專利名稱：一種含重復(fù)序列基因的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含重復(fù)序列基因的合成方法。
背景技術(shù)：
基因合成是現(xiàn)代生命科學(xué)的一大基石，而人工合成基因的瓶頸是成本和效率。對(duì) 含重復(fù)序列的基因來(lái)說(shuō)，因PCR時(shí)容易發(fā)生非目的序列配對(duì)，所以克服瓶頸的限制更加困 難。至今報(bào)道的最先進(jìn)的基因合成方法，是用軟件(DNAW0RKS、Gene2 oligo等)設(shè)計(jì)引物， 然后用重疊延伸PCR的方法人工合成基因。而軟件設(shè)計(jì)引物最多考慮的是所有引物Tm值 的一致性及引物的長(zhǎng)度，往往無(wú)法兼顧重復(fù)序列。在PCR拼接出現(xiàn)困難或測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺 失的時(shí)候才發(fā)現(xiàn)是重復(fù)序列導(dǎo)致，需要重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行修復(fù)，造成時(shí)間和成本的浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種含重復(fù)序列基因的合成方法。本發(fā)明的含有重復(fù)序列基因的合成方法為采用重疊延伸PCR的方法人工合成基 因，所述重疊延伸PCR時(shí)所采用的引物滿足下列要求當(dāng)所述基因含有相鄰的重復(fù)序列時(shí)，重疊延伸PCR引物中有一條引物的序列包含 該相鄰的重復(fù)序列，且該相鄰的重復(fù)序列不能出現(xiàn)在該引物的5’和3’端；或者，當(dāng)所述基因含有相距較近的重復(fù)序列時(shí)，重復(fù)序列在不同的重疊延伸PCR 引物中呈直接重復(fù)的形式，且所述重復(fù)序列不能出現(xiàn)在該引物的5’和3’端。進(jìn)一步的，所有重疊延伸PCR引物匹配部分的Tm值相似。所述重疊延伸PCR引物長(zhǎng)度為20_50bp。所述重復(fù)序列包括正向重復(fù)序列與反向重復(fù)序列。所述重復(fù)序列的重復(fù)單元一般可包含12-30個(gè)堿基。所述相鄰的重復(fù)序列是指序列中正向重復(fù)序列或反向重復(fù)序列的重復(fù)單元之間 至多間隔10個(gè)堿基。所述相距較近的重復(fù)序列是指序列中正向重復(fù)序列或反向重復(fù)序列的重復(fù)單元 之間間隔11-80個(gè)堿基。所述重復(fù)序列在不同的重疊延伸PCR引物中呈直接重復(fù)的形式是指無(wú)論對(duì)于正 向重復(fù)序列或是反向重復(fù)序列，各重復(fù)單元均出現(xiàn)在不同的引物中，且包含重復(fù)單元的引 物中，重復(fù)單元序列均相同(非互補(bǔ))。所有重疊延伸PCR引物匹配部分的Tm值相似是指各重疊延伸PCR引物匹配部分 的Tm值的最大差值不超過(guò)8°C。本發(fā)明對(duì)含重復(fù)序列的基因片段利用手動(dòng)設(shè)計(jì)引物的方法，兼顧考慮引物的Tm 值和重復(fù)序列，而任意一條引物的長(zhǎng)度都可以隨意改變，從而使相鄰的重復(fù)序列設(shè)計(jì)在同 一條引物中或者相距較近的重復(fù)序列在不同的引物中呈直接重復(fù)的形式，而且重復(fù)不能出 現(xiàn)在引物的5’和3’端，也就是說(shuō)相鄰兩條引物互補(bǔ)配對(duì)的序列必須是特異性的，不能完全是重復(fù)序列，進(jìn)而避免了 PCR出現(xiàn)缺失的情況，大大提高了含重復(fù)序列基因的合成效率。經(jīng)過(guò)數(shù) 百條基因的合成實(shí)驗(yàn)，證明上述重復(fù)序列基因的合成方法是非常高效的。 當(dāng)然，對(duì)于較長(zhǎng)的基因，整條基因都采取手動(dòng)合成引物的方法，和軟件設(shè)計(jì)比較而言，不僅 耗時(shí)而且易出錯(cuò)。所以本發(fā)明的含有重復(fù)序列基因的合成方法一般較適合合成90-350bp 的基因，對(duì)于較長(zhǎng)基因(一般大于350bp)，可以采用基因合成中常見(jiàn)的分段方法，將含有本 文介紹的兩種重復(fù)的序列分作一段，其它序列分作一段或數(shù)段。這樣就可以把不含重復(fù)的 片段用軟件設(shè)計(jì)引物，而含重復(fù)序列的片段可以用手動(dòng)設(shè)計(jì)引物的方法設(shè)計(jì)。因?yàn)楹疚?介紹的兩種重復(fù)的片段一定是較短片段，所以手動(dòng)設(shè)計(jì)引物在幾分鐘之內(nèi)即可完成，不會(huì) 是因?yàn)槭謩?dòng)設(shè)計(jì)而延誤時(shí)間。對(duì)于同一條基因，分段后用這兩種方法設(shè)計(jì)的引物可以單獨(dú) 分段PCR，然后再將PCR產(chǎn)物拼成基因全長(zhǎng)，也可以將分段后設(shè)計(jì)的引物混合在一起做PCR， 直接合成全長(zhǎng)基因。眾所周知，根據(jù)密碼子偏好性進(jìn)行的序列優(yōu)化是避免重復(fù)序列出現(xiàn)的最直接最有 效的方式。但是在很多情況下，研究者為了研究的需要、基因或蛋白結(jié)構(gòu)和功能的要求等， 有些重復(fù)序列是不允許被優(yōu)化的。那么當(dāng)重復(fù)序列必須出現(xiàn)在目的基因序列中時(shí)，只能在 設(shè)計(jì)引物時(shí)考慮到如何防止因重復(fù)序列引起的錯(cuò)配。本發(fā)明介紹的引物設(shè)計(jì)方法可以有效 的避免引物的錯(cuò)配，確保引物之間序列特異性的結(jié)合，減少因重復(fù)序列導(dǎo)致的基因突變率， 進(jìn)而降低了用于修復(fù)突變的引物合成和測(cè)序的費(fèi)用，大大提高了含重復(fù)序列基因的合成效 率。


圖1 實(shí)施例1手工設(shè)計(jì)引物的測(cè)序結(jié)果圖2 實(shí)施例1軟件設(shè)計(jì)引物的測(cè)序結(jié)果圖3 實(shí)施例2手工設(shè)計(jì)引物的測(cè)序結(jié)果圖4 實(shí)施例2軟件設(shè)計(jì)引物的測(cè)序結(jié)果
具體實(shí)施例方式以下列舉具體實(shí)例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制本發(fā)明的保 護(hù)范圍。實(shí)施例1這是一條含有23bp的反向重復(fù)(下劃線標(biāo)記重復(fù)單元)的基因片段，CAAGACCTC GAGTGCTGTTGACAGTGAGCGATCCAAGTCAGTGAAAGATAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTATCTTTCACTGA CTTGGACTGCCTACTGCCTCGGAGGATCCGACAAC (SEQ ID NO 1)，常用軟件 Gene2oligo 設(shè)計(jì)的 PCR 引物如表1所示。表 1
引物名稱 引物序列堿基數(shù)
~~PlCAAGACCTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGAT(SEQ ID NO 2)3權(quán)利要求
1.一種含有重復(fù)序列基因的合成方法，為采用重疊延伸PCR的方法人工合成基因，所 述重疊延伸PCR時(shí)所采用的引物滿足下列要求當(dāng)所述基因含有相鄰的重復(fù)序列時(shí)，重疊延伸PCR引物中有一條引物的序列包含該相 鄰的重復(fù)序列，且所述相鄰的重復(fù)序列不能出現(xiàn)在該引物的5’和3’端；或者，當(dāng)所述基因含有相距較近的重復(fù)序列時(shí)，重復(fù)序列在不同的重疊延伸PCR引物 中呈直接重復(fù)的形式，且所述重復(fù)序列不能出現(xiàn)在引物的5’和3’端。
2.如權(quán)利要求1所述含有重復(fù)序列基因的合成方法，其特征在于，所有重疊延伸PCR弓丨 物匹配部分的Tm值相似。
3.如權(quán)利要求1所述含有重復(fù)序列基因的合成方法，其特征在于，所述重疊延伸PCR弓丨 物長(zhǎng)度為20-50bp。
4.如權(quán)利要求1所述含有重復(fù)序列基因的合成方法，其特征在于，所述重復(fù)序列的重 復(fù)單元為15-30個(gè)堿基。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種含重復(fù)序列基因的合成方法，為采用重疊延伸PCR的方法人工合成基因，所述重疊延伸PCR時(shí)所采用的引物滿足下列要求相鄰的重復(fù)序列設(shè)計(jì)在同一條引物中或者相距較近的重復(fù)序列在不同的引物中呈直接重復(fù)的形式，而且重復(fù)不能出現(xiàn)在引物的5’和3’端。本發(fā)明的含重復(fù)序列基因的合成方法可有效避免PCR出現(xiàn)缺失的情況，大大提高了含重復(fù)序列基因的合成效率。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102031250SQ201010286658
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者王素蓮, 謝海燕 申請(qǐng)人:生工生物工程(上海)有限公司