(duì)其同源序列進(jìn)行比對(duì)、時(shí)空表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位、異位表達(dá)等進(jìn)行了分析。并通過(guò)對(duì)其啟動(dòng)子的空間表達(dá)分析，證實(shí)了該基因在早實(shí)枳成花發(fā)育過(guò)程中充當(dāng)重要角色，為進(jìn)一步揭示柑橘及多年生植物的早花機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。

申請(qǐng)人將分離克隆的基因命名為ptagl24基因(orange1.1g027190m)；把分離出來(lái)的ptagl24基因的啟動(dòng)子命名為ptagl24p。早實(shí)枳中ptagl24基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，序列長(zhǎng)度為825bp。遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥后，可以明顯提早植物的成花時(shí)間，對(duì)于縮短多年生果樹(shù)的童期及作物的遺傳改良有重要意義。同時(shí)分離并克隆了該基因的啟動(dòng)子序列，其核苷酸序列如seqidno：3所示，序列長(zhǎng)度為1996bp。啟動(dòng)子的空間表達(dá)進(jìn)一步表明ptagl24基因可調(diào)控植物的整個(gè)發(fā)育過(guò)程，也參與到植物響應(yīng)低溫脅迫的途徑中。

具體地，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

申請(qǐng)人通過(guò)基因克隆技術(shù)從早實(shí)枳中分離得到agl24的同源基因ptagl24(其核苷酸序列如seqidno：1所示)。同時(shí)參照柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合染色體步移技術(shù)分離得到該基因的啟動(dòng)子，其核苷酸序列如seqidno：2所示，序列長(zhǎng)度為1996bp。rt‐pcr顯示ptagl24在各組織中都有表達(dá)，在成熟的花器官中相對(duì)表達(dá)高一些；亞細(xì)胞定位顯示ptagl24蛋白主要定位于細(xì)胞核中，表明ptagl24是作為轉(zhuǎn)錄因子起作用的；通過(guò)在擬南芥中超表達(dá)該基因發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系根據(jù)其花器官形態(tài)特征可分為兩類，i類轉(zhuǎn)基因株系不僅表現(xiàn)為早花，而且在葉片及生殖器官的形態(tài)上也發(fā)生了改變；ii類轉(zhuǎn)基因株系只表現(xiàn)為早花，生殖組織在形態(tài)上則與野生型相似。

對(duì)構(gòu)建的ptagl24p融合gus基因載體的異位轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都能檢測(cè)到gus基因不同強(qiáng)度的表達(dá)，ptagl24的啟動(dòng)子在胚根突破種皮時(shí)開(kāi)始表達(dá)，并且在幼苗期活性較強(qiáng)一些。通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)具有響應(yīng)低溫的元件，因此對(duì)轉(zhuǎn)ptagl24p的擬南芥進(jìn)行低溫處理，表明ptagl24的啟動(dòng)子是可以受到環(huán)境低溫誘導(dǎo)的。啟動(dòng)子的分析從側(cè)面也反映了ptagl24基因除了調(diào)控植物的生殖生長(zhǎng)外，可能還對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)有一定的調(diào)控作用。

獲得本發(fā)明所示基因及啟動(dòng)子的主要步驟如下：

(1)參考柑橘基因組搜索agl24的同源基因，獲得ptagl24的基因序列。

(2)通過(guò)熒光定量pcr和半定量pcr檢測(cè)ptagl24的時(shí)空表達(dá)。

(3)融合gfp蛋白對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化。

(4)參考柑橘基因組克隆ptagl24啟動(dòng)子的核苷酸序列。

(5)利用生物信息學(xué)方法分析該啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。

(6)構(gòu)建ptagl24超表達(dá)載體和ptagl24啟動(dòng)子融合gus基因的載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥。

(7)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行抗性篩選及移栽。

(8)對(duì)超表達(dá)陽(yáng)性植株進(jìn)行表型觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

(9)對(duì)啟動(dòng)子陽(yáng)性植株進(jìn)行g(shù)us染色分析。

(10)低溫處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因擬南芥中g(shù)us活性定量檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明得到可使植物早花的ptagl24基因，利用該基因構(gòu)建了超表達(dá)載體pcambia1301+ptagl24，該表達(dá)載體上含有seqidno：1所示的核苷酸序列，通過(guò)轉(zhuǎn)化植物，獲得了轉(zhuǎn)ptagl24基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)化植株。該ptagl24基因可用于調(diào)控植物的開(kāi)花，縮短植物的開(kāi)花時(shí)間，使童期明顯變短，可應(yīng)用于果樹(shù)的花期調(diào)控和品種改良。

(2)本發(fā)明得到調(diào)控ptagl24基因的特異啟動(dòng)子ptagl24p，利用ptagl24基因的啟動(dòng)子融合gus基因得到的重組載體pcambia1391+ptagl24p，該重組載體含有seqidno：3所示的核苷酸序列，可受到環(huán)境低溫的誘導(dǎo)。獲得的ptagl24p轉(zhuǎn)基因植株在胚根突破種皮后就能檢測(cè)到gus活性，從側(cè)面反映ptagl24基因在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用。

附圖說(shuō)明

序列表seqidno：1是本發(fā)明分離克隆的ptagl24基因的核苷酸序列。序列長(zhǎng)度為825bp。其中該序列的49‐732堿基處所述的序列是該基因的編碼框(cds)。

序列表seqidno：2是ptagl24基因編碼的蛋白序列。序列長(zhǎng)度為227aa。

序列表seqidno：3是本發(fā)明分離克隆的ptagl24基因啟動(dòng)子的核苷酸序列。序列長(zhǎng)度為1996bp。

圖1：是本發(fā)明的技術(shù)路線圖。

圖2：是ptagl24基因序列及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖2中的a圖是ptagl24與mads蛋白亞家族其它成員的氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果；圖2中的b圖是ptagl24及其同源基因的基因結(jié)構(gòu)示意圖；圖2中的c圖是ptagl24蛋白mads‐box區(qū)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

圖3：是成年早實(shí)枳中ptagl24的表達(dá)分析。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖3中的a圖是ptagl24在不同組織根、莖、葉、花、果、頂芽和側(cè)芽的表達(dá)量；圖3中的b圖是ptagl24在花不同部位即花托、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊和心皮中的表達(dá)量；圖3中的c圖是在花發(fā)育不同階段ptagl24的表達(dá)。標(biāo)尺為5mm。

圖4：是ptagl24亞細(xì)胞定位的結(jié)果。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖4中的a圖是35s::ptagl24‐gfp融合載體及35s::gfp載體示意圖；圖4中的b圖是ptagl24蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位。

圖5：是在長(zhǎng)日照條件下ptagl24轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析結(jié)果。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖5中的a圖是i型轉(zhuǎn)ptagl24植株(右)與野生型(左)相比加速成花；圖5中的b圖是野生型及轉(zhuǎn)基因植株花序出現(xiàn)前葉片形態(tài)(倒三角代表童期向成年期的轉(zhuǎn)變)；圖5中的c圖是開(kāi)花期野生型的花序；圖5中的d圖和e圖是野生型(左)、具有苞片狀萼片結(jié)構(gòu)的i型轉(zhuǎn)基因植株(中)及與野生型相似的ii型轉(zhuǎn)基因植株花和角果的比較；圖5中的f圖和g圖是i型轉(zhuǎn)基因植株授粉后的單花及成熟的花；圖5中的h圖和i圖是i型ptagl24轉(zhuǎn)基因植株花序及成熟花的電鏡結(jié)構(gòu)；圖5中的j圖是ptagl24轉(zhuǎn)基因株系萼片茸毛富集的電鏡結(jié)構(gòu)；圖5中的k圖和l圖是野生型植株及i型轉(zhuǎn)基因植株萼片表面細(xì)胞結(jié)構(gòu)；圖5中的m圖和n圖是野生型植株及i型轉(zhuǎn)基因植株心皮表面細(xì)胞結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺：a‐g為1mm；h‐n為50μm。

圖6：采用place軟件(公開(kāi)使用軟件)分析早實(shí)枳ptagl24基因啟動(dòng)子側(cè)翼序列結(jié)構(gòu)。

圖7：是轉(zhuǎn)ptagl24p基因擬南芥中g(shù)us蛋白的化學(xué)組織染色。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖7中的a圖至h圖是轉(zhuǎn)基因擬南芥在萌發(fā)后1、2、3、5、7、14、21及28d的組織化學(xué)染色；圖7中的i圖和j圖是在主根和側(cè)根中的gus表達(dá)；圖7中的k圖至o圖是在蓮座葉、莖生葉、花和角果中均能檢測(cè)到gus染色，但在成熟的種子中未能檢測(cè)到。標(biāo)尺＝500μm(a,b,j,o)，1mm(c‐i,k‐n)。

圖8：是ptagl24p轉(zhuǎn)基因擬南芥中g(shù)us活性定量檢測(cè)。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖8中的a圖是正常生長(zhǎng)(nv)和低溫處理(v)條件下不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)基因植株中的gus活性；圖8中的b圖是生長(zhǎng)40d的轉(zhuǎn)基因植株不同組織根、蓮座葉、莖生葉、莖、花和角果中的gus表達(dá)。

圖9：是原始載體pcambia1302的圖譜。

圖10：是原始載體pcambia1301圖譜和本發(fā)明構(gòu)建的重組載體pcambia1301+ptagl24的圖譜。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖10中的a圖是原始載體pcambia1301的圖譜；圖10中的b圖是構(gòu)建的重組載體pcambia1301+ptagl24的圖譜。

圖11：是原始載體pcambia1391圖譜和本發(fā)明構(gòu)建的重組載體pcambia1391+ptagl24p的圖譜。附圖標(biāo)記說(shuō)明：圖11中的a圖是原始載體pcambia1391的圖譜；圖11中的b圖是構(gòu)建的重組載體pcambia1391+ptagl24p的圖譜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1早實(shí)枳ptagl24基因的分離與序列分析

本實(shí)施例為了獲得柑橘中agl24的同源基因，利用擬南芥agl24基因(geneid為at4g24540)的cds序列在甜橙的數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝org_csinensis)中進(jìn)行blast搜索，獲得同源性最高的序列即為柑橘中agl24基因(geneid為orange1.1g027190m)的核苷酸序列，并用primer5.0軟件按照一般設(shè)計(jì)引物的原則在該基因的5'‐utr區(qū)和3'‐utr區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行全長(zhǎng)cdna序列的擴(kuò)增。

以早實(shí)枳(取材于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園，文獻(xiàn)來(lái)源：梁遂權(quán)等，1999；zhangetal.2011)為材料抽提rna及反轉(zhuǎn)錄，所得的第一鏈cdna用于擴(kuò)增ptagl24基因的全長(zhǎng)。rna的抽提使用trizol試劑盒(購(gòu)自invitrogen公司；按照該試劑盒提供的操作說(shuō)明書操作)。抽提的3μg總rna樣品經(jīng)1u的dnasei(購(gòu)自invitrogen公司)室溫處理15min后，加入1μledta(25mm)，于65℃溫育10min。第一鏈cdna的合成用mbi反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自fermentas公司，按照試劑盒說(shuō)明書操作)。擴(kuò)增基因ptagl24引物對(duì)為：正向引物：5'‐ggctttaggttactgtgatc‐3'；反向引物：5'‐tccataaacacaacagcatct‐3'。25μl的反應(yīng)體系中包括100ngcdna，1×緩沖液，2.5mmmgcl2,0.25mmdntp，0.5utaq聚合酶(前述緩沖液和taq聚合酶均購(gòu)自fermentas公司)，加0.5μm上述的正向和反向引物。pcr反應(yīng)在abi9700(appliedbiosystem)擴(kuò)增儀上按以下程序完成：94℃,5min；94℃變性30s，60℃退火50s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)完成后72℃延伸15min。產(chǎn)生一條單一pcr條帶產(chǎn)物，經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，用dna凝膠回收試劑盒(購(gòu)自omega公司，美國(guó))回收特異帶，提取步驟參照試劑盒使用說(shuō)明。回收純化的dna溶液與pmd18‐t載體(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，按說(shuō)明書操作。連接反應(yīng)體系中插入ptagl24基因與 pmd18‐t載體的摩爾比為3:1。連接反應(yīng)總體積是10μl，其中包括5μl的2×緩沖液(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)，4.5μl純化的pcr產(chǎn)物，0.5μlpmd18‐t載體。16℃過(guò)夜連接。取10μl連接產(chǎn)物，采用熱擊法(sambrooketal.1989)轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，在含有50mg/l氨芐霉素的lb固體平板中篩選陽(yáng)性克隆，挑取5個(gè)克隆測(cè)序(由華大基因武漢分公司完成)。測(cè)序結(jié)果表明，本發(fā)明克隆ptagl24基因全長(zhǎng)為825bp(見(jiàn)seqidno：1所示)，命名為ptagl24或ptagl24基因。

采用ncbi中的orffinder通過(guò)對(duì)該基因的編碼序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其開(kāi)放閱讀框包含684bp(如序列表seqidno：1中所示)，編碼227個(gè)氨基酸(如序列表seqidno：2所示)。如圖2中的a圖所示，與其它mads‐box蛋白(在ncbi中的序列號(hào)：ptrmads9為xp_002301093.1；phmads20為gu129907.1；agl24為nm_118587.5；ptsvp為fj373210.1；vvsvp為xm_002285651.2；svp為nm_127820.3.)相似，ptagl24同樣包含高度保守的mads‐box區(qū)域和中度保守k‐box結(jié)構(gòu)。cdna與dna比對(duì)結(jié)果表明，ptagl24基因同樣具有結(jié)構(gòu)的保守性，在一致的位點(diǎn)存在8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子(圖2中的b圖)。ptagl24蛋白mads‐box區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)包含一個(gè)螺旋和兩個(gè)折疊區(qū)域(圖2中的c圖)。這些結(jié)果表明ptagl24基因在序列上是很保守的。

實(shí)施例2ptagl24啟動(dòng)子的克隆和生物信息學(xué)分析

參照甜橙基因組，找出ptagl24基因的上游啟動(dòng)子序列，采用軟件primer5.0按照一般設(shè)計(jì)引物的原則設(shè)計(jì)引物，并用ctab法提取早實(shí)枳葉片的基因組dna，dna提取的方法參照程運(yùn)江報(bào)道的方法(chengetal.2003)。以此dna為模板，采用高保真性的taq酶進(jìn)行啟動(dòng)子的擴(kuò)增，所采用的擴(kuò)增ptagl24啟動(dòng)子的引物對(duì)的序列如下所示：

正向引物：5'‐gataagataaatcggaaat‐3'

反向引物：5'‐aataatatataataagcaga‐3'

擴(kuò)增到的啟動(dòng)子片段用1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，目的片段按瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司)操作說(shuō)明書進(jìn)行回收純化，再進(jìn)行at克隆，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行pcr檢測(cè)，然后再送樣并進(jìn)行測(cè)序(由華大基因武漢分公司完成))。隨后將測(cè)序結(jié)果與已知數(shù)據(jù)庫(kù)里面的dna序列進(jìn)行對(duì)比，以保證序列的一致性。本發(fā)明得到的啟動(dòng)子的序列如seqidno：3所示，并采用在線分析軟件place(http://www.dna.affrc.go.jp/place/index.html)對(duì)ptagl24基因的啟動(dòng)子序列中的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)；啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用neuralnetworkpromoterpredicition(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)進(jìn)行預(yù)測(cè)。如圖6所示，是分離到的起始密碼子atg上游約1.6kb的側(cè)翼序列，并預(yù)測(cè)到一些與脅迫相關(guān)的調(diào)控元件和一些組織特異性表達(dá)的元件(對(duì)圖6部分匯總的結(jié)果見(jiàn)表1)。

表1ptagl24啟動(dòng)子上的順式作用元件

實(shí)施例3ptagl24蛋白的亞細(xì)胞定位

(1)載體的準(zhǔn)備：通過(guò)使用psort程序預(yù)測(cè)到ptagl24蛋白可能定位于細(xì)胞核中，為驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)結(jié)果，就構(gòu)建了ptagl24的編碼序列與gfp蛋白融合的載體。根據(jù)pcambia1302載體(購(gòu)自澳大利亞的cambia實(shí)驗(yàn)室)的多克隆位點(diǎn)和ptagl24序列，用primerpremier5.0軟件按照一般設(shè)計(jì)引物的原則設(shè)計(jì)出擴(kuò)增ptagl24的引物，在正向引物和反向引物的5'端分別加入ncoi的酶切位點(diǎn)(見(jiàn)表3)。引物序列為：

正向引物：5'‐ccatggggctttaggttactgtgatc‐3'；

反向引物：5'‐ccatgggctggagtagggaagcccta‐3'(注：小寫字母為加入的酶切位點(diǎn))。

以實(shí)施案例1獲取的ptagl24連pmd18‐t(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)的菌液為模板進(jìn)行ptagl24的擴(kuò)增。pcr反應(yīng)條件為：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，90s；72℃，10min。35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增的片段重新連接pmd18‐t并提取質(zhì)粒。對(duì)載體pcambia1302和片段連接pmd18‐t的質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，酶切體系：反應(yīng)總體積為20μl，其中含有pcr的純化產(chǎn)物10μl，10×m緩沖液(購(gòu)自mbi公司)2μl，ncoi內(nèi)切酶2μl，雙蒸水6μl。在37℃酶切3h后分別純化回收。連接反應(yīng)體系中插入ptagl24的片段與載體pcambia1302的摩爾比為3:1，反應(yīng)總體積為10μl，其中含有10×buffer1μl，t4dna連接酶1μl，ptagl24的雙酶切回收產(chǎn)物4μl，pcambia1302載體的雙酶切回收產(chǎn)物2μl，雙蒸水2μl。在16℃反應(yīng)14‐16小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株dh5α，在含有50mg/l卡那霉素的lb固體平板中篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切及pcr鑒定，測(cè)序確定沒(méi)有突變，獲得含有插入目的片段的中間載體，將其命名為pcambia1302+ptagl24‐gfp，提取質(zhì)粒并置于‐20℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)洋蔥表達(dá)材料的制備：將新鮮洋蔥的鱗莖切成1cm²左右的小塊，75％酒精消毒8‐10min，取出后在滅菌超純水中清洗2‐3次，用鑷子小心撕下內(nèi)表皮，置于ms固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)備用。

(3)金粉處理及微彈的制備：稱取60mg金粉置于1.5ml離心管中，加入1ml75％酒精振蕩懸浮兩次，高速離心后棄去酒精，用滅菌超純水清洗2‐3次，并懸浮于滅菌水中；取10μl金粉懸浮液，向其中加入1‐2μg目的質(zhì)粒pcambia1302+ptagl24‐gfp，混勻后再依次加入2.5mcacl210μl、0.1m亞精胺4μl，振蕩混勻后冰上靜置5min，短暫離心后棄凈上清；加入60μl預(yù)冷的無(wú)水乙醇，振蕩懸浮后離心并棄上清；最后加入10‐20μl無(wú)水乙醇，充分懸浮備用。

(4)基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化及熒光檢測(cè)：轟擊前首先對(duì)基因槍阻擋網(wǎng)、微彈載體等裝置進(jìn)行滅菌處理，并開(kāi)機(jī)預(yù)熱；將包被質(zhì)粒的金粉懸浮液均勻點(diǎn)布于微彈載體上，并在超凈臺(tái)上晾干；將載有洋蔥表皮的培 養(yǎng)皿置于樣品室內(nèi)，調(diào)整射程并抽真空；當(dāng)壓力達(dá)到一定值時(shí)進(jìn)行轟擊；排氣后取出樣品，封皿。轉(zhuǎn)化后的表皮細(xì)胞置于ms固體培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)24h，用4,6‐二脒基‐2‐苯基吲哚(dapi)染色10min，在熒光顯微鏡下對(duì)gfp及dapi熒光進(jìn)行觀察拍照。

結(jié)果分析：如圖4所示，gfp熒光圖片表明，和預(yù)測(cè)結(jié)果一致，35s::ptagl24‐gfp融合蛋白主要定位于細(xì)胞核中；而空載對(duì)照的gfp信號(hào)則在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都存在。這表明ptagl24蛋白主要作為轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。

實(shí)施例4ptagl24基因的表達(dá)分析

為進(jìn)一步了解ptagl24的潛在作用，利用定量和半定量檢測(cè)了該基因在不同組織及不同階段的表達(dá)模式。取早實(shí)枳的根、莖、葉、不同時(shí)期發(fā)育的花、果、頂芽及側(cè)芽，花不同部位的分離外植體在冰上操作。rna的提取及反轉(zhuǎn)錄步驟見(jiàn)實(shí)施例1。為進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)(為常規(guī)方法)，取2‐3μg總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后按照體積比為1:5的比例對(duì)pcr產(chǎn)物稀釋，取1μl作為模板，采用lightcycle^tm480熒光定量pcr儀進(jìn)行定量分析，每個(gè)樣品作4個(gè)重復(fù)，所有結(jié)果用β‐actin(ciclev10025866m)進(jìn)行內(nèi)參校正。

由圖3結(jié)果所示，ptagl24的表達(dá)幾乎在所有被檢測(cè)的組織中都有表達(dá)(包括根、莖、葉、花、果、頂芽和側(cè)芽)，在完全開(kāi)放的花、莖及葉中的表達(dá)要比其它組織中高一些(見(jiàn)圖3中的a圖)。而且ptagl24在成熟花的各輪器官中都有表達(dá)，盡管表達(dá)水平不同(見(jiàn)圖3中的b圖)。另外對(duì)ptagl24在花器官發(fā)育不同時(shí)期檢測(cè)，如圖3中的c圖所示，ptagl24在花發(fā)育成熟時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平比前期高一些。這些結(jié)果暗示了早實(shí)枳ptagl24基因可能同時(shí)參與了營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)過(guò)程。

實(shí)施例5ptagl24對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化

(1)載體的構(gòu)建：為了揭示ptagl24基因在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，對(duì)該基因進(jìn)行了異位表達(dá)分析。載體的構(gòu)建同實(shí)施例3所示，不同之處見(jiàn)表3，所用的表達(dá)載體是pcambia1301(購(gòu)自澳大利亞的cambia實(shí)驗(yàn)室)，酶切位點(diǎn)為ncoi和bsteii。把構(gòu)建好的重組載體命名為pcambia1301+ptagl24。應(yīng)用凍融法將重組載體pcambia1301+ptagl24導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株eha105，并將農(nóng)桿菌菌液置于‐80℃下保存?zhèn)溆茫员銘?yīng)用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化。

(2)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化：播種前將滅菌的營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按體積比為3:1進(jìn)行混合拌土，用營(yíng)養(yǎng)液(按常規(guī)方法)泡濕并分裝于營(yíng)養(yǎng)缽中。將打破休眠的col擬南芥種子用槍頭點(diǎn)播在營(yíng)養(yǎng)土上面，每角點(diǎn)播2‐3個(gè)種子，同時(shí)用薄膜進(jìn)行覆蓋保濕。3‐4d后揭膜后，在正常長(zhǎng)日照條件(16h光照/8h黑暗)培養(yǎng)，室溫23℃左右。擬南芥植株的轉(zhuǎn)化采用花序浸染法(zhangetal.2006)，在主枝抽苔4‐5cm時(shí)剪去主枝頂端，促進(jìn)更多側(cè)枝的生長(zhǎng)且生長(zhǎng)一致，約4‐5d后可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化的前一天澆足水。將保存的農(nóng)桿菌(eha105)菌種進(jìn)行活化，28℃，250r/min搖24h。再將活化的菌種接種到50ml含有50mg/l的卡那霉素和25mg/l的利福平的lb液體培養(yǎng)基中，28℃，250r/min過(guò)夜，至菌液為金黃色時(shí)取出。5000r/min離心10min棄上清，收集細(xì)胞，加入5％蔗糖溶液懸浮菌體使od600＝0.8～1.0，再向菌液中加入0.05％sliwetl‐77以提高轉(zhuǎn)化的效率，混勻后開(kāi)放的花序在菌液中浸泡30s‐1min。將轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株澆少量水，并置于黑暗條件下培養(yǎng)24h，后轉(zhuǎn) 入正常條件下。之后再用上述同樣的方法浸染2‐3次，待種子成熟后37℃烘干，并4℃保存。

(3)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗性篩選：將轉(zhuǎn)基因的擬南芥種子在4℃下放置3天后即可篩選，擬南芥種子先用75％酒精進(jìn)行表面消毒3min，再用2％次氯酸鈉溶液消毒8min，無(wú)菌水沖洗3次，最后一次用無(wú)菌水浸泡種子1‐2小時(shí)以促進(jìn)種子的萌發(fā)。然后用滅菌的0.1％的瓊脂糖溶液懸浮種子，使種子均勻的鋪在含有50mg/l羧芐霉素和25mg/l潮霉素的1/2ms培養(yǎng)基平板上篩選。當(dāng)幼苗長(zhǎng)到15天左右時(shí)即可看到篩選出來(lái)的苗子，長(zhǎng)勢(shì)好、健壯且根系發(fā)達(dá)的一般是陽(yáng)性苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)出4‐5片葉子時(shí)，用清水洗掉根上的培養(yǎng)基并移栽于培養(yǎng)土中，待苗子長(zhǎng)到一定大小時(shí)，對(duì)t1代苗進(jìn)行pcr鑒定。t1代種子會(huì)由于染色體的自由組合出現(xiàn)性狀分離，故用相同的篩選方法篩選t2代可去除非抗性苗，再對(duì)t2代苗進(jìn)行dna和rna水平上的驗(yàn)證，最后用t3代陽(yáng)性苗進(jìn)行表型觀察及統(tǒng)計(jì)。

(4)結(jié)果分析：通過(guò)擬南芥的轉(zhuǎn)化篩選，在t1代獲得了16株陽(yáng)性株系，從中隨機(jī)選取了8個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系播種，并對(duì)其后代進(jìn)行表型統(tǒng)計(jì)。與野生型相比，幾乎所有轉(zhuǎn)基因株系的成花轉(zhuǎn)變都明顯提前(見(jiàn)表2)。如圖5中的b圖所示：轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉的葉型相對(duì)于野生型要偏圓、偏小一些。根據(jù)各轉(zhuǎn)基因株系花器官形態(tài)的變化，將其分為兩種類型(如表2所示)：i型轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為明顯早花且花器官形態(tài)發(fā)育異常(表2；圖5中的a圖)；ii型的轉(zhuǎn)基因植株只表現(xiàn)為明顯的早花，沒(méi)有花器官的變異。野生型擬南芥的花蕾或花的萼片表面通常沒(méi)有或附著較少的茸毛(圖5中的b圖,c圖)；而i型轉(zhuǎn)基因植株花器官的萼片則發(fā)育成類似葉片狀的結(jié)構(gòu)且表面著生較多的茸毛(圖5中的d‐f圖)，并且這種葉狀萼片在完成授粉后不脫落，而是隨著花的發(fā)育繼續(xù)伸展(圖5中的f圖,g圖)。盡管ii型35s::ptagl24轉(zhuǎn)基因植株在花的形態(tài)上沒(méi)有明顯變化，但它們同樣表現(xiàn)為早花且萼片附著有輕微的茸毛(表2；圖5中的d圖)。

通過(guò)電鏡掃描能更真實(shí)地反應(yīng)細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，對(duì)i型轉(zhuǎn)基因植株及野生型花器官結(jié)構(gòu)進(jìn)行了電鏡分析。掃描結(jié)果同樣證實(shí)了該類型轉(zhuǎn)基因植株花器官發(fā)育的異常及萼片表面茸毛的富集(圖5中的h‐j圖)。野生型植株萼片的表皮通常是規(guī)則的細(xì)胞類型(圖5中的k圖)，而i型轉(zhuǎn)基因植株的萼片表面則沒(méi)有這種規(guī)則形狀的細(xì)胞，主要呈現(xiàn)出彎曲和波浪狀的表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)(圖5中的m圖)。而且，它們心皮的表面形態(tài)也和野生型有所不同(圖5中的l圖,n圖)。

表2異位表達(dá)ptagl24轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型統(tǒng)計(jì)

實(shí)施例6利用ptagl24啟動(dòng)子對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化及gus的活性定量檢測(cè)

(1)載體構(gòu)建：為了驗(yàn)證ptagl24啟動(dòng)子的空間表達(dá)，本發(fā)明構(gòu)建了ptagl24啟動(dòng)子啟動(dòng)gus基因 的載體。載體的構(gòu)建參照實(shí)施例3。不同的是本實(shí)施例所用的載體是pcambia1391(購(gòu)自澳大利亞的cambia實(shí)驗(yàn)室)，雙酶切位點(diǎn)是bamhi和ecori。獲得了含有插入目的片段的重組載體，將其命名為重組載體pcambia1391+ptagl24p，應(yīng)用凍融法將重組載體pcambia1391+ptagl24p導(dǎo)入到農(nóng)桿菌eha105中。

(2)擬南芥的轉(zhuǎn)化及篩選參考實(shí)施例5。

(3)結(jié)果分析：通過(guò)對(duì)t2代陽(yáng)性苗進(jìn)行g(shù)us組織染色。如圖7所示在轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育過(guò)程中，萌發(fā)期間吸水膨脹的種子未檢測(cè)到gus染色，一旦胚根突破種皮，便在胚根和內(nèi)部子葉中均能看到gus染色，而且較強(qiáng)的gus表達(dá)主要集中在根毛區(qū)(圖7中a圖,b圖)。在兩片子葉期的幼苗中，根和下胚軸呈現(xiàn)出較深的gus染色，而子葉和上胚軸染色較淺一些(圖7中的c圖,d圖)。隨著幼苗的生長(zhǎng)，萌發(fā)后7到14d幼苗在子葉和真葉中的gus染色逐漸加深(圖7中的e圖,f圖)；隨后gus信號(hào)貫穿整個(gè)成年期的植株(圖7中的g圖,h圖)。在成年各組織中，除成熟的種子未發(fā)現(xiàn)gus染色外，其它各部位均能檢測(cè)到gus染色(圖7中的i‐o圖)。在根中，較強(qiáng)的gus表達(dá)主要局限于主根和側(cè)根的維管組織，根毛和根冠上無(wú)gus表達(dá)(圖7中的j圖)；蓮座葉和莖生葉的葉脈中的gus表達(dá)較其它區(qū)域高一些(圖7中的k圖,l圖)；生殖組織中的gus染色也呈現(xiàn)不均勻的分布，成熟花中的gus染色主要集中在萼片、雄蕊和柱頭，而幼果中的gus染色主要出現(xiàn)在果柄離層區(qū)和柱頭頂部，并隨著角果的生長(zhǎng)在果柄和果莢上的染色有所擴(kuò)展(圖7中的m圖,n圖)。表明ptagl24啟動(dòng)子在胚根突破種皮時(shí)便開(kāi)始表達(dá)，隨后貫穿植株發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，且在幼苗期的表達(dá)活性相對(duì)高一些。

表3本發(fā)明所用的引物、載體和酶切位點(diǎn)信息匯總表

注：表3中的引物序列的前面幾個(gè)小寫字母分別是對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)的序列。

為更準(zhǔn)確地反映轉(zhuǎn)基因擬南芥中g(shù)us表達(dá)的強(qiáng)度，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的gus活性進(jìn)行了熒光分析，首先對(duì)不同發(fā)育階段樣品提取蛋白后進(jìn)行活性檢測(cè)。根據(jù)這一結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在萌發(fā)后7d和14d的幼苗中g(shù)us活性相對(duì)較高，隨后下降到一個(gè)相似的水平(圖8中的a圖)。在成年植株各組織中，花中的gus活性最高，大約是莖生葉的2.6倍；并且根中的gus表達(dá)相對(duì)其它營(yíng)養(yǎng)組織要高一些(圖8中的b圖)。實(shí)施例2在對(duì)ptagl24啟動(dòng)子分析時(shí)注意到其序列含有低溫或脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件(見(jiàn)表1和圖6)，接著又進(jìn)一步調(diào)查了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫的響應(yīng)情況。將萌發(fā)后的幼苗置于4℃長(zhǎng)日照條件下處理4周，然后轉(zhuǎn)入正常條 件生長(zhǎng)，同時(shí)在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣檢測(cè)其gus活性變化。如圖8中的a圖所示，在處理的早期階段，gus活性相比對(duì)照有所下調(diào)，而隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)活性明顯升高，處理28d時(shí)的gus活性比對(duì)照高出近1倍，這表明ptagl24的啟動(dòng)子可能與低溫響應(yīng)有關(guān)。

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