專利名稱：一種5－烯醇丙酮酰－莽草酸－3－磷酸合成酶基因的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因合成方法，尤其涉及一種可應(yīng)用于創(chuàng)制抗草甘膦的雙子葉植物如油菜、大豆、棉花等以及抗草甘膦的單子葉植物如水稻、玉米、小麥等合成的基因的方法。
5-烯醇丙酮酰-草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)是芳香族氨基酸，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸合成過程的關(guān)鍵酶，存在于植物和細菌中。草甘膦是一種廣譜、內(nèi)吸、高效的滅生性除草劑，可以通過植物的韌皮部進行運輸。它通過與該酶分子的結(jié)合，阻斷這些氨基酸的生物合成，從而引起細胞死亡。
通過改變EPSPS蛋白一級結(jié)構(gòu)可以阻礙草甘膦與酶分子的結(jié)合從而使其獲得對草甘膦的抗性。沙門氏桿菌aroA結(jié)構(gòu)基因(編碼EPSPS)上101位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸后獲得了對草甘膦的抗性(Comai，L.，Sen，L.C.，Stalker，D.M.，1983.An altered aroA gene product confers resistanceto the herbicide glyphosate.Science 221370-371)。從已有研究結(jié)果得知，目前所用的抗草甘膦EPSPS基因都是通過分子生物學(xué)手段直接從植物(包括油菜、矮牽牛、棉花、大豆等)或細菌(包括大腸桿菌和沙門氏桿菌)中克隆出來再轉(zhuǎn)移到植物細胞中的。如，來自沙門氏桿菌的EPSPS基因?qū)肓藷煵?Comai，Letal.1985. Expression in plants of amutant aroA gene from Salmonella typhimuriumconfers tolerance to glyphosate.Nature 317741-744.)，來自大腸桿菌的EPSPS基因?qū)肓藷煵?Della-Cioppa，G.et al.1987.Targeting a herbicide-resistant enzyme from E.coli to chloroplasts ofhigher plants.Bio/Technology 5579-584.)，來自矮牽牛的EPSPS基因?qū)肓税珷颗?Shah，D.M et al.1986.Engineering herbicide tolerance in transgenicplants.Science 233478-481.)。美國孟山都(Monsanto)公司直接從抗草甘膦的變異植物細胞系中克隆出EPSPS基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將這種EPSPS基因?qū)胫参镏杏闪丝共莞熟⒌拇蠖埂⒚藁?、油菜新品種，并將該項技術(shù)申請了專利(專利號5188642)。
相對于本發(fā)明而言，上述從生物體直接克隆EPSPS基因的方法有兩點不足1、步驟多，程序復(fù)雜，耗時長。目前從生物體(尤其是植物體)中克隆基因的方法很多，如轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)、圖位克隆技術(shù)等，但無論那種技術(shù)，所需的時間都很長，步驟相當繁瑣。一般而言，克隆一個基因所需的時間要2-3年，而且花費也相當巨大。
2、基因本身沒有經(jīng)過密碼子優(yōu)化，因而使基因表達效率受到限制。通常，基因是一段有功能的DNA序列，而這段DNA序列就是由密碼子組成的?；蛟诩毎麅?nèi)首先轉(zhuǎn)錄成信使RNA(即mRNA)，然后由mRNA再翻譯成蛋白質(zhì)。在此過程中，核糖體首先要識別mRNA，然后啟動密碼子的譯讀。因此，如果密碼子不是該生物所偏愛的，則核糖體的識別效率就降低，因此影響到該基因的表達水平。
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種快速、經(jīng)濟，表達效率高的EPSPS基因設(shè)計合成方法。針對在背景技術(shù)中所談到的直接從生物體中克隆基因的兩點不足，利用本方法合成EPSPS基因可以大大節(jié)省時間，一般只需2個月左右，花費也大大降低；同時，因為經(jīng)過對密碼子的優(yōu)化，可以預(yù)計，所合成的EPSPS基因?qū)休^高的表達效率。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明主要介紹一種全新的人工設(shè)計EPSPS基因的方法原理以及用該方法獲得的基因和基因序列。所合成的EPSPS基因是一雜合體基因，具有抗草甘膦的特征。它所編碼的蛋白與信號肽以正確閱讀框架相融合，后者可以將前者導(dǎo)入到植物細胞的葉綠體中。所合成的EPSPS基因可以在植物細胞和再生植株中進行表達，因而使植物細胞和再生植株獲得對草甘膦的抗性。所述的植物包括單子葉植物如水稻、玉米、小麥等，以及雙子葉植物如棉花、油菜、大豆等，但并僅限于上述植物。
從已有研究結(jié)果得知，目前所用的抗草甘膦EPSPS基因都是直接從植物(包括油菜、矮牽牛、棉花、大豆等)和細菌(包括大腸桿菌和沙門氏桿菌)中克隆出來的。本發(fā)明通過重新設(shè)計，綜合了植物和細菌來源的EPSPS蛋白的不同結(jié)構(gòu)域而構(gòu)成一種EPSPS蛋白。
已有知識表明，編碼氨基酸的密碼子在不同生物體中的使用頻率不同，表現(xiàn)在植物中G+C的含量較高，而其他生物體G+C含量較低。這種密碼子的使用頻率直接影響蛋白質(zhì)表達水平的高低。為了使抗草甘膦EPSPS蛋白在植物中能夠高效表達，將EPSPS基因序列中的密碼子按照植物高效表達基因密碼子使用偏向進行優(yōu)化，第三位堿基G+C的含量提高到68.5％。
目前，獲得基因的方法基本上可以分為兩種，一種是從生物體中直接克隆，另外一種就是采用人工合成的方法。本發(fā)明所述的基因合成方法的特征是將DNA雙鏈分成若干個寡核苷酸片段進行人工化學(xué)合成，然后使這些寡核苷酸片段退火，配對成為完整的雙鏈DNA分子。
已有知識表明，有兩條途徑可以使植物獲得對除草劑草甘膦的抗性。一種是使植物體內(nèi)過量表達野生型EPSPS蛋白，另一種是使野生型EPSPS蛋白上與草甘膦結(jié)合的結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變，這樣草甘膦對它就不能產(chǎn)生抑制作用。本發(fā)明根據(jù)已有知識，在EPSPS蛋白中引入點突變，使草甘膦對EPSPS蛋白不能產(chǎn)生抑制作用，因此，所述的EPSPS具有抗草甘膦的特征。
本發(fā)明中所述的EPSPS基因可以利用不同的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)移至植物中，這些轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法和基因槍法等。
EPSPS基因經(jīng)過在核甘酸和蛋白水平上的修飾，重組。該基因的編碼區(qū)是由分別來源于植物和微生物的DNA序列所組成的編碼EPSPS蛋白的雜合體序列編碼該酶的基因序列按照植物選擇偏向進行了密碼子優(yōu)化。所述的EPSPS酶基因采用化學(xué)方法進行人工合成。所獲得的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶具有抗除草劑的特征。所獲得的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶可以在植物中合成。
本發(fā)明的效果在于由本方法合成的EPSPS基因在植物中具有更高的表達水平。如前面所解釋的那樣，由于在EPSPS基因的設(shè)計過程中，已經(jīng)人為地針對該基因?qū)硪D(zhuǎn)化的植物(包括水稻、玉米、油菜、大豆、棉花等)所偏愛使用的密碼子進行優(yōu)化改造，因此當該基因在植物細胞中進行表達時(與未經(jīng)密碼子優(yōu)化的EPSPS基因相比)，所轉(zhuǎn)錄出的mRNA就會被核糖體高效轉(zhuǎn)譯，其結(jié)果是EPSPS蛋白就會在細胞中有較高的含量，從而對除草劑草甘膦具有較高水平的抗性。
以下根據(jù)附圖對本發(fā)明的實施例加以詳述

圖1抗草甘膦基因序列及其編碼的氨基酸序列，圖2抗草甘膦基因片段的合成示意圖，圖3抗草甘膦基因CHEP-1的克隆如圖1所示，圖中上列表示編碼EPSPS蛋白的核苷酸序列，共1505個堿基，其中最后兩個密碼子是終止密碼子；下列表示所編碼的氨基酸，共500個，以單字符表示。
如圖2所示，將全長的EPSPS基因分成兩部分，每一部分由26個寡核苷酸片段組成。這些寡核苷酸片段兩兩相互部分配對。
實施例例1 EPSPS基因的設(shè)計本實施例說明抗草甘膦基因的設(shè)計和基因本身的特征。所設(shè)計的基因全長1506bP，共編碼500個氨基酸，3’端有2個終止密碼子即TAA TGA。該基因是一雜合基因，1～71位氨基酸編碼植物矮牽牛來源的信號肽，其作用是將其后面的成熟蛋白定向?qū)氲街参锏娜~綠體中；72～99位氨基酸編碼矮牽牛EPSPS蛋白N-端的一部分；100～227位氨基酸編碼沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)EPSPS蛋白的一部分；228～500位氨基酸編碼大腸桿菌(E.coli)EPSPS蛋白的一部分。為了使該基因能夠在植物中高效表達，對基因序列中的密碼子進行了優(yōu)化，使第三位堿基G+C的含量達到68.5％?；蛐蛄屑八幋a的氨基酸見圖1。
例2 EPSPS基因的化學(xué)合成本實施例的目的是說明抗草甘膦基因CHEP-1的合成方法和過程。采用雙鏈合成法。以第744位的堿基A為界，將整個基因分為AB兩部分，A部分的5′端設(shè)計成NcoI的粘端，3′端設(shè)計成PstI的粘端；B部分的5′突出端為PstI，3′端為SalI的粘端。A部分的兩條鏈共分為26個寡核苷酸片段，分別命名為A1……A26每個片段長度為60bP；B部分也作同樣處理，各片段分別命名為B1……B26，用DNA自動合成儀合成完務(wù)寡核苷酸片段后，各取0.2μg在20μl反應(yīng)體系中用T4 DNA激酶對其5′端進行磷酸標記，37℃標記反應(yīng)30分鐘后，將A1到A26按摩爾數(shù)比1∶1混合于另外一管，然后分別用酚/氯仿，氯仿將兩種混合物抽提一次，加入1/10體積3mol/lNaAc(pH5.2)和2.5倍體積無水乙醇，-20℃放置30分鐘，離心后將DNA溶于1/100的T4 DNA連接酶緩沖液中，共30μl。將兩混合物在90℃水溶中保持5分鐘，然后自然冷卻至室溫。這樣，A1～A26混合物退火形成CHEP-1A，B1～B26混合物退火形成CHEP-1B(圖2)。
例3 EPSPS基因的克隆將質(zhì)粒pUCNH用限制性內(nèi)切酶NcoI和PstI酶切，然后回收，將回收的DNA溶于水中，定量后，與片段CHEP-1A按摩爾數(shù)比1∶3混合，加入T4DNA連接酶，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并鑒定挑選陽性重組子。將該陽性重組子用PstI和SalI酶切后，將片段CHEP-1B插入到這兩個位點之間，就得到了含有完整基因CHEP-1的重組質(zhì)粒，pCHEP-1(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種全新的合成5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的方法，其特征在于該基因經(jīng)過在核苷酸和蛋白質(zhì)水平上的修飾、重組。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因，該基因的編碼區(qū)是由分別來源于植物和微生物的DNA序列所組成的編碼EPSPS蛋白的雜合體序列；編碼該酶的基因序列按照植物選擇偏向進行了密碼子優(yōu)化。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因采用化學(xué)方法進行人工合成。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所獲得的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶具有抗除草劑草甘膦的特征。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所獲得的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶可以在植物中合成。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所說的植物包括雙子葉植物如棉花、大豆、油菜，以及單子葉植物如玉米、水稻、小麥。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述植物被轉(zhuǎn)化的方法可以是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法和基因槍法等。
全文摘要
一種5－烯醇丙酮酰—莽草酸－3－磷酸合成酶(EPSPS)基因的合成方法,包括基因的設(shè)計合成、基因序列和基因克隆。所合成的基因可應(yīng)用于創(chuàng)制抗草甘膦的雙子葉植物如油菜、大豆、棉花等,以及抗草甘膦的單子葉植物如水稻、玉米、小麥等。
文檔編號C12N15/10GK1268572SQ9910347
公開日2000年10月4日 申請日期1999年3月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月31日
發(fā)明者趙軍, 范云六, 張春義 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心