12f型肺炎球菌單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種12F型肺炎球菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株Sino12F，其保藏編號為CGMCC?No.9235。本發(fā)明的單克隆抗體特異性好、抗體水平高且能長期保存，可用于肺炎球菌12F型多糖和肺炎多糖疫苗中12F型多糖含量的檢測。
【專利說明】12F型肺炎球菌單克隆抗體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及12F型肺炎球菌單克隆抗體及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎抗體是指動(dòng)物抗肺炎球菌各型別莢膜多糖產(chǎn)生的的IgG、IgM等類型抗體的 總稱，廣泛應(yīng)用于肺炎鏈球菌菌株鑒定、肺炎多糖疫苗以及肺炎結(jié)合疫苗中各型別多糖的 定性和定量檢測。
[0003] 目前世界上廣泛應(yīng)用的肺炎抗體主要來自兔血清。丹麥血清研究所（SSI)使用各 型別肺炎球菌靜脈注射兔子，制備兔抗各型肺炎莢膜多糖的血清，應(yīng)用于肺炎球菌菌種鑒 定以及肺炎莢膜多糖含量測定等實(shí)驗(yàn)。由于肺炎莢膜多糖成分復(fù)雜，許多型別之間存在交 叉反應(yīng)（如6A和6B，19A和19F等），使用此方法制備的肺炎多糖抗體為多抗的混合物，特 異性差，不同型別之間存在交叉反應(yīng)，只有通過多次菌體吸附，才能降低交叉作用的發(fā)生， 因而給鑒定工作帶來不必要的麻煩，同時(shí)增加了實(shí)驗(yàn)誤差，此外，該方法制備的抗體水平較 低，抗體滴度小，抗體效價(jià)不高，穩(wěn)定性差，易降解，為抗體的長久保存帶來困難。因此，制備 出特異性好、抗體滴度高且穩(wěn)定性好的肺炎多糖抗體成為了亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種特異性好、抗體水平 高且能長期保存的12F型肺炎球菌單克隆抗體。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明通過將免疫肺炎多糖原液的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) 胞融合，分離出能夠分泌肺炎抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞，接種小鼠腹腔，制備含有特異性肺 炎抗體的腹水，經(jīng)過后期處理并驗(yàn)證，得到一種特異性好、抗體水平高且能長期保存的肺 炎抗體。
[0006] 本發(fā)明首先提供了一種肺炎12F型單抗雜交瘤細(xì)胞株Sinol2F。該雜交瘤細(xì)胞株 現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC No. 9235,保藏日期 2014年5月26日。
[0007] 本發(fā)明還提供了由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0008] 具體而言，本發(fā)明采用小鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備12F型肺炎球菌單克隆抗 體，包括如下步驟：
[0009] 1)動(dòng)物免疫
[0010] 12F型肺炎球菌多糖原液與弗氏完全佐劑等體積混合后進(jìn)行乳化背部皮下注射小 鼠，后與弗氏不完全佐劑等體積混合后乳化進(jìn)行第二次和第三次免疫，若第三次免疫后，抗 體效價(jià)經(jīng)ELISA方法檢測抗體滴度在10000以上，則認(rèn)為合格，腹腔注射12F型肺炎多糖原 液進(jìn)行加強(qiáng)免疫，不用乳化，劑量與前三次相同。
[0011] 2)脾細(xì)胞融合
[0012] 將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按一定比例混合，37°C水浴融合。將PEG滴入混合 系中；緩慢加入無血清的頂DM培養(yǎng)基，離心棄去上清后加入MDM完全培養(yǎng)液，將混懸液分 別加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)后，添加 HAT培養(yǎng)液。
[0013] 3)雜交瘤細(xì)胞長至一定程度時(shí)進(jìn)行抗體ELISA檢測，及時(shí)做亞克隆。將HT培養(yǎng) 基稀釋的雜交瘤細(xì)胞加入96孔板培養(yǎng)。培養(yǎng)兩周后將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培 養(yǎng)，并凍存。
[0014] 4)凍存的單克隆細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，培養(yǎng)，25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞覆蓋瓶底 70% -80 %時(shí)進(jìn)行腹腔接種Balb/c雌性小鼠，定期收集腹水。
[0015] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了包括上述單克隆抗體的試劑盒，用于檢測肺炎球菌12F 型多糖。
[0016] 進(jìn)一步地，所述單克隆抗體經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記。
[0017] 作為優(yōu)選，所述標(biāo)記為酶標(biāo)記。
[0018] 更為優(yōu)選，所述標(biāo)記為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體在檢測肺炎多糖疫苗中12F型多糖含量中的應(yīng) 用。
[0020] 作為優(yōu)選，所述單克隆抗體經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記。
[0021] 本發(fā)明采用12F型多糖原液免疫小鼠，制備小鼠脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融 合，制備能夠分泌12F型單克隆抗體的單克隆細(xì)胞株，腹腔接種小鼠制備12F型單抗腹水。
[0022] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0023] 1、使用12F型肺炎多糖原液與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，與菌體免疫相比具有較 好的特異性。
[0024] 2、篩選雜交瘤細(xì)胞時(shí)，除用12F型多糖檢測細(xì)胞上清為陽性外，還用CPS多糖檢測 細(xì)胞上清為陰性，確保雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體只是針對12F型多糖，不含抗CPS多糖的抗 體。
[0025] 3、制備的12F型單抗腹水經(jīng)過驗(yàn)證后，可以用于速率免疫濁度法檢測12F型多糖 含量、雙抗體夾心法檢測肺炎多糖含量，以及進(jìn)行酶標(biāo)記之后制備酶標(biāo)二抗。
[0026] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有肺炎抗體存在交叉反應(yīng)、抗體水平低、抗體效價(jià)差等缺點(diǎn)，通過 將免疫肺炎多糖原液的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，分離出能夠分泌肺炎抗體的單克隆 雜交瘤細(xì)胞，接種小鼠腹腔，制備含有特異性肺炎抗體的腹水，經(jīng)過后期處理并驗(yàn)證，得到 一種特異性好、抗體水平高且能長期保存的肺炎抗體。

【具體實(shí)施方式】 [0027]
[0028] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 1.動(dòng)物免疫
[0031] 用含有12F型肺炎球菌多糖的樣品添加或者不添加佐劑，背部皮下注射Balb/c小 鼠，總量0. 2ml (可不用多點(diǎn)注射），每只免疫0. 1-8 μ gl2F型多糖原液；間隔14天后進(jìn)行 第二次免疫，采用佐劑與〇. 1-8 μ gl2F型多糖原液等體積混合后乳化，總量0. 2ml ;再次間 隔14天后進(jìn)行第三次免疫，采用佐劑與0. 1-8 μ gl2F型多糖原液等體積混合后乳化，總量 0.2ml。第三次免疫后一周小鼠尾部靜脈采血（或眼眶采血），檢測血清的抗體滴度。若第 三次免疫后，抗體效價(jià)經(jīng)ELISA方法檢測抗體滴度在10000以上，則認(rèn)為合格；第三次免疫 后3周-4周左右對抗體效價(jià)合格的小鼠腹腔注射12F型肺炎多糖原液進(jìn)行加強(qiáng)免疫，不用 佐劑乳化，劑量與前三次相同。
[0032] 2.脾細(xì)胞融合
[0033] 2. 1骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備：細(xì)胞融合前兩周復(fù)蘇培養(yǎng)SP2/0_Agl4細(xì)胞株，融合前3 天擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前1天將細(xì)胞培養(yǎng)液去除，重新添加培養(yǎng)液。
[0034] 2. 2脾細(xì)胞制備：處死進(jìn)行動(dòng)物免疫的小鼠，按照常規(guī)方法制備小鼠脾細(xì)胞懸液
[0035] 2. 3細(xì)胞融合：
[0036] (1)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0分別加入適量不完全I(xiàn)MDM培養(yǎng) 液，SP2/0細(xì)胞晃動(dòng)混勻，脾細(xì)胞用吹打均勻。
[0037] (2)將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按一定比例混合于一支50ml離心管中，混勻。
[0038] (3)加不完全頂DM培養(yǎng)液至50ml，離心5min，將上清盡量倒凈，可用移液槍將管口 液體吸凈。
[0039] (4)輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻，離心管置37°C水浴，準(zhǔn)備融合。
[0040] (5)將37°C保溫的PEGlml，用滴管緩慢滴入離心管，邊滴邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使細(xì)胞保 存在混勻狀態(tài)。
[0041] (6)靜置90s，立即在2-4min內(nèi)緩慢加入15ml無血清的頂DM培養(yǎng)基（37°C )，盡 可能不攪動(dòng)細(xì)胞。
[0042] (7)離心5分鐘，棄去上清。
[0043] (8)加入IMDM完全培養(yǎng)液，輕輕混勻，將混懸液分別加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 100 μ 1。
[0044] (9)將培養(yǎng)板置37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0045] (10)融合第2天，添加 HAT培養(yǎng)液，每孔100 μ 1。
[0046] (11)每2-3天換一次HAT培養(yǎng)液，連續(xù)兩周觀察雜交瘤是否出現(xiàn)，兩周后換用ΗΤ 培養(yǎng)基，觀察融合細(xì)胞的生長狀況。
[0047] 3.雜交瘤細(xì)胞的篩選：脾細(xì)胞融合后第七天開始觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其 長至孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清進(jìn)行抗體ELISA檢測。陽性孔細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板擴(kuò)大培 養(yǎng)，及時(shí)做亞克隆。
[0048] 通過3次的亞克隆得到可以穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系，將雜交瘤細(xì)胞Sin〇12F進(jìn)行 保藏，保藏號CGMCC N0. 9235 ;保藏時(shí)間：2014年5月26日；保藏單位：中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物 研究所，郵編100101。
[0049] 4.雜交瘤細(xì)胞的克隆化（有限稀釋法）：
[0050] (1)雜交瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋雜交瘤細(xì)胞。
[0051] (2)將稀釋的雜交瘤細(xì)胞加入96孔板培養(yǎng)，每孔100 μ 1。
[0052] (3) 37°C、5 % C02濕潤培養(yǎng)7-10天，待出現(xiàn)肉眼可見的克隆，及時(shí)檢測抗體活性。 在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。
[0053] (4)將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0054] (5)每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存。
[0055] 5.單抗細(xì)胞株腹水制備：按照常規(guī)方法將凍存的單克隆細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，培養(yǎng)，鏡 下觀察細(xì)胞生長狀況，25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞覆蓋瓶底70% -80%時(shí)即可進(jìn)行接種；按照 常規(guī)方法腹腔接種Balb/c雌性小鼠，定期收集腹水。
[0056] 6.肺炎單抗腹水驗(yàn)證：使用速率免疫濁度方法檢測不同稀釋度的12F型肺炎單抗 腹水與12F型肺炎多糖標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)值，觀察反應(yīng)趨勢，確定可用性。
[0057] 6. 1速率免疫濁度法檢測12F型多糖標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)值，如表1所示：
[0058] 表1不同來源12F型肺炎抗體與標(biāo)準(zhǔn)多糖反應(yīng)值
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 12F型肺炎球菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株Sin〇12F，其保藏編號為CGMCC No. 9235。
2. 由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。
3. 包括權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的試劑盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述單克隆抗體經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo) 記。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述單克隆抗體經(jīng)酶標(biāo)記。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述單克隆抗體經(jīng)辣根過氧化物酶或 堿性磷酸酶標(biāo)記。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于肺炎球菌12F型多糖的 檢測。
8. 權(quán)利要求2所述單克隆抗體在檢測肺炎多糖疫苗中12F型多糖含量中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單克隆抗體經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單克隆抗體經(jīng)辣根過氧化物酶或堿 性磷酸酶標(biāo)記。
【文檔編號】G01N33/577GK104140956SQ201410250302
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】陳磊, 王欣, 童欽, 李育榮, 王琳, 蔡芳, 高強(qiáng), 尹衛(wèi)東 申請人:北京科興中維生物技術(shù)有限公司