一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測(cè)定方法。苦苣苔科植物的新鮮嫩葉；選擇番茄為主要內(nèi)參，水稻為第二內(nèi)參，并依據(jù)番茄基因組大小為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水稻基因組大小進(jìn)行重新校對(duì)；按照1ml核提取緩沖液LB01中加入20mg嫩葉的量，分別將目的植物和內(nèi)參物種的嫩葉加入核提取緩沖液LB01中，然后將嫩葉切碎，用50μm孔徑的過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾獲得細(xì)胞核懸液，置于冰上備用；再用RNA消化酶消化細(xì)胞核懸液中的RNA，然后加入碘化丙啶熒光染色，終濃度為100μg?ml-1，避光染色，染色時(shí)間為40min；然后再應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定目的植物的基因組大小。本發(fā)明能為多種苦苣科植物測(cè)定了準(zhǔn)確的基因組大小，變異系數(shù)CV低于5％，該方法重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，符合苦苣科植物學(xué)方面的研究。
【專利說(shuō)明】一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
:
[0001]本發(fā)明屬于分子遺傳與進(jìn)化研究領(lǐng)域，具體涉及一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
:
[0002]基因組大小(C-value)是指單倍體細(xì)胞核的DNA含量，基因組大小變異是物種形成和進(jìn)化的重要原動(dòng)力之一，越來(lái)越多的研究表明基因組大小在諸多關(guān)鍵的生物研究領(lǐng)域，如生態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)等方面，具有重要的理論及實(shí)際應(yīng)用意義。理論預(yù)期，基因組的大小和物種的復(fù)雜程度成正比，即越簡(jiǎn)單的物種，其基因組越小；越復(fù)雜的物種，其基因組越大。越來(lái)越多的研究表明即使是屬于同一門類的物種，它們的基因組大小的變化也可能非常大，而物種之間的復(fù)雜性卻相差不大，即所謂的"C值悖論"。為了更好的理解物種的復(fù)雜性和其基因組大小之間的關(guān)系，對(duì)基因組大小的準(zhǔn)確估計(jì)就顯得越來(lái)越重要。
[0003]流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)是測(cè)定植物基因組大小快速而有效的方法。然而，植物體內(nèi)大量次生代謝物質(zhì)的存在(如花青素等)會(huì)極大的降低PI熒光染色強(qiáng)度，嚴(yán)重影響FCM方法測(cè)定基因組大小的準(zhǔn)確性及有效性，進(jìn)而導(dǎo)致基因組大小的后續(xù)分析及應(yīng)用產(chǎn)生極大的偏差，在植物分類學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的研究中出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果及結(jié)論。因此，在測(cè)定基因組大小之前，確定目的物種最適合的FCM測(cè)定方法，包括細(xì)胞核的提取、染色等技術(shù)條件至關(guān)重要。
[0004]苦苣苔科(Gesneriaceae)植物是我國(guó)喀斯特地區(qū)的特色類群，在全世界約有150屬3700種，我國(guó)分布有58屬470余種。該科在我國(guó)的分布和特有中心在我國(guó)南方喀斯特地區(qū)，由于喀斯特地區(qū)生境的高度異質(zhì)性，苦苣苔科植物的功能性狀具有強(qiáng)烈分化，表明該屬植物是一個(gè)開(kāi)展喀斯特地區(qū)植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)的理想模式系統(tǒng)，對(duì)于研究喀斯特生物多樣性對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)與適應(yīng)具有重要意義。由于喀斯特土壤的低保水能力，周期性水資源缺乏，營(yíng)養(yǎng)貧瘠等特點(diǎn)對(duì)該地區(qū)植物物種產(chǎn)生了較強(qiáng)的選擇壓力。之前的研究表明，土壤營(yíng)養(yǎng)缺乏及非生物選擇壓力如干旱、強(qiáng)光、低溫等，可以誘導(dǎo)葉片花青素等次生代謝物質(zhì)的合成。因此，喀斯特生境的選擇壓力可能會(huì)影響FCM測(cè)定該區(qū)域植物基因組大小的準(zhǔn)確性。盡管該植物類群在我國(guó)喀斯特生境適應(yīng)進(jìn)化及資源保護(hù)研究中具有重要地位，其最適合的基因組大小測(cè)定方法尚未明確。
[0005]可見(jiàn)，優(yōu)化該類群基因組大小測(cè)定的FCM方法對(duì)于其后續(xù)生物學(xué)研究如系統(tǒng)分類學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)具有重要的理論及實(shí)際意義。明確其最適合的測(cè)定方法，才能保證基因組大小測(cè)定的準(zhǔn)確性，及后續(xù)研究如系統(tǒng)分類、與生態(tài)及適合度特征的相關(guān)性等分析的有效性，對(duì)我國(guó)喀斯特特殊生境地區(qū)特色植物類群的適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制的研究具有重要的推動(dòng)作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

:
[0006]為了解決苦苣苔科植物基因組大小準(zhǔn)確測(cè)定的技術(shù)障礙及其后續(xù)植物分類學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等研究的實(shí)際應(yīng)用，本發(fā)明的目的是提供一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測(cè)定方法。
[0007]本發(fā)明的適用于苦苣苔科植物基因組大小的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]材料準(zhǔn)備:苦苣苔科的目的植物的新鮮嫩葉；
[0009]內(nèi)參選擇:儀器調(diào)試后進(jìn)行樣品熒光強(qiáng)度及基因組大小的預(yù)測(cè)(1C約為
0.5-1.1pg),根據(jù)預(yù)測(cè)基因組大小選擇番爺(Solanum lycopersicum cv.1Stupickepolnirane>, IC = 0.98pg)為主要內(nèi)參，水稻(Oryza sativa ssp.japonica, IC = 0.43-0.45pg)為第二內(nèi)參，并依據(jù)番茄基因組大小為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水稻基因組大小進(jìn)行重新校對(duì)；
[0010]制備細(xì)胞核懸液:目的植物和內(nèi)參物種，按照Iml核提取緩沖液LBOl中加入20mg嫩葉的量，分別將目的植物和內(nèi)參物種的嫩葉加入核提取緩沖液LBOl中，然后將嫩葉切碎，用50 μ m孔徑的過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾獲得細(xì)胞核懸液，置于冰上備用，所述的核提取緩沖液 LBOl 的配方為:15mM Tris、2mM Na2EDTA、0.5mM spermine.4HCl、80mM KCl、20mM NaCl,15mM^-mercaptoethanol>0.1% (v/v) Triton X-100, pH7.5 ；
[0011 ] 再用RNA消化酶消化細(xì)胞核懸液中的RNA，RNA消化酶終濃度為50 μ g ml—1 ;然后加入碘化丙啶熒光避光染色；最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定目的植物的基因組大小。
[0012]優(yōu)選，所述碘化丙啶的終濃度為100 μ g ml-1，染色時(shí)間為40min。
[0013]本發(fā)明根據(jù)苦苣科植物的性質(zhì)，從影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基因組大小的因素入手，為多種苦苣科植物測(cè)定了準(zhǔn)確的基因組大小，變異系數(shù)CV(coefficient of variat1n)低于5%，該方法重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，符合苦苣科植物學(xué)方面的研究。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
:
[0014]圖1是采用本發(fā)明的核提取緩沖液LBOl和其他buffer (de Laat’s、Galbraith’S、General Purpose、MgS04、Partec、Tris.MgCl2 和 Woody Plant)測(cè)定線葉報(bào)春苣苔的峰圖及其CV值得比較；
[0015]圖2是24h黑暗處理和未黑暗處理對(duì)懷集報(bào)春苣苔及舌柱報(bào)春苣苔基因組大小測(cè)定(ungated未設(shè)門)的比較。
[0016] 圖3是采用本發(fā)明的方法測(cè)定線葉報(bào)春苣苔的峰圖及其CV值。

【具體實(shí)施方式】
:
[0017]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0018]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0019]下述實(shí)施例中所使用材料、試劑等如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0020]實(shí)施例1:
[0021]以線葉報(bào)春苣苔為例，采集線葉報(bào)春苣苔、番爺(Solanum lycopersicumcv.1Stupickepolni raneO 以及7jC稻(Oryza sativa ssp.japonica, IC = 0.43-0.45pg)嫩葉各20mg，以番茄為主要內(nèi)參，水稻為第二內(nèi)參，并依據(jù)番茄基因組大小為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水稻基因組大小進(jìn)行重新校對(duì)；分別在滴有Iml核提取緩沖液LBOl的培養(yǎng)皿中，用鋒利刀片快速分別將線葉報(bào)春苣苔、番茄和水稻切碎，用50 μ m的過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾獲得細(xì)胞核懸液，置于冰上備用；加入RNA消化酶，終濃度為50 μ g ml—1，消化半小時(shí)；加入碘化丙啶(PI)染色，終濃度為100 μ g ml—1 ;避光染色，染色時(shí)間為40分鐘；采用德國(guó)Partec公司的流式細(xì)胞儀(型號(hào)CyFlow Space)對(duì)其基因組進(jìn)行測(cè)定，采用488nm激光激發(fā)，由FL2通道檢測(cè)熒光強(qiáng)度，每個(gè)樣品測(cè)定5000個(gè)以上的細(xì)胞核，使用隨機(jī)軟件FloMax2.80進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和分析，每個(gè)峰的細(xì)胞核數(shù)量及其CV值可通過(guò)該軟件直接獲得，通過(guò)在PI vs.SSC的散點(diǎn)圖上手動(dòng)繪制多邊門(Polygon gates),可以進(jìn)一步去掉多余的碎片(debris),獲取更高質(zhì)量的峰圖。由此可獲得線葉報(bào)春苣苔的基因組大小，約為0.66pg，其峰圖見(jiàn)圖3，CV值為3.51%。
[0022]實(shí)施例2:
[0023]本實(shí)施例與實(shí)施例1基本相同，只是材料為苦苣苔科植物報(bào)春苣苔屬的100多個(gè)物種，經(jīng)測(cè)定，所獲得的結(jié)果質(zhì)量均較好，其CV值均低于5%。
[0024]對(duì)比例1:
[0025]本對(duì)比例與實(shí)施例1基本相同，只是將核提取緩沖液LBOl換成de Laat’ S、Galbraith，S、General Purpose、MgS04、Partec、Tris.MgCl2 和 Woody Plant 七種緩沖液,其他步驟與實(shí)施例1相同，測(cè)試得到的峰圖及其CV值見(jiàn)圖1，從圖1可以看出，用核提取緩沖液LBOl的CV為3.51 %，而其他緩沖液的CV值均比較高。
[0026]對(duì)比例2:
[0027]本對(duì)比例與實(shí)施例1基本相同，只是有兩點(diǎn)不同:
[0028]1、物種不同:本對(duì)比例的材料為懷集報(bào)春苣苔及舌柱報(bào)春苣苔；
[0029]2、避光染色，染色時(shí)間為24小時(shí)或者未避光染色，染色時(shí)間為24小時(shí)，其他步驟與實(shí)施例1相同。
[0030]測(cè)試得到的峰圖及其CV值見(jiàn)圖2，從圖2可以看出，24小時(shí)的避光染色以及未避光染色，其CV值都比較高，特別是黑暗處理，其CV值更高。
【權(quán)利要求】
1.一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟: 材料準(zhǔn)備:苦苣苔科的目的植物的新鮮嫩葉； 內(nèi)參選擇:儀器調(diào)試后進(jìn)行樣品熒光強(qiáng)度及基因組大小的預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)基因組大小選擇番茄為主要內(nèi)參，水稻為第二內(nèi)參，并依據(jù)番茄基因組大小為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水稻基因組大小進(jìn)行重新校對(duì)； 制備細(xì)胞核懸液:目的植物和內(nèi)參物種，按照Iml核提取緩沖液LBOl中加入20mg嫩葉的量，分別將目的植物和內(nèi)參物種的嫩葉加入核提取緩沖液LBOl中，然后將嫩葉切碎，用50 μ m孔徑的過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾獲得細(xì)胞核懸液，置于冰上備用，所述的核提取緩沖液LBOl 的配方為:15mM Tris、2mM Na2EDTA、0.5mM spermine.4HCl、80mM KCl、20mM NaCl,15mM β -mercaptoethanol、0.I % (v/v)Triton X-100，pH7.5 ； 再用RNA消化酶消化細(xì)胞核懸液中的RNA，RNA消化酶終濃度為50 μ g ml—1 ;然后加入碘化丙啶熒光避光染色；最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定目的植物的基因組大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述碘化丙啶的終濃度為10ygπι1，染色時(shí)間為40m in。
【文檔編號(hào)】G01N15/14GK104075983SQ201410250566
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】王靜, 劉娟, 康明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院華南植物園