Tacc3-fgfr3融合基因序列、其檢測方法以及其在檢測膀胱癌中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學基因檢測技術領域，具體涉及TACC3-FGFR3融合基因序 列、其檢測方法以及其在檢測膀胱癌中的應用。
【背景技術】
[0002] 在全世界各個國家和地區(qū)，膀胱癌是一種最常見泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。據(jù)估計， 僅在2008年單年度就有386300例新發(fā)病例和150200例死亡病例。過去的研宄表明：膀胱 癌是一個具有較高異質性的疾病，它有兩個不同亞型（淺表型和侵入型），其臨床表現(xiàn)多變 和遺傳背景復雜。最近，我們開展的一項研宄結果表明：在膀胱移行細胞癌中，有八個染色 質重塑基因（^^，]\0^-]\0^3,0?88?4?300州(1?1，41?10認和（^)6)存在頻發(fā)突變。然而， 目前我們對膀胱癌的體細胞突變情況仍缺乏系統(tǒng)的認識，我們對膀胱癌發(fā)生過程中的關鍵 "驅動基因"也知之甚少。
[0003] 為了確定這些突變基因與膀胱癌發(fā)生的相關性，我們采用過去研宄中所描述 的統(tǒng)計學方法分析了每個基因的體細胞突變率是否顯著高于整個基因組的背景突變 率。通過該分析，我們一共發(fā)現(xiàn)了 37個顯著突變基因，其中包括7個已知膀胱癌的基 因（TP53, HRAS，F(xiàn)GFR3, PIK3CA，RB1，KRAS和TSCl)以及我們過去所發(fā)現(xiàn)的八個染色 質重塑基因（UTX, ARID1A, MLL-MLL3, CREBBP-EP300, NCORl 和 CHD6)。此外，我們還分 析了染色質重塑相關基因和基因家族的突變情況，并在膀胱癌中觀察到多個其他染色 質重塑基因的頻發(fā)突變，包括組蛋白脫甲基酶基因 UTX/UTY(30% )，核染色質重塑基因 ARID1A/4A(17% )，組蛋白賴氨酸甲基轉移酶基因 MLL/MLL3/MLL5(16% )，組蛋白乙酰轉移 酶基因 EP300/400(15% )，SWI/SNF復合體相關基因 SMARCA4/C1(7% )和組蛋白脫甲基酶 基因 JARID1A/B(6% )?？偟膩碚f，在99例病例中，至少有57例（58% )患者的染色質重塑 基因存在體細胞突變，這進一步表明調節(jié)染色質構象的表觀遺傳學改變和翻譯后修飾可能 是膀胱癌發(fā)生過程中的一種主要的驅動機制。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于公開了一種檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法。
[0005] 本發(fā)明第二個目的在于公開了通過上述檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法得到的 TACC3-FGFR3融合基因序列。
[0006] 本發(fā)明第三個目的在于公開了 TACC3-FGFR3融合基因在膀胱癌診斷中的應用。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0008] -種檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，包括下述步驟：
[0009] (1)、制備 mRNA-seq 測序文庫；
[0010] (2)、對步驟（1)中提取的兩種RNA進行RNA測序；
[0011] (3)、對步驟⑵的測序結果進行測序后軟件分析；
[0012] (4)、對于所得融合基因進行驗證。
[0013] 上述技術方案所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，其中，步驟（1)中制備 mRNA-seq測序文庫的過程為：從膀胱癌患者的腫瘤組織和正常膀胱組織中分別提取腫瘤 組織RNA和正常組織RNA，用TruSeq RNA樣品制備試劑盒制備mRNA-seq測序文庫。
[0014] 上述技術方案所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，其中，步驟（2)中兩種 RNA進行RNA測序過程為：將步驟（1)得到的mRNA-seq文庫加樣至HiSeq2000測序平臺， 采用雙末端測序，測序讀長為90bp。
[0015] 上述技術方案所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，其中，步驟（3)中對步驟 (2)的測序結果進行測序后軟件分析的過程為：去除含有測序接頭的序列以及低質量序列 以后，我們利用SOAP2將剩余的高質量序列比對到人類基因組參考序列hgl8和Ensemble 注釋基因集；基于RNA測序，基因表達水平的定量方式為：將總測序量標準化為一百萬條序 列后，每個基因外顯子區(qū)域中每一千個堿基對所比對到的序列的數(shù)量。
[0016] 上述技術方案所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，其中，步驟（4)中對所得 融合基因進行驗證的過程是使用默認參數(shù)的SOAPfuse軟件檢測RNA-seq數(shù)據(jù)中的基因融 合事件。
[0017] 由上述技術方案中任一技術方案所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法檢測 得到的TACC3-FGFR3融合基因。
[0018] 上述技術方案所述的TACC3-FGFR3融合基因在檢測膀胱癌中的應用，優(yōu)選的所述 膀胱癌為膀胱移行細胞癌。
[0019] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0020] 1、TACC3/FGFR3融合基因突變與膀胱癌高患病風險相關；
[0021] 2、TACC3/FGFR3融合基因突變可以作為膀胱癌診斷的輔助基因診斷方式；
[0022] 3、TACC3/FGFR3可以作為潛在的靶向治療靶點。
【附圖說明】：
[0023] 1、圖1為在B59-3腫瘤中發(fā)現(xiàn)FGFR3-TACC3的融合。
[0024] 2、圖2為在BlOO腫瘤中能夠發(fā)現(xiàn)FGFR3-TACC3的融合。
[0025] 3、圖3為融合基因的定位。
[0026] 4、圖4為融合基因中在腫瘤組織和正常組織的變化。
【具體實施方式】：
[0027] 為使本發(fā)明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發(fā)明TACC3-FGFR3融 合基因序列、其檢測方法以及其在檢測膀胱癌中的應用作進一步的說明。
[0028] 本發(fā)明實施例中未作特殊說明的操作方法均按照儀器中的說明書進行操作。
[0029] 試駘例I: TACC3-FGFR3融合基閔在檢測膀胱癌中的應用:
[0030] 一、樣本來源與及選擇標準：
[0031] 通過泌尿生殖系統(tǒng)癌癥基因組聯(lián)盟（UCGC)的中國成員機構，從新診斷的患者中 獲取腫瘤樣本和與其匹配的外周血或正常對照組（相鄰的形態(tài)正常的膀胱組織）。按照倫 理審查委員會規(guī)定的制度，每個病人在招聘研宄之前均簽署了知情同意書?；颊叩脑敿毜?臨床資料見表1。
[0032] 表1 42例膀胱癌患者臨床資料
[0033]
【主權項】
1. 一種檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，包括下述步驟： (1) 、制備mRNA-seq測序文庫； (2) 、對步驟⑴中提取的兩種RNA進行RNA測序； (3) 、對步驟（2)的測序結果進行測序后軟件分析； (4) 、對于所得融合基因進行驗證。
2. 根據(jù)權利要求1所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，其特征在于，步驟（1)中 制備mRNA-seq測序文庫的過程為：從膀胱癌患者的腫瘤組織和正常膀胱組織中分別提取 腫瘤組織RNA和正常組織RNA，用TruSeq RNA樣品制備試劑盒制備mRNA-seq測序文庫。
3. 根據(jù)權利要求1所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，其特征在于，步驟（2)中 兩種RNA進行RNA測序過程為：將步驟（1)得到的mRNA-seq文庫加樣至HiSeq2000測序平 臺，采用雙末端測序，測序讀長為90bp。
4. 根據(jù)權利要求1所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，其特征在于，步驟（3) 中對步驟（2)的測序結果進行測序后軟件分析的過程為：去除含有測序接頭的序列以及低 質量序列以后，我們利用S0AP2將剩余的高質量序列比對到人類基因組參考序列hgl8和 Ensemble注釋基因集；基于RNA測序，基因表達水平的定量方式為：將總測序量標準化為 一百萬條序列后，每個基因外顯子區(qū)域中每一千個堿基對所比對到的序列的數(shù)量。
5. 根據(jù)權利要求1所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法，其特征在于，步驟（4)中 對所得融合基因進行驗證的過程是使用默認參數(shù)的SOAPfuse軟件檢測RNA-seq數(shù)據(jù)中的 基因融合事件。
6. 由權利要求1-5中任一權利要求所述的檢測TACC3-FGFR3融合基因的方法檢測得到 的TACC3-FGFR3融合基因。
7. 權利要求6所述的TACC3-FGFR3融合基因在檢測膀胱癌中的應用，優(yōu)選的所述膀胱 癌為膀胱移行細胞癌。
【專利摘要】本發(fā)明TACC3-FGFR3融合基因序列、其檢測方法以及其在檢測膀胱癌中的應用，屬于分子生物學基因檢測技術領域。包括下述步驟：(1)、制備mRNA-seq測序文庫；(2)、對步驟(1)中提取的兩種RNA進行RNA測序；(3)、對步驟(2)的測序結果進行測序后軟件分析；(4)、對于所得融合基因進行驗證。本發(fā)明具有公開了TACC3-FGFR3融合基因突變與膀胱癌高患病風險相關并且可以作為膀胱癌診斷的輔助基因診斷方式；同時公開了TACC3-FGFR3融合基因突變可以作為潛在的靶向治療靶點的優(yōu)點。
【IPC分類】C12N15-62, C12Q1-68
【公開號】CN104805178
【申請?zhí)枴緾N201410213969
【發(fā)明人】吳松, 蔡志明, 黃毅, 王波, 王倚天, 王永強
【申請人】吳松, 蔡志明
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年5月20日