專利名稱：：用于檢測基孔肯雅和登革熱的基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及適合用于檢測樣本中病原體或其產(chǎn)物的核酸序列的方法。
背景技術(shù)：
：登革熱(dengue，DEN)是大部分熱帶和亞熱帶地區(qū)的流行病，基孔肯雅(chikungunya,CHIK)熱已經(jīng)出現(xiàn)在大部分印度洋島嶼、印度、意大利，并且最近出現(xiàn)在馬來西亞和新加坡。大量的分子測定法已經(jīng)被記載，用于分別檢測DENV和CHIKV。最近已報(bào)道了一種用于鑒別診斷DEN和CHIK的測定法(Dashetal.，2008)。雖然這種測定法可以同時(shí)檢測這兩種感染，但是該檢測是通過常規(guī)的溴化乙啶染色的電泳膠方法進(jìn)行的。相應(yīng)地，這種方法不能區(qū)分真實(shí)檢測結(jié)果和非特異性檢測結(jié)果。本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題和其他問題。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明人提供一種檢測生物樣本中的基孔肯雅和登革熱核酸的方法，該方法包括步驟(a)擴(kuò)增步驟，其中在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中通過基孔肯雅引物和登革熱引物對基孔肯雅和登革熱核酸進(jìn)行擴(kuò)增；(b)檢測步驟，其中(a)中的擴(kuò)增核酸在核酸雜交反應(yīng)中與基孔肯雅核酸探針和登革熱核酸探針雜交。所述擴(kuò)增的核酸可以和多個(gè)登革熱核酸探針雜交。所述登革熱核酸探針可以能夠與不同種登革熱核酸結(jié)合。所述不同的登革熱核酸的每一種均可以表征一種登革熱株系。該方法使得可以鑒定生物樣本中來自具體登革熱株系的核酸。所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。它可以包括二重RT-PCR。所述基孔肯雅和登革熱探針可以是固定的。它們可以固定在微球上。所述微球可以包括編碼的微球。這樣可以使得對微球的鑒定顯示出固定在其上的探針類型。所述編碼的微球可以包括顏色編碼的微球。所述擴(kuò)增的核酸可以被可檢測標(biāo)記物標(biāo)記。該方法可以包括，用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記基孔肯雅核酸引物和登革熱核酸引物。該方法可以使得擴(kuò)增步驟(a)產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記的擴(kuò)增核酸。所述可檢測標(biāo)記物可以包括任何其存在是可顯現(xiàn)的物質(zhì)?？蓹z測標(biāo)記物可以包括為信號產(chǎn)生方式。所述信號產(chǎn)生方式可以包括生物素。它可以包括生物素鏈霉親和素-藻紅蛋白(biotinstreptavidin-phycoerythrin)綴合物。所述方法可以包括，通過檢測可檢測標(biāo)記物以檢測擴(kuò)增的核酸。所檢測的擴(kuò)增核酸可以結(jié)合在微球上。所述核酸可以通過微球固定的基孔肯雅探針和登革熱探針結(jié)合到微球上。所述方法還可以包括鑒定微球以鑒定固定其上的探針。本方法使得能夠鑒定結(jié)合的擴(kuò)增核酸的類型。包括生物素鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物的可檢測標(biāo)記物可以借助第一激光檢測。顏色編碼的微球的類型可以借助第二激光確定。所述第一激光可以與所述第二激光有不同的波長?？蓹z測標(biāo)記物的檢測與顏色編碼微球的鑒定可以同時(shí)進(jìn)行，或者不同時(shí)進(jìn)行?？蓹z測標(biāo)記物的檢測可以與顏色編碼微球的鑒定類型可同步進(jìn)行?；卓涎藕怂嵋锟梢杂杀鞤l.1中所示的核酸序列組成。登革熱核酸引物可以由表Dl.2中所示的核酸序列組成，或者以上兩種情況同時(shí)出現(xiàn)?；卓涎藕怂崽结樋梢杂杀鞤2.1中所示的核酸序列組成。登革熱核酸探針可以由表D2.2中所示的核酸序列組成。根據(jù)本發(fā)明的第2方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)本發(fā)明第1方面的方法，所述方法用于同步檢測生物樣本中基孔肯雅的存在情況和確定登革熱株系。根據(jù)本發(fā)明的第3方面，本發(fā)明人提供了表Dl.1、表D1.2、表D2.1或表D2.2中所示的核酸序列，或者其變體、同系物、衍生物或片段。根據(jù)本發(fā)明的第4方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明前述方面的兩條或多條序列的結(jié)合物。所述結(jié)合物可以包含表Dl.1和表Dl.2中列出的兩條或多條序列，或者表D2.1和表D2.2中列出的兩條或多條序列，或者以上兩種情況同時(shí)出現(xiàn)。該結(jié)合物可以由表Dl.1和表Dl.2中所示的每一種核酸序列，或者其變體、同系物、衍生物或片段組成。該結(jié)合物可以由表D2.1和表D2.2中所示的每一種核酸序列，或者其變體、同系物、衍生物或片段組成。該結(jié)合物可以由以上每一種結(jié)合物的組成的結(jié)合物來組成。所述核酸或結(jié)合物可以包括經(jīng)標(biāo)記的核酸。所述標(biāo)記物可以包括生物素。它可以包括生物素鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物。所述核酸或結(jié)合物可以在溶液中。它可以包含固定的核酸。所述核酸可以固定在微球上。它可以固定在陣列上。所述陣列可以包括微陣列。根據(jù)本發(fā)明的第5方面，本發(fā)明人提供了由以下核酸序列組成的結(jié)合物表Dl.1和表Dl.2中所示的每一種核酸序列或其變體、同系物、衍生物或片段；和(b)表D2.1和表D2.2中所示的每一種核酸序列或其變體、同系物、衍生物或片段；其中(a)的核酸是在溶液中并且(b)的核酸固定在微球上。在第6方面中，本發(fā)明提供了一種用于檢測患者中基孔肯雅癥或登革熱的試劑盒，所述試劑盒包括上文列出的核酸或結(jié)合物，以及使用說明書。在本發(fā)明的第7方面中，本發(fā)明提供了上文列出的核酸序列或結(jié)合物，作為基孔肯雅或登革熱基因的核酸擴(kuò)增引物的用途，或者作為基孔肯雅或登革熱基因的核酸雜交探針的用途。根據(jù)本發(fā)明的第8方面，本發(fā)明人提供了一種診斷個(gè)體中基孔肯雅癥或登革熱的方法，所述方法包括從所述個(gè)體中獲得生物樣本并且通過上文列出的方法檢測其中的基孔肯雅或登革熱核酸。根據(jù)本發(fā)明的第9方面，本發(fā)明人提供了一種治療或預(yù)防個(gè)體中基孔肯雅癥或登革熱的方法，所述方法包括根據(jù)本發(fā)明第8方面檢測個(gè)體中的基孔肯雅癥或登革熱，并且對所述個(gè)體給予合適的治療和預(yù)防。除非另外聲明，本發(fā)明的實(shí)施將采用常規(guī)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。參見例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,andΤ.Maniatis，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual，SecondEdition，Books1—3，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel，F(xiàn).Μ.etal.(1995andperiodicsupplements；CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9，13，and16，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques，JohnWiley&Sons；J.M.PolakandJames0'D.McGee，1990，InSituHybridization-PrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach，IrlPress；D.Μ.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-314-2)，1855·HandbookofDrugScreening，editedbyRamakrishnaSeethala，PrabhavathiB.Fernandes(2001,NewYork，NY，MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)；andLabRef:AHandbookofRecipes，Reagents，andOtherReferenceToolsforUseattheBench，EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些一般性文獻(xiàn)的每一篇均通過引用的方式納入本文。圖1同步CHIK和DENV測定的靈敏度。圖2以該同步測定、單CHIKV-Taqman測定和單DENSYBR測定從臨床樣本獲得的結(jié)果。圖3的示意圖顯示了基孔肯雅和登革熱引物在用于實(shí)施例中列出的測定目的的管中的排列位置。圖4的流程示意圖顯示了實(shí)施例中列出檢測方案。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人提供了表Dl.1、表Dl.2、表D2.1和表D2.2中所示的核酸序列或者其變體、同系物、衍生物或片段。還提供兩條或多條序列的結(jié)合物。所述核酸序列或結(jié)合物可用來檢測基孔肯雅和登革熱，或者區(qū)分不同登革熱株系，或兩者都可以?；卓涎判蛄泻偷歉餆嵝蛄斜景l(fā)明人記載了多條基因序列。這些序列可以用在核酸序列所適合的任何方法6中。簡便起見，本公開內(nèi)容的主題的核酸序列可以稱作“基孔肯雅序列”和“登革熱序列”?！盎卓涎判蛄校?，和“登革熱序列，，可以包括對應(yīng)于基孔肯雅核酸序列和登革熱核酸序列的一部分的序列。例如，基孔肯雅序列可以包括基孔肯雅基因。類似地，登革熱序列可以包括登革熱基因?；卓涎呕蚩梢园ㄔ醋杂诨卓涎挪《镜娜我换蚧蛘呤腔卓涎挪《镜娜我换?。登革熱基因可以包括源自于登革熱病毒的基因或者是登革熱病毒的基因。所述序列還可以包含沒有這種對應(yīng)關(guān)系的其他核酸殘基?；卓涎判蛄锌砂ū鞤l.1或表Dl.2中列出的序列。所述登革熱序列可以包括表D2.1或表D2.2中列出的序列。所述基孔肯雅或登革熱序列包括任一這類序列的變體、同系物、衍生物或片段。基孔肯雅病毒可以包括基孔肯雅病毒的任一株系。基孔肯雅病毒包括IND-63-WB1株系(GenBank登錄號EF027140)?；卓涎挪《究梢园ㄒ韵氯我环NNC004162D570/06(非洲)、EUM4823:ITA07_RA1(意大利)、EU037962:Wuerzburg(德國)、EF012359D570/06(毛里求斯/非洲大陸海岸的沿岸島國)；EF210157=DRDEHydISW06(印度)、EF452493:AF15561(曼谷)、AF3690M:S27_非洲原型(非洲),DQ443544:LR20060PY1(印度洋島山與返回的旅亍者(TravelersReturningfromIndianOceanIslands))禾口AF490259:羅斯(羅斯/蘇格蘭)。登革熱病毒可以包括登革熱病的任一株系。所述登革熱病毒可以包括DEN病毒1型株系D1/SG/06K2290DK1/2006(EU08U81)。它可以包括EU08U81、EU081276、EU08U61、NC_001477、AY762084和M87512中的任一種或多種。登革熱病毒可以包括2型株系D2/SG/05K3^5DK1/2005(EU081177)。它可以包括EU081177、NC_001474、AF169680、M20558、AY858036和AB122022中的任一種或多種。登革熱病毒可以包括3型新加坡株系(AY66^91)。它可以包括EU081225、EU081221、EU081197、NC_001475、AY66269和EU081214中的任一種或多種。登革熱病毒可以包括4型株系ThD4_0734_00(AY618993)。它可以包括AY762085、AY947539,NC_002640,AY618993,AY152120和AY762085中的任一種或多種。基孔肯雅病毒或登革熱病毒可以包括人基孔肯雅病毒或登革熱病毒或者動物基孔肯雅病毒或登革熱病毒。基孔肯雅基因可以包括El基因。登革熱基因可以包括5NS端到3’NTR端編碼和非編碼區(qū)。在使用術(shù)語“基因”處顯而易見的是，基因可以包括編碼區(qū)域、非編碼區(qū)域或者包括兩者。本文記載的基孔肯雅和登革熱序列可以是單鏈或雙鏈。根據(jù)具體情況，本文記載的基孔肯雅和登革熱序列可以具體地能結(jié)合到相關(guān)的基孔肯雅或登革熱基因上。所述基孔肯雅或登革熱基因可以包括DNA、RNA、mRNA、cDNA等，或者其一部分。所述基孔肯雅或登革熱基因可以包括El基因(基孔肯雅)或5賂到3’附1編碼和非編碼區(qū)(登革熱)，或者上述兩種情況都存在。作為該過程的一部分，可以檢測到其他基因。所述序列可以被用來檢測樣本中基孔肯雅或登革熱核酸的存在情況。它們可以被用來檢測樣本中基孔肯雅或登革熱病毒或其產(chǎn)物的存在情況。它們可以被用來檢測樣本中7具體株系的基孔肯雅或登革熱病毒的存在情況。它們可以被用來區(qū)別這些株系。本文記載的基孔肯雅和登革熱序列具體地能夠與基孔肯雅或登革熱株系的相關(guān)基孔肯雅或登革熱基因結(jié)合。例如，登革熱序列可以區(qū)分不同的登革熱株系。因此，登革熱序列具體地能夠與源自不同登革熱株系的多種變體結(jié)合。登革熱序列可以是能結(jié)合某種基因變體而不結(jié)合其他變體。登革熱序列可以僅能結(jié)合一種基因變體。因此，本發(fā)明人公開了包括能與不同的5NS到3’NTR編碼區(qū)或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列的登革熱序列。本發(fā)明人公開的登革熱序列包括能與登革熱病毒1型株系的5NS到3’NTR編碼或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列。例如，登革熱序列可以包括能與登革熱病毒1型株系Dl/SG/06K2290DK1/2006(EU081281)的5NS到3，NTR編碼或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列。本發(fā)明人公開的登革熱序列包括能與登革熱病毒1型株系的5NS到3’NTR編碼或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列。例如，登革熱序列可以包括能與登革熱病毒2型株系D2/SG/05K3295DK1/2005(EU081177)的5NS到3，NTR編碼或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列。本發(fā)明人公開的登革熱序列包括能與登革熱病毒1型株系的5NS到3’NTR編碼或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列。例如，登革熱序列可以包括能與登革熱病毒3型新加坡株系(AY66^91)的5NS到3，NTR編碼或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列。本發(fā)明人公開的登革熱序列包括能與登革熱病毒1型株系的5NS到3’NTR編碼或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列。例如，登革熱序列可以包括能與登革熱病毒4型株系ThD4_0734_00(AY618993)的5NS到3，NTR編碼或非編碼區(qū)變體結(jié)合的核酸序列。登革熱序列可以用來區(qū)別不同的登革熱病毒株系。例如，它們可以用于區(qū)分登革熱病毒株系1、登革熱病毒株系2、登革熱病毒株系3和登革熱病毒株系4?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄锌梢杂迷谄渲泻怂嵝蛄型ǔ＿m合的任何方法中。例如，如上文所述，它們可以具體地用作檢測基孔肯雅和登革熱的引物或探針。基孔肯雅和登革熱序列可以用作核酸引物。所述引物可以包括在表Dl.1和表D2.1中列出的一個(gè)或多個(gè)基孔肯雅和登革熱序列。所述引物可以用于通過本領(lǐng)域中的任意已知方法擴(kuò)增核酸。例如，可采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。再例如，可采用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。再者，可采用雙重RT-PCR。還可以使用其他擴(kuò)增方法，例如LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、dePCR(數(shù)字化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、LongPCR、定量終點(diǎn)PCR、定量實(shí)時(shí)PCT、cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE),TMA,NASBA等。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的，用于將基孔肯雅和登革熱序列在這些方法中使用的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄锌梢宰鳛榻Y(jié)合物提供。例如，本發(fā)明人公開了表Dl.1、表Dl.2、表D2.1和表D2.2中列出的任意兩個(gè)或多個(gè)序列的結(jié)合物。如表Dl.1或表D2.1中列出的，所述結(jié)合物可以包括對應(yīng)于正向引物和反向引物的兩個(gè)序列。兩個(gè)序列的結(jié)合物可以包括具體基因的正向引物和該基因的反向引物。還提供了這類成對結(jié)合物的結(jié)合物。基孔肯雅和登革熱序列可以被用作探針。所述探針可以包括表Dl.2和表D2.2中列出的一個(gè)或多個(gè)基孔肯雅和登革熱序列。標(biāo)記擴(kuò)增或雜交反應(yīng)可以包括在基孔肯雅或登革熱序列和靶標(biāo)之間的結(jié)合。為此目的，可以對引物或探針進(jìn)行標(biāo)記。作為擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增核酸可以被標(biāo)記。標(biāo)記可以包括任何產(chǎn)生信號的實(shí)體。所述標(biāo)記物可以包括放射性標(biāo)記物，例如32P。所述標(biāo)記物可以包括非放射性標(biāo)記物，例如異羥基洋地黃毒苷元(digoxigenin)。標(biāo)記物可以包括發(fā)光工具。所述標(biāo)記物可以包括任何適用的染料，例如熒光染料。所述標(biāo)記物可以包括藻紅蛋白。所述標(biāo)記物可以通過任何合適的方式連接至探針、核酸或引物。所述連接可以是暫時(shí)的、瞬間的、半永久的或永久的。所述連接可以是共價(jià)連接、離子連接、通過氫鍵鍵合、通過范德華力連接等。所述連接可以是天然的化學(xué)連接。它可以是直接的或通過中間物介導(dǎo)的。合適的結(jié)合劑可以連接至待標(biāo)記的實(shí)體例如探針、核酸、引物等。帶有所述標(biāo)記物的結(jié)合配偶體(bindingpartner)可以通過結(jié)合于所述結(jié)合劑而連接至待標(biāo)記的實(shí)體上。例如，生物素部分可以連接至待標(biāo)記的實(shí)體上，并且結(jié)合于標(biāo)記物上的鏈霉親和素(strepavin)也可以連接至其上。待標(biāo)記的核酸例如擴(kuò)增的核酸可以具有為此目的而通過合適的經(jīng)生物素標(biāo)記的引物連接至其上的生物素，這使得所述生物素部分作為擴(kuò)增反應(yīng)的一部分整合至所述擴(kuò)增的核酸中。探針、引物、核酸等可以結(jié)合至生物素以及結(jié)合到所述生物素上的鏈霉親和素-藻紅蛋白，以將藻紅蛋白標(biāo)記連接至探針、引物、核酸等。作為第一步，生物素標(biāo)記的引物可以被用來產(chǎn)生生物素標(biāo)記的擴(kuò)增核酸。第二步可以包括將所述生物素標(biāo)記的擴(kuò)增核酸暴露于鏈霉親和素-藻紅蛋白。鏈霉親和素和生物素的結(jié)合可有效地以藻紅蛋白標(biāo)記物標(biāo)記所述擴(kuò)增的核酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法檢測所述信號。例如，熒光素標(biāo)記物可以通過以合適激發(fā)波長的光激發(fā)進(jìn)行檢測，發(fā)射信號可以通過多種方法進(jìn)行檢測，例如通過目測、閃爍計(jì)數(shù)、顯微術(shù)、膠片或數(shù)字成像術(shù)、光電探測器等。如果需要(例如為了追蹤所述反應(yīng)的產(chǎn)量或進(jìn)程)可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法定量所述信號?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄锌梢栽谌芤褐惺褂靡杂糜谶M(jìn)行常規(guī)的核酸雜交。所述雜交可以在嚴(yán)格雜交條件或非嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行。嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例有65°C下0.IXSSC(IXSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0)。雜交條件的另一實(shí)施例是48mM磷酸鹽緩沖液，1742.4mMNaCl、0.24%土溫20、4.8X登哈特氏溶液(Denhardt，ssolution)、2.4nM的一種探針或多種探針(例如3種探針)——磷酸鹽緩沖液包含12.96mM氯化鉀和657.6mM氯化鈉。使用這種核酸序列探針檢測靶核酸序列的方法在本領(lǐng)域中是已知的，記載于例如Maniatisetal中。雜交可以用在溶液中的或固定的基孔肯雅和登革熱序列進(jìn)行?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄锌梢允枪潭ǖ模缤ㄟ^結(jié)合到底物上。底物可以包括硅基質(zhì)?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄锌梢砸砸?guī)則的空間構(gòu)象提供，例如以陣列的形式。所述陣列可以包括微陣列。產(chǎn)生核酸陣列的方法在本領(lǐng)域中是已知的。所述陣列可以包括表Dl.1、表Dl.2、表D2.1和表D2.2中列出的一個(gè)或多個(gè)基孔肯雅和登革熱序列。所述陣列可以包括多個(gè)這類序列。所述陣列可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、934、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59,60,61等個(gè)這類序列。所述陣列可以包括一個(gè)或多個(gè)對照序列?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄锌梢怨潭ㄔ诓煌膶?shí)體上，或者在同一實(shí)體上。微球基孔肯雅和登革熱序列可以固定于微粒例如小珠上?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄锌梢怨潭ㄔ谖⒅榛蛘呶⑶蛏稀＿@類小珠、微珠、微球等在本領(lǐng)域中是已知的，可市購獲得，并且詳盡記載在文獻(xiàn)和下文中。所述小珠、微珠、微球等在本文其余部分為簡單起見稱作“微球”。它們可以被標(biāo)記，目的是使得它們可以被追蹤。標(biāo)記方法和標(biāo)記物的類型依據(jù)微球的性質(zhì)等而變化，但本文其他處和文獻(xiàn)中描述的一般性原則將有助于微球的選擇?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄锌晒潭ㄓ谄渖系奈⑶蚩梢园ㄈ魏纬叽绲娜魏魏线m粒子。例如，微球可以包括瓊脂糖小珠、聚丙烯酰胺小珠、硅膠小珠等?？梢詫λ鑫⑶蜻M(jìn)行編碼用于鑒定。任何編碼或標(biāo)記系統(tǒng)都可以采用，只要它使得可進(jìn)行對具體微球的解碼和鑒定。編碼可以通過物理標(biāo)記的方式，或者利用其他的特征，例如光學(xué)、物理、化學(xué)等特征。標(biāo)記或編碼可以包括顏色編碼。因而，在任何具體組中的兩種不同小珠都可以通過顏色區(qū)分。所述顏色編碼可以通過任何合適的方式例如激光進(jìn)行解碼。相同或者不同的基孔肯雅和登革熱序列可以被固定在不同小珠上。例如，第一序列可以固定在第一小珠上，第二序列可以固定在第二小珠上，這兩種小珠有可區(qū)分的特征例如標(biāo)記或者編碼。例如，微球可以包括LuminexxMAP微球,如www.luminexcorp.com/technology/index,html中描述的。這類微球有典型的5.6微米大小，包括結(jié)合于其上的染料來提供顏色編碼。對微球顏色編碼的解碼使得能鑒定單個(gè)的微球，因此能確定其上結(jié)合的探針類型。通過這種方式，可以獲知結(jié)合于探針或與探針雜交的核酸序列的類型。Luminex網(wǎng)站對LuminexxMAP微球技術(shù)的描述提供如下“首先，將被稱作微球的微小珠子以Luminex顏色編碼成100個(gè)不同的組。每個(gè)小珠組用專門用于具體生物測定的試劑包被，使得可捕捉和檢測來自樣本的特定分析物。在Luminex小巧型分析儀內(nèi)，激光激發(fā)鑒定每個(gè)微球粒子的內(nèi)部染料，以及在測定過程中捕獲的任何報(bào)告染料。對每個(gè)小珠組產(chǎn)生很多讀數(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果。以這種方式，xMAP技術(shù)使得可以在單一樣本中快速并準(zhǔn)確地同時(shí)進(jìn)行多達(dá)100次單獨(dú)測定的多重測定?！蔽⑶虻劝切┯糜谀z色譜術(shù)的微球，例如凝膠過濾介質(zhì)。實(shí)例包括葡聚糖(kphadex)，例如小珠尺寸40-120μm的葡聚糖G_10(SigmaAldrich目錄號27，103-9)、小珠尺寸40-120μm的葡聚糖G-15(SigmaAldrich目錄號27，104-7)、小珠尺寸20-50μm的葡聚糖G-25(SigmaAldrich目錄號27，106-3)、小珠尺寸20-80μm的葡聚糖G-25(SigmaAldrich目錄號27，107-1)、小珠尺寸50-150μm的葡聚糖G-25(SigmaAldrich目錄號27，109-8)、小珠尺寸100-300μm的葡聚糖G-25(SigmaAldrich目錄號27，110-1)、小珠尺寸20-50μm的葡聚糖G-50(SigmaAldrich目錄號27，112-8)、小珠尺寸20-80μm的葡聚糖G-50(SigmaAldrich目錄號27，113-6)、小珠尺寸50-150μm的葡聚糖G-50(SigmaAldrich目錄號27，114-4)、小珠尺寸100-300μm的葡聚糖G-50(SigmaAldrich目錄號27，115-2)、小珠尺寸20-50μm的葡聚糖G-75(SigmaAldrich目錄號27，116-0)、小珠尺寸40-120μm的葡聚糖G-75(SigmaAldrich目錄號27，117-9)、小珠尺寸20-50μm的葡聚糖G-100(SigmaAldrich目錄號27，118-7)、小珠尺寸40-120μm的葡聚糖G-100(SigmaAldrich目錄號27，119-5)、小珠尺寸40-120μm的葡聚糖G-150(SigmaAldrich目錄號27，121-7)和小珠尺寸40-120μm的葡聚糖G-200(SigmaAldrich目錄號27，123-3)。還可以使用瓊脂糖小珠，例如在液相色譜法中使用的瓊脂糖小珠。實(shí)例有Q-瓊脂糖、S-瓊脂糖和SP-瓊脂糖小珠，例如AmershamBiosciencesEuropeGmbH(Freiburg、德國)公司出售的Q瓊脂糖XL(目錄號17-5072-01)、Q瓊脂糖XL(目錄號17-5072-04)、Q瓊脂糖XL(目錄號17-5072-60)、SP瓊脂糖XL(目錄號17-5073-01)、SP瓊脂糖XL(目錄號17-5073-04)和SP瓊脂糖XL(目錄號17-5073-60)等?；卓涎藕偷歉餆嵝蛄袡?quán)利要求1.一種檢測生物樣本中的基孔肯雅和登革熱核酸的方法，所述方法包括步驟(a)擴(kuò)增步驟，其中在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中通過基孔肯雅引物和登革熱引物對基孔肯雅和登革熱核酸進(jìn)行擴(kuò)增，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)包括例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或二重RT-PCR；和(b)檢測步驟，其中(a)中的擴(kuò)增核酸在核酸雜交反應(yīng)中與基孔肯雅核酸探針和登革熱核酸探針雜交，優(yōu)選其中所述擴(kuò)增核酸和能夠與不同登革熱核酸結(jié)合的多個(gè)登革熱核酸探針雜交，所述不同登革熱核酸的每一種均表征一個(gè)登革熱株系，以能夠鑒定生物樣本中具體登革熱株系的核酸。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基孔肯雅和登革熱探針固定在編碼的微球上，使得對微球的鑒定可顯示固定在其上的探針類型，優(yōu)選其中所述編碼的微球包括顏色編碼的微球。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述擴(kuò)增的核酸被可檢測標(biāo)記物標(biāo)記，優(yōu)選通過用可檢測標(biāo)記物來標(biāo)記基孔肯雅核酸引物和登革熱核酸引物，使得擴(kuò)增步驟(a)生成經(jīng)標(biāo)記的擴(kuò)增核酸，所述可檢測標(biāo)記物優(yōu)選包括生物素或生物素鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物，或在其中。4.權(quán)利要求1、2或3任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括，檢測可檢測標(biāo)記物以檢測結(jié)合至微球固定的基孔肯雅和登革熱探針上的擴(kuò)增核酸，所述方法優(yōu)選還包括鑒定微球以鑒定固定在其上的探針并因此鑒定結(jié)合的擴(kuò)增核酸的類型。5.前述權(quán)利任一項(xiàng)的方法，其中包括生物素鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物的可檢測標(biāo)記物借助第一激光檢測，所述顏色編碼微球的類型借助不同波長的第二激光測定，優(yōu)選其中所述可檢測標(biāo)記物的檢測與所述顏色編碼微球的鑒定同步進(jìn)行。6.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)方法，其中(a)所述基孔肯雅核酸引物由表Dl.1中所示的核酸序列組成，或者其中所述登革熱核酸引物由表Dl.2中所示的核酸序列組成，或者以上條件同時(shí)滿足；或者(b)所述基孔肯雅核酸探針由表D2.1中所示的核酸序列組成，或者所述登革熱核酸探針由表D2.2中所示的核酸序列組成，或者以上條件同時(shí)滿足。7.前述權(quán)利任一項(xiàng)的方法，用于同時(shí)檢測生物樣本中的基孔肯雅的存在情況和確定登革熱的株系。8.表Dl.1、表Dl.2、表D2.1或D2.2中所示的核酸序列或者其變體、同系物、衍生物或片段。9.一種結(jié)合物，所述結(jié)合物是權(quán)利要求15的兩種或更多種序列的結(jié)合，優(yōu)選包含表Dl.1和表Dl.2中列出的兩種或更多種序列，或者表D2.1和表D2.2中列出的兩種或更多種序列，或者以上兩種情況同時(shí)出現(xiàn)。10.權(quán)利要求9的結(jié)合物，其中所述結(jié)合物的組成如下(a)表Dl.1和表Dl.2中所示的每一種核酸序列或者其變體、同系物、衍生物或片段；(b)表D2.1和表D2.2中所示的每一種核酸序列或者其變體、同系物、衍生物或片段；或(c)由以上(a)和(b)組成的結(jié)合物。11.權(quán)利要求8、9或10的核酸或結(jié)合物，包含經(jīng)標(biāo)記的核酸，其中所述標(biāo)記物包括例如生物素或者生物素鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物。12.權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)的核酸或結(jié)合物，包含固定的核酸，優(yōu)選其中所述核酸固定于微球或陣列例如微陣列上。13.—種結(jié)合物，組成如下(a)表Dl.1和表Dl.2中所示的每一種核酸序列或者其變體、同系物、衍生物或片段；和(b)表D2.1和表D2.2中所示的每一種核酸序列或者其變體、同系物、衍生物或片段；其中(a)的核酸是在溶液中，并且(b)的核酸固定在微球上。14.一種用于檢測患者中基孔肯雅癥或登革熱的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的核酸或結(jié)合物，以及使用說明書。15.權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)的核酸序列或結(jié)合物作為基孔肯雅或登革熱基因的核酸擴(kuò)增引物的用途，或作為基孔肯雅或登革熱基因的核酸雜交探針的用途。16.一種診斷個(gè)體中基孔肯雅癥或登革熱的方法，所述方法包括從所述個(gè)體獲得生物樣本，通過權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法檢測其中的基孔肯雅和登革熱核酸。17.一種治療或預(yù)防個(gè)體中基孔肯雅癥和登革熱的方法，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求16檢測個(gè)體中的基孔肯雅癥和登革熱，和對所述個(gè)體給予合適的治療或預(yù)防。全文摘要本發(fā)明人公開了一種檢測生物樣本中的基孔肯雅和登革熱核酸的方法，所述方法包括步驟(a)擴(kuò)增步驟，其中在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中通過基孔肯雅引物和登革熱核酸引物對基孔肯雅和登革熱核酸進(jìn)行擴(kuò)增；和(b)檢測步驟，其中將(a)中的擴(kuò)增核酸在核酸雜交反應(yīng)中與基孔肯雅核酸探針和登革熱核酸探針雜交。還公開了能檢測基孔肯雅和登革熱的引物和探針序列。文檔編號G01N33/48GK102216771SQ200980144928公開日2011年10月12日申請日期2009年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日發(fā)明者T·巴克漢姆,井上雅文申請人:新加坡科技研究局,陳篤生醫(yī)院