一種基因合成的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DNA片段拼接合成方法。該方法包括如下步驟：a）設計系列單鏈DNA片段，為一條位于待合成DNA片段正鏈5’端的正向單鏈f，以及若干條位于待合成DNA片段反鏈上的反向單鏈rn；所述正向單鏈f的5’端連有羥基，其3’端與所述反向單鏈r1的3’端序列匹配；所述反向單鏈r1的5’端有內(nèi)切酶序列，酶切序列下游與所述反向單鏈r2的3’端序列一致；r3,r4,r5等參照前文所述；b）向含有步驟a）系列單鏈DNA片段的反應體系中加入DNA聚合酶，72℃延伸；c）向步驟b）反應體系中加入相應內(nèi)切酶和5’-3’外切酶，70℃10s，50℃10s，37℃10s，60個循環(huán)，從反應產(chǎn)物中獲得所述待合成DNA片段。本發(fā)明綜合了PCR和連接酶反應優(yōu)點，體系簡單，條件易于控制，中間產(chǎn)物少，合成效率高。
【專利說明】一種基因合成的方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種DNA片段拼接合成方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前，全球科學雜志報道的DNA片段合成的方法有很多?？偟膩碚f，大體上分為基于PCR的基因合成和基于連接酶的基因合成兩大類。
[0003]基于PCR的基因合成就是利用DNA片段與片段之間的互補配對，通過變性、退火和片段延伸等反應步驟完成目的片段的擴增和拼接?；赑CR技術(shù)的片段延伸存在著很多的優(yōu)點:絕大多數(shù)反應條件都可以在PCR儀器設定下完成，操作方便和易于控制；參與反應的各種底物可以一步加入，操作簡便快捷，基本實現(xiàn)了無人值守自動化操作；由PCR循環(huán)過程中直接延伸獲得目標片段等等。
[0004]當然，該類片段延伸的方案也存在技術(shù)短板，突出的缺點:
[0005]1.很容易發(fā)生錯配，往往因模板片段濃度大，產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物。。由于大量的片段一次性加入，由于4種堿基ATCG的排列順序和空間位置的不同和很容易在各種鏈之間形成錯誤鏈接，因此在聚合酶的延伸過程中很容易導致片段的錯誤退火的發(fā)生產(chǎn)生的一些不需要的中間副產(chǎn)品。
[0006]2.合成產(chǎn)物的出錯率沒有得到有效控制。由于聚合酶執(zhí)行的長片段延伸反應，因此增加片段的合成長度，在長DNA鏈的延伸過程中必然會導致連接的錯誤，這種錯誤的發(fā)生幾率在百分之一左右。
[0007]3.精密的片段設計，包括必要時進行DNA片段序列復雜設計。由于在目標基因的合成過程中，不可避免的會在片段合成時出現(xiàn)一些同源性的DNA區(qū)段，這也就導致了在退火、延伸的步驟中出錯的幾率很大的提高。因此，必須采用密碼子優(yōu)化，設計具有保護性能的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)等類似的空間結(jié)構(gòu)，雖然設計環(huán)節(jié)和結(jié)構(gòu)預測復雜且必須
[0008]4.精密的PCR參數(shù)調(diào)整。經(jīng)過復雜的序列設計和PCR參數(shù)調(diào)整，在PCR法中，對合成參數(shù)進行仔細調(diào)整之后，合成的出錯率可以降到0.0027。
[0009]基于連接酶的基因合成是利用DNA片段彼此之間暴露的單鏈粘性末端的互補配對，利用DNA連接酶直接連接下一條片段，最終實現(xiàn)整個大片段的合成?；谶B接酶的片段合成存在著很多的優(yōu)點:基因合成快速方便，方法簡單，等溫反應，反應條件易于控制，各片段設計簡單，幾乎無錯配率，合成片段的保證性好。但是該方法也存在著突出的缺點:1.一步反應僅能實現(xiàn)少數(shù)片段的連接，合成片段長度有限。通常通過限制性內(nèi)切酶、核酸外切酶等酶切酶類和連接酶同時工作，此類酶在等溫反應體系中自由無秩序工作。2.很容易發(fā)生錯配，類似于PCR法，模板片段濃度大，產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物，上述已經(jīng)說明。4.反應的緩沖液體系為融合的體系，成分較為復雜，不利于各種酶發(fā)揮功能。
[0010] 根據(jù)上述技術(shù)的局限性，歸結(jié)起來，我們迫切需要一種新的片段合成的方法來解決如下6大類問題:1.序列設計復雜。2.中間產(chǎn)物多。3.反應體系操作復雜。4.反應循環(huán)不可控制。5.錯配率高。6.PCR參數(shù)調(diào)整。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011 ] 本發(fā)明的目的是提供一種DNA片段拼接合成方法。該方法是一種將PCR技術(shù)和連接酶技術(shù)相互融合，取長補短，最終實現(xiàn)DNA片段連接的新方法。
[0012]本發(fā)明所提供的DNA片段拼接合成方法，具體可包括如下步驟:
[0013](a)設計用于合成最終DNA片段的系列單鏈DNA片段，為如下:
[0014]根據(jù)待合成最終DNA片段的序列，設計如下n+1個單鏈DNA片段(I個正向DNA單鏈和η個反向DNA單鏈):正向DNA單鏈f，以及反向DNA單鏈rl、反向DNA單鏈r2，依此類推，反向DNA單鏈r (η-1)和反向DNA單鏈rn ;
[0015]所述正向DNA單鏈f:自所述待合成最終DNA片段的正鏈5’端的第I位核苷酸開始，按照所述正鏈的核苷酸序列向所述正鏈的3’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的正鏈5’端的第I位核苷酸算起的第A1位核苷酸，形成共由A1個核苷酸組成的單鏈DNA片段，同時在所述共由A1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端連接羥基(有效降低5’ -3’外切酶對其進行的切割)，得到所述正向DNA單鏈f ；
[0016]所述反向DNA單鏈rl:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第A^a1位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A2位核苷酸，形成共由A2- (A1-B1)+!個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A2- (Afa1)+1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈rl ；
[0017]所述反向DNA單鏈r2:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第A2_a2位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A3位核苷酸，形成共由A3- (A2-B2)+1個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A3- (A2-a2)+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈r2 ；
[0018]所述反向DNA單鏈r (n_l):自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第An位核苷酸，形成共由An- (A^-a^)+!個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由An- (An^1-Bn^1) +1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈r (n_l)；
[0019]所述反向DNA單鏈rn:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第An_an位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第An+1位核苷酸，形成共由An+1- (An-an)+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由An+1- (An-an)+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈rn ；
[0020]所述待合成最終DNA片段的正鏈和反鏈均共由An+1個核苷酸組成；所述待合成最終DNA片段上不含有所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列；
[0021]11為大于等于2的正整數(shù)汸1、六2、六3、......、An_1、An、An+1，&&a1、a2、......Wn^an
均為正整數(shù) AnJAJAlri ；A3>A2>A1 ;An+1-An、An-An^ A3-A2 與 A2-A1 均介于 50-80 之間叫、a2、aIri與an均介于15-20之間。
[0022]所述正向DNA單鏈f、所述反向DNA單鏈rl、所述反向DNA單鏈r2,依此類推,所述反向DNA單鏈r (η-1)和所述反向DNA單鏈rn這n+1個DAN單鏈彼此之間所形成的序列反向互補或序列一致，有且僅有通過以上設計所形成的以下(I)- (III)，即除了下述(I)和(II)外，這n+1個DAN單鏈彼此之間不存在其他的序列反向互補或序列一致的情況:
[0023](I)位于所述正向DNA單鏈f的3’末端的由個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈rl的3’末端的由B1個核苷酸組成的序列反向互補；
[0024]所述位于所述正向DNA單鏈f的3’末端的由個核苷酸組成的序列為:自所述正向DNA單鏈f的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述正向DNA單鏈f的核苷酸序列向所述正向DNA單鏈 f的5’端延長，得到的由個核苷酸組成的序列；
[0025]所述位于所述反向DNA單鏈rl的3’末端的由個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rl的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rl的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rl的5’端延長，得到的由個核苷酸組成的序列；
[0026](II)在所述反向DNA單鏈rl上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a2個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈r2的3’末端的由a2個核苷酸組成的序列一致；
[0027]所述在所述反向DNA單鏈rl上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a2個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rl的3’端的第(A2_a2)_ (A^a1)+1位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rl的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rl的5’端延長，得到的由a2個核苷酸組成的序列；
[0028]所述位于所述反向DNA單鏈r2的3’末端的由a2個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈r2的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈r2的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈r2的5’端延長，得到的由a2個核苷酸組成的序列；
[0029](III)在所述反向DNA單鏈r (n_l)上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由anf核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈rn的3’末端的由an個核苷酸組成的序列一致；
[0030]所述在所述反向DNA單鏈Kn-1)上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由anf核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈r (η-1)的3’端的第(An_an)_ (A^aj+l位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈r (η-1)的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈r (n_l)的5’端延長，得到的由an個核苷酸組成的序列；
[0031]所述位于所述反向DNA單鏈rn的3’末端的由&11個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rn的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rn的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rn的5’端延長，得到的由an個核苷酸組成的序列；
[0032](b )向含有步驟(a)所設計的系列單鏈DNA片段的反應體系中加入DNA聚合酶，先于70-720C (如72°C)孵育3-5min (如5min)，再于4°C孵育l_3min (如Imin);讓溫度降到4°C是為了加入限制性內(nèi)切酶和外切酶；
[0033](C)向步驟(b)孵育后的反應體系中加入所述限制性內(nèi)切酶M和5’-3’外切酶，按照如下條件進行反應:70°C 10-30s (如 10s)，50。。10_30s (如 10s)，37。。10_30s (如 10s),40-80 (如60)個循環(huán)；70-72°C 1min (如72°C) ;4°C結(jié)束循環(huán)溫度；從反應產(chǎn)物中獲得所述待合成最終DNA片段。
[0034]上述方法中的步驟(a)，當n=2時，具體為如下(al):
[0035](al)根據(jù)待合成最終DNA片段的序列，設計如下三個單鏈DNA片段:正向DNA單鏈f，反向DNA單鏈rl和反向DNA單鏈r2 ；
[0036]所述正向DNA單鏈f:自所述待合成最終DNA片段的正鏈5’端的第I位核苷酸開始，按照所述正鏈的核苷酸序列向所述正鏈的3’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的正鏈5’端的第I位核苷酸算起的第A1位核苷酸，形成共由A1個核苷酸組成的單鏈DNA片段，同時在所述共由A1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端連接羥基，得到所述正向DNA單鏈f ;
[0037]所述反向DNA單鏈rl:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第Afa1位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A2位核苷酸，形成共由A2- (A1-B1)+!個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A2- (Afa1)+1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈rl ；
[0038] 所述反向DNA單鏈r2:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第A2_a2位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A3位核苷酸，形成共由A3- (A2-B2)+1個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A3- (A2-a2)+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈r2 ；
[0039]所述待合成最終DNA片段的正鏈和反鏈均共由A3個核苷酸組成；所述待合成最終DNA片段上不含有所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列；
[0040]A1'A2、A3、a1 和 a2 均為正整數(shù)；A3>A2>A1 ；A3-A2 與 A2-A1 均介于 50-80 之間與 a2均介于15-20之間。
[0041]所述正向DNA單鏈f、所述反向DNA單鏈rl和所述反向DNA單鏈r2這三個DAN單鏈彼此之間所形成的序列反向互補或序列一致，有且僅有通過以上設計所形成的以下(I)和(II):
[0042](I)位于所述正向DNA單鏈f的3’末端的由個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈rl的3’末端的由B1個核苷酸組成的序列反向互補；
[0043]所述位于所述正向DNA單鏈f的3’末端的由個核苷酸組成的序列為:自所述正向DNA單鏈f的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述正向DNA單鏈f的核苷酸序列向所述正向DNA單鏈f的5’端延長，得到的由個核苷酸組成的序列；
[0044]所述位于所述反向DNA單鏈rl的3’末端的由個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rl的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rl的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rl的5’端延長，得到的由個核苷酸組成的序列；
[0045](II)在所述反向DNA單鏈rl上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a2個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈r2的3’末端的由a2個核苷酸組成的序列一致；
[0046]所述在所述反向DNA單鏈rl上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a2個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rl的3’端的第(A2_a2)_ (A^a1)+1位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rl的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rl的5’端延長，得到的由a2個核苷酸組成的序列；
[0047]所述位于所述反向DNA單鏈r2的3’末端的由a2個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈r2的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈r2的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈r2的5’端延長，得到的由a2個核苷酸組成的序列；
[0048]上述方法中的步驟(a)，當n=3時，具體為如下(a2):
[0049](a2)根據(jù)待合成最終DNA片段的序列，設計如下四個單鏈DNA片段:正向DNA單鏈f，反向DNA單鏈r1、反向DNA單鏈r2和反向DNA單鏈r3 ；
[0050]所述正向DNA單鏈f:自所述待合成最終DNA片段的正鏈5’端的第I位核苷酸開始，按照所述正鏈的核苷酸序列向所述正鏈的3’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的正鏈5’端的第I位核苷酸算起的第A1位核苷酸，形成共由A1個核苷酸組成的單鏈DNA片段，同時在所述共由A1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端連接羥基(有效降低5’ -3’外切酶對其進行的切割)，得到所述正向DNA單鏈f ；
[0051]所述反向DNA單鏈rl:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第A^a1位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A2位核苷酸，形成共由A2- (A1-B1)+!個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A2- (Afa1)+1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈rl ；
[0052]所述反向DNA單鏈r2:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第A2_a2位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A3位核苷酸，形成共由A3- (A2-B2)+1個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A3- (A2-a2)+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈r2 ；
[0053]所述反向DNA單鏈r3:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第A3_a3位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A4位核苷酸，形成共由A4- (A3-a3)+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A4- (A3-B3) +1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈r3 ；
[0054]所述待合成最終DNA片段的正鏈和反鏈均共由A4個核苷酸組成；所述待合成最終DNA片段上不含有所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列；
[0055]A1>A2>A3>A4>a1>a2 和 a3 均為正整數(shù)；A4>A3>A2>A1 ；A4-A3^A3-A2 與 A2-A1 均介于 50-80之間> a2與a3均介于15-20之間。
[0056]所述正向DNA單鏈f、所述反向DNA單鏈rl、所述反向DNA單鏈r2和所述反向DNA單鏈r3這四個DAN單鏈彼此之間所形成的序列反向互補或序列一致，有且僅有通過以上設計所形成的以下(I)- (III)，即除了下述(I)- (III)外，這四個DNA單鏈彼此之間不存在其他的序列反向互補或序列一致的情況:
[0057](I)位于所述正向DNA單鏈f的3’末端的由B1個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈rl的3’末端的由B1個核苷酸組成的序列反向互補；
[0058]所述位于所述正向DNA單鏈f的3’末端的由個核苷酸組成的序列為:自所述正向DNA單鏈f的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述正向DNA單鏈f的核苷酸序列向所述正向DNA單鏈f的5’端延長，得到的由個核苷酸組成的序列；
[0059]所述位于所述反向DNA單鏈rl的3’末端的由個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rl的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rl的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rl的5’端延長，得到的由個核苷酸組成的序列；
[0060](II)在所述反向DNA單鏈rl上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a2個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈r2的3’末端的由a2個核苷酸組成的序列一致；
[0061]所述在所述反向DNA單鏈rl上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a2個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rl的3’端的第(A2_a2)_ (A^a1)+1位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rl的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rl的5’端延長，得到的由a2個核苷酸組成的序列；
[0062]所述位于所述反向DNA單鏈r2的3’末端的由a2個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈r2的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈r2的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈r2的5’端延長，得到的由a2個核苷酸組成的序列；
[0063](III)在所述反向DNA單鏈r2上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a3個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈r3的3’末端的由a3個核苷酸組成的序列一致；
[0064]所述在所述反向DNA單鏈r2上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a3個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈r2的3’端的第(A3_a3) - (A2-B2) +1位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈r2的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈r2的5’端延長，得到的由a3個核苷酸組成的序列；
[0065]所述位于所述反向DNA單鏈r3的3’末端的由a3個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈r3的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈r3的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈r3的5’端延長，得到的由a3個核苷酸組成的序列；
[0066] 在上述方法步驟(C)中，進行所述“70°C 10-30s”反應時，為所述DNA聚合酶發(fā)揮作用，進行“50°C 10-30s”反應時，為所述限制性內(nèi)切酶M發(fā)揮作用，進行“37°C 10_30s”反應時，為所述5’ -3’外切酶發(fā)揮作用。
[0067]在上述方法步驟(a)中，所述(al)適合于所述待合成最終DNA片段大小介于110-210bp的情況；所述(a2)適合于所述待合成最終DNA片段大小介于140_275bp的情況；所述(a3)適合于所述待合成最終DNA片段大小大于140bp的情況。
[0068]在上述方法中，設計各單鏈DNA片段時，可經(jīng)軟件分析，通過密碼子優(yōu)化(為表達蛋白目的)等方式進行序列替換，使得GC含量在50%左右；還可用生物信息學軟件預測有可能在單鏈之間形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)、片段錯配和序列結(jié)構(gòu)自身環(huán)化等單鏈參數(shù)，在設計各單鏈DNA片段時盡可能避免。
[0069]在上述方法中，所述反應體系中的緩沖液為所述DNA聚合酶、所述限制性內(nèi)切酶M和所述5’ -3’外切酶這三種酶的緩沖體系的融合，即所述緩沖液能夠同時滿足所述三種酶的工作，在所述緩沖液中，所述三種酶均能保持其活性。
[0070]在上述方法中，所述反應體系中的所述DNA聚合酶不限為單一DNA聚合酶；所述限制性內(nèi)切酶M不限為單一限制性內(nèi)切酶；所述5’ -3’外切酶不限為單一 5’ -3’外切酶。
[0071]在本發(fā)明的一個實施例中，所述DNA聚合酶具體為Phus1n超保真DNA聚合酶(New England B1labs#M0530)。
[0072]在本發(fā)明的一個實施例中，所述限制性內(nèi)切酶M具體為限制性內(nèi)切酶BsrD I。
[0073]在本發(fā)明的一個實施例中，所述5’ -3’外切酶具體為λ核酸外切酶。
[0074]在上述方法中，所述反應體系中，每種單鏈DNA片段的用量相等。
[0075]在本發(fā)明的一個實施例中，所述待合成最終DNA片段具體為序列表中序列I所示的DNA片段。
[0076]相應的，根據(jù)序列表中序列1，設計得到用于合成序列I所示DNA片段的如下四條單鏈DNA片段:如序列表中序列2所示的正向DNA單鏈f ;如序列表中序列3所示的反向DNA單鏈rl ;如序列表中序列4所示的反向DNA單鏈r2 ;以及如序列表中序列5所示的反向DNA單鏈r3。
[0077]在本發(fā)明的一個實施例中，所述反應體系中的緩沖液組成具體如下:溶劑為水，溶質(zhì)及濃度為:Tris_HCl 10mmol /T, ；KC1 50mmoI /T, ；MgCl2 2mmol/L ；DDT lmmol/L ；BSA50 μ g/mL； Tri ton X-100 I μ L/mL。各濃度為相應組分在所述反應體系中的終濃度。所述反應體系的pH為8.5-9.5。
[0078]用所述方法進行DNA片段拼接合成時，設計用于合成最終DNA片段的系列單鏈DNA片段的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0079]所述設計用于合成最終DNA片段的系列單鏈DNA片段的方法，具體包括以上步驟(a)所述的步驟。
[0080]上述本發(fā)明所提供的DNA片段拼接合成方法的技術(shù)路線如下:
[0081]第一步反應:正向DNA單鏈片段f與反向DNA單鏈片段rl在DNA聚合酶的作用下，通過彼此的互補配對序列接合，并向各自3’端延伸，形成互補雙鏈I ;
[0082]第二步反應:限制性內(nèi)切酶M特異性識別所述互補雙鏈I中的所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，并進行切割，從而暴露出磷酸化的DNA5’末端；
[0083]第三步反應:5’ -3’外切酶特異性從所述磷酸化的DNA5’末端進行切割，將所述互補雙鏈I中的反向互補鏈切除，剩余所述互補雙鏈I中的正鏈，記為正向DNA單鏈片段f-rl ；
[0084]第四步反應:所述正向DNA單鏈片段f-rl與反向DNA單鏈片段r2在DNA聚合酶的作用下，通過彼此的互補配對序列接合，并向各自3’端延伸，形成互補雙鏈2 ;
[0085]依此類推，直至得到最終DNA片段。
[0086]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:1、反應體系簡單，反應條件易于控制。2、單向延伸，避免中間產(chǎn)物過多。3、中間產(chǎn)物少，合成效率高。4、序列設計簡單。5、通過快速變溫實現(xiàn)片段連接。
6、酶切和聚合交替進行實現(xiàn)片段延伸。7、一步循環(huán)反應，產(chǎn)率高，片段合成速度快。8、一酶兩效:核酸外切酶一方面輔助合成片段，另一方面可去除雜片段，利于結(jié)果顯現(xiàn)。本發(fā)明可以用于基因合成的方法是綜合了 PCR和連接酶反應的優(yōu)點，基本解決了序列設計復雜、中間產(chǎn)物多、反應體系操作復雜、反應循環(huán)不可控制、錯配率高、PCR參數(shù)調(diào)整六大類問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0087]圖1為本發(fā)明所提供的DNA片段拼接合成方法的技術(shù)路線圖。
[0088]圖2為利用本發(fā)明所提供的DNA片段拼接合成方法進行連接反應的產(chǎn)物的直接鑒定結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準；泳道I為連接反應的產(chǎn)物。
[0089]圖3為利用本發(fā)明所提供的DNA片段拼接合成方法進行連接反應的產(chǎn)物的PCR鑒定結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標準；泳道I為連接反應產(chǎn)物的PCR鑒定結(jié)果。

【具體實施方式】
[0090]本發(fā)明所提供的DNA片段拼接合成方法的技術(shù)路線具體如下:
[0091]第一步反應:正向DNA單鏈片段f與反向DNA單鏈片段rl在DNA聚合酶的作用下，通過彼此的互補配對序列接合，并向各自3’端延伸，形成互補雙鏈I ;
[0092]第二步反應:限制性內(nèi)切酶M特異性識別所述互補雙鏈I中的所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，并進行切割，從而暴露出磷酸化的DNA5’末端；
[0093]第三步反應:5’ -3’外切酶特異性從所述磷酸化的DNA5’末端進行切割，將所述互補雙鏈I中的反向互補鏈切除，剩余所述互補雙鏈I中的正鏈，記為正向DNA單鏈片段f-rl ；
[0094]第四步反應:所述正向DNA單鏈片段f-rl與反向DNA單鏈片段r2在DNA聚合酶的作用下，通過彼此的互補配對序列接合，并向各自3’端延伸，形成互補雙鏈2 ;
[0095]依此類推，直至得到最終DNA片段。
[0096]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0097]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0098]DNA 聚合酶:Phus1n 超保真 DNA 聚合酶(New England B1labs#M0530)。該酶是市面上保真度最高的酶，其錯配率比TaqDNA聚合酶低50倍，高溫耐熱性能好。該酶說明書上記載:無熱失活。該酶可耐受PH為5-10之間。
[0099]限制性內(nèi)切酶BsrD 1: (New England B1labs#R0574)該酶的酶切位點位于識別序列下游2bp位置，產(chǎn)生平末端且經(jīng)過該酶消化后的片段95%都可以進行連接或者再切，這就為下一步λ核酸外切酶繼續(xù)酶切創(chuàng)造了很好的條件。該酶在80°C放置20分鐘完全失活，在50°C和37°C仍然具有內(nèi)切酶活性。
[0100]λ核酸外切酶:一種高持續(xù)性核酸外切酶，作用于雙鏈DNA，沿5’ 一 3’方向逐步切去5’單核苷酸，但該酶無5’端羥基活性。本發(fā)明所用λ核酸外切酶為NEB公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為#Μ0262。該酶在75°C放置10分鐘完全失活，在50°C和37°C仍然有外切酶活性。
[0101 ] DyNAzyme:用DNA片段加A反應的酶，為Thermo公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為F-501S。
[0102]Trisbase (FW: 121.14Angus);鹽酸、氯化鉀、氯化鎂、雙對氯苯基三氯乙烷DDT、牛血清白蛋白BSA、Triton X-100 (均來自國藥試劑公司)；PMD18_T載體(Takara，D101A)；DH5a 感受態(tài)細胞(TIANGEN，CBlOl)。
[0103]實施例1、利用本發(fā)明所提供的DNA片段拼接合成方法完成4條基因片段的一步連接
[0104]本實施例將詳述利用本發(fā)明所提供的DNA片段拼接合成方法完成4條基因片段的一步連接，其技術(shù)路線圖如圖1所示。
[0105]一、DNA片段拼接合成
[0106]1、用于合成的系列單鏈DNA片段的設計與合成
[0107]本實施例待合成的最終DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列I所示，按照上述本發(fā)明所提供的用于合成最終DNA片段的系列單鏈DNA片段的設計原則(步驟(a))，結(jié)合序列I的序列信息，設計出如表1所示的四個短的單鏈DNA片段，用于合成序列I所示的DNA片段。四個短的單鏈DNA片段的合成由奧科生物技術(shù)有限公司完成。
[0108]表1由于合成最終DNA片段的單鏈DNA片段
[0109]

【權(quán)利要求】
1.一種DNA片段拼接合成方法，包括如下步驟: Ca)設計用于合成最終DNA片段的系列單鏈DNA片段，為如下: 根據(jù)待合成最終DNA片段的序列，設計如下n+1個單鏈DNA片段:正向DNA單鏈f，以及反向DNA單鏈rl、反向DNA單鏈r2,依此類推,反向DNA單鏈r (n_l)和反向DNA單鏈rn ；所述正向DNA單鏈f:自所述待合成最終DNA片段的正鏈5’端的第I位核苷酸開始，按照所述正鏈的核苷酸序列向所述正鏈的3’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的正鏈5’端的第I位核苷酸算起的第A1位核苷酸，形成共由A1個核苷酸組成的單鏈DNA片段，同時在所述共由A1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端連接羥基，得到所述正向DNA單鏈f; 所述反向DNA單鏈rl:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第A^a1位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A2位核苷酸，形成共由A2- (A1-aJ+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A2- (A1-B1) +1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈rl ； 所述反向DNA單鏈r2:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第A2_a2位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A3位核苷酸，形成共由A3- (A2-B2)+1個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由A3- (A2-B2) +1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈r2 ； 所述反向DNA單鏈r(n-l):自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第A1^核苷酸，形成共由An- (A^-a^)+!個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由An- (A^-a^) +1個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈r (n_l)； 所述反向DNA單鏈rn:自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第An_an位核苷酸開始，按照所述反鏈的核苷酸序列向所述反鏈的5’端延長，至自所述待合成最終DNA片段的反鏈3’端的第I位核苷酸算起的第An+1位核苷酸，形成共由An+1- (An-an)+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段，并在所述共由An+1- (An-an)+l個核苷酸組成的單鏈DNA片段的5’末端直接連接所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列，得到所述反向DNA單鏈rn ； 所述待合成最終DNA片段的正鏈和反鏈均共由An+1個核苷酸組成；所述待合成最終DNA片段上不含有所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列； !!為大于等于之的正整數(shù)乂為為、......、An_1、An、An+1，&&a1、a2、......Wn^an均為正整數(shù)；A3>A2>A1 ;An+「An、An-Ar^1、A3-A2 與 A2-A1 均介于 50-80 之間與an均介于15-20之間。 所 述正向DNA單鏈f、所述反向DNA單鏈rl、所述反向DNA單鏈r2、......、所述反向DNA單鏈r (η-1)和所述反向DNA單鏈rn這n+1個DAN單鏈彼此之間所形成的序列反向互補或序列一致，有且僅有通過以上設計所形成的以下(I)-(III): (I)位于所述正向DNA單鏈f的3’末端的由個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈rl的3’末端的由B1個核苷酸組成的序列反向互補；所述位于所述正向DNA單鏈f的3’末端的由個核苷酸組成的序列為:自所述正向DNA單鏈f的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述正向DNA單鏈f的核苷酸序列向所述正向DNA單鏈f的5’端延長，得到的由個核苷酸組成的序列； 所述位于所述反向DNA單鏈rl的3’末端的由個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rl的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rI的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rl的5’端延長，得到的由個核苷酸組成的序列； (II)在所述反向DNA單鏈rl上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a2個核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈r2的3’末端的由a2個核苷酸組成的序列一致； 所述在所述反向DNA單鏈rl上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由a2個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rl的3’端的第(A2_a2)_ (A^a1)+1位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rl的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rl的5’端延長，得到的由a2個核苷酸組成的序列； 所述位于所述反向DNA單鏈r2的3’末端的由a2個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈r2的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈r2的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈r2的5’端延長，得到的由a2個核苷酸組成的序列； (III)在所述反向DNA單鏈r(n_l)上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由anf核苷酸組成的序列與位于所述反向DNA單鏈rn的3’末端的由an個核苷酸組成的序列一致； 所述在所述反向DNA單鏈r (η-1)上位于所述限制性內(nèi)切酶M的識別序列下游的由an個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈r (η-1)的3’端的第(An-an)_位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈r (η-1)的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈r (n_l)的5’端延長，得到的由an個核苷酸組成的序列； 所述位于所述反向DNA單鏈rn的3’末端的由&11個核苷酸組成的序列為:自所述反向DNA單鏈rn的3’端的第I位核苷酸開始，按照所述反向DNA單鏈rn的核苷酸序列向所述反向DNA單鏈rn的5’端延長,得到的由an個核苷酸組成的序列； (b)向含有步驟(a)所設計的系列單鏈DNA片段的反應體系中加入DNA聚合酶，先于70-72°C孵育 3-5min，再于 4°C孵育 l_3min ； (c)向步驟(b)孵育后的反應體系中加入所述限制性內(nèi)切酶M和5’-3’外切酶，按照如下條件進行反應:70°C 10-30s,50°C 10_30s，37°C 10_30s，40-80 個循環(huán)；70-72°C 1min ；4°C結(jié)束循環(huán)溫度；從反應產(chǎn)物中獲得所述待合成最終DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述DNA聚合酶為Phus1n超保真DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述限制性內(nèi)切酶M為限制性內(nèi)切酶 BsrD I 。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述5’-3’外切酶為λ核酸外切酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述反應體系中，每種單鏈DNA片段的用量相等。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述待合成最終DNA片段為序列表中序列I所示的DNA片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法中，根據(jù)序列表中序列1，設計得到用于合成序列I所示DNA片段的如下四條單鏈DNA片段:如序列表中序列2所示的正向DNA單鏈f ;如序列表中序列3所示的反向DNA單鏈rl ;如序列表中序列4所示的反向DNA單鏈r2 ;以及如序列表中序列5所示的反向DNA單鏈r3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述反應體系中的緩沖液組成如下:溶劑為水，溶質(zhì)及濃度為:Tris-HCl 10mmol/L ；KC1 50mmol/L ；MgCl2 2mmol/L ；DDTlmmol/L ；BSA 50 μ g/mL ；Triton X-100 I μ L/mL ;所述反應體系的 pH 為 8.5-9.5。
9.用權(quán)利要求1-8中任一所述方法進行DNA片段拼接合成時，設計用于合成最終DNA片段的系列單鏈DNA片段的方法，包括權(quán)利要求1中步驟(a)所述的步驟。
【文檔編號】C12N15/10GK104178477SQ201310203031
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月28日
【發(fā)明者】凌焱, 陳惠鵬, 李玉霞, 吳遜, 李炳娟, 白東梅, 李偉東, 劉剛, 周圍, 李北平, 高原, 岳俊杰, 梁龍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所