專利名稱：重組木聚糖酶、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的重組木聚糖酶及其應(yīng)用，以及一種制備木聚糖酶的方法。
木聚糖，是植物細(xì)胞壁中的半纖維素的主要成份，由木糖(D-Xylose)分子以1→4β連結(jié)成主鏈，另外在支鏈上由阿拉伯呋喃糖、甲基葡萄糖或乙?；?→3或1→2來連結(jié)。在造紙工業(yè)中常使大量的木聚糖流失，并因無法加以有效利用而將其當(dāng)成廢物傾倒入小溪或河流中，造成資源浪費(fèi)并影響生態(tài)環(huán)境。另外于農(nóng)牧業(yè)中，牲畜所食用的大量飼料中亦含有許多木聚糖。不過，因動(dòng)物體內(nèi)沒有可分解木聚糖的酶而無法被動(dòng)物吸收代謝。所以如果能將木聚糖分解成五碳糖，不僅可以將造紙過程中的殘?jiān)髁己玫睦?，減少污染外；也可應(yīng)用在飼料內(nèi)，促進(jìn)牲畜對(duì)飼料的利用率，具有節(jié)省飼料量的經(jīng)濟(jì)效果。
為了上述目的，研發(fā)微生物中特有的木聚糖酶以應(yīng)用便成了目前公認(rèn)最有效率的可行方法。例如USP 5,116,746、USP 5,179,021、USP5,407,827、USP 5,437,992、USP 5,498,534、USP 5,591,304即揭示于紙漿中加入木聚糖酶可幫助褪色漂白并分解殘留的木聚糖；另外，USP5,429,828、USP 5,445,957、USP 5,612,055、USP 5,622,738等專利也曾揭示可將木聚糖酶添加在含大量半纖維素的飼料中幫助動(dòng)物分解木聚糖，促進(jìn)動(dòng)物的吸收與生長(zhǎng)。
木聚糖酶[內(nèi)-1，4-b-木聚糖酶(endo-1，4-xylanase EC3.2.1.8)]可將木聚糖分解變成較短鏈的木寡糖，甚至可完全水解成單分子木糖。木聚糖酶普遍存在于許多微生物中，使它們可利用此酶與其他可分解多糖類的酶一起分解植物細(xì)胞壁中的木聚糖以獲得所需代謝能量。另外，在一些以植物為食物的昆蟲及甲殼類動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)含有木聚糖酶。由此可知此酶除了不存在于哺乳類動(dòng)物外，分布非常廣泛[A.Sunna和G.Antranikian，1997，Crit.Rev.Biotech.17(1)39-67；Peter Biely，1985，Trends in Biotech.3(11)286-290]。
已知可發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶的微生物包括黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)、頭孢屬(Cephalosporium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)；如USP 5,591,619、USP5,534,429、5,491,087對(duì)此都有詳述。不過活性未令人滿意，產(chǎn)量低，費(fèi)用高，純化步驟繁復(fù)為這些現(xiàn)有技術(shù)的共同缺點(diǎn)，所以目前產(chǎn)業(yè)界所使用的木聚糖酶，不論在來源還是制備方法方面皆仍有極大的改良空間。
本發(fā)明的目的是提供一種新穎的具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)及其編碼核酸序列。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種制備具有木聚糖酶活性之蛋白質(zhì)的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法制得的蛋白質(zhì)不但產(chǎn)量極高，而且亦具有極佳活性，并易純化。
本發(fā)明因而提供本發(fā)明方法中用于插入可以表達(dá)具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)的基因所必須的聚合酶鏈反應(yīng)引物。
本發(fā)明亦提供本發(fā)明方法中所構(gòu)建的新穎重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是提供一種分解木聚糖的管柱，其包含本發(fā)明之具有木聚糖酶活性的新型蛋白質(zhì)。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1根據(jù)Millward-Sadler，S.J.等人所發(fā)表的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)之木聚糖酶的基因結(jié)構(gòu)、功能區(qū)域及本發(fā)明重組該段基因編碼序列的過程。
圖2pET20b/xyldl表達(dá)質(zhì)粒的示意圖。
圖3重組木聚糖酶基因xyldl的DNA序列(841bp)，其中粗體TCA表示催化性區(qū)域與纖維素結(jié)合區(qū)域的交接處。
圖4重組木聚糖酶基因xyldl的氨基酸序列。
圖5A和5B本發(fā)明轉(zhuǎn)化菌株所表達(dá)的野生型(A)和重組(B)木聚糖酶于12％聚乙烯酰胺凝膠上的電泳分析圖，圖5AM分子量標(biāo)記，其余各行含pET20b/xylns表達(dá)質(zhì)粒的BL21總菌蛋白，箭頭指出野生型木聚糖酶的分子量；圖5BM分子量標(biāo)記，CBL21對(duì)照組(沒有表達(dá)產(chǎn)物)，第1至6行含pET20b/xyldl表達(dá)質(zhì)粒的BL21總菌蛋白，箭頭指出本發(fā)明重組木聚糖酶的分子量。
圖6Xyld、Xylns與出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)木聚糖酶活性的比較圖，-●-Xylds(123單位/微克)，-△-Xylns(5.7單位/微克)，-口-市售出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)木聚糖酶(Sigma)。
圖7Xyld對(duì)pH值的穩(wěn)定性分析圖。
圖8Xyld對(duì)溫度的穩(wěn)定性分析圖。
圖9面包酵母表達(dá)的木聚糖酶于12％聚乙烯酰胺凝膠上的電泳分析圖，M行分子量標(biāo)記，C行酵母菌培養(yǎng)基陰性對(duì)照組，第1行表達(dá)培養(yǎng)基5倍濃縮，第2行和第3行表達(dá)培養(yǎng)基10倍濃縮。
圖10由酵母菌表達(dá)p416/xylds與大腸桿菌表達(dá)pET20b/xyldl的木聚糖酶的活性比較圖，-●-酵母菌/Xylds(363.26單位/微克)，-○-大腸桿菌/Xyld(123單位/微克)，-口-對(duì)照組(非轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì))。
圖11p416/xylds表達(dá)質(zhì)粒的示意圖。
源自微生物的木聚糖酶基因可藉由常規(guī)方法予以擴(kuò)增，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。此反應(yīng)是從1980年代以來常用的一種擴(kuò)增特定基因的技術(shù)(如USP 4,683,195、4,683,202等)，其實(shí)施步驟是先設(shè)計(jì)含目標(biāo)基因兩端序列的引物并合成后，在商購(gòu)的自動(dòng)化裝置(溫度循環(huán)機(jī))內(nèi)，重復(fù)進(jìn)行開雙鏈，與引物粘合，聚合酶合成新雙鏈DNA以在活體外得所要的目標(biāo)基因。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，天然木聚糖酶基因是根據(jù)Millward-Sadler及Davidson揭示的假單胞菌木聚糖酶基因5’端及3’端序列[Biochem.J.312，39-48(1995)]所合成的適當(dāng)5’端及3’端引物，從熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)中借助PCR擴(kuò)增而得到。該產(chǎn)物被命名為xylns，隨后將此DNA片段插入質(zhì)粒中。
在上述具體實(shí)施方案中所使用的引物TLF+及JLF-，除了根據(jù)熒光假單胞菌(P.Fluorescens)木聚糖酶的特異性序列以外，同時(shí)也參照其他生物木聚糖酶基因的共有序列設(shè)計(jì)，其序列分別如下所示JLF+∶5’-ATTACCGTTAGCGAATCAAGCTCCGGTGGCAGCAGCJLF-5’-GCCACCGGAGCTTGATTCGCTAACGGTAATGTCGGA故該引物亦適于插入其他生物來源的木聚糖酶。
在本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施方案中，以含有xylns序列的重組質(zhì)粒作為PCR的模版，使用重疊延伸PCR方案(Ho等人，Gene 77，51-59，1989)得到含有編碼重組木聚糖酶之DNA序列(xyldl，見圖1)的重組質(zhì)粒(見圖2)，該重組木聚糖酶序列只保留催化性區(qū)域和纖維素結(jié)合性區(qū)域(見圖3)。
在本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用PCR將天然木聚糖酶基因中信號(hào)肽序列額外連接至xyldl而成xylds，隨后將xylds插入載體中。
擴(kuò)增所得的基因是以常規(guī)方式插入適當(dāng)?shù)妮d體中，包括可用于細(xì)菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體，例如pET、p4X6(GPD)、pPI9、pBR、pUC或pUB系列的質(zhì)粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依慣用或需要選用。
構(gòu)建完成的載體隨后以之轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞并令其表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌(如大腸桿菌)、酵母菌(如釀酒酵母(Saccharomyces cereversiae))、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如小鼠纖維母細(xì)胞)、或是昆蟲細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)等，其中優(yōu)選為細(xì)菌和酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。不過大腸桿菌卻常表達(dá)在包涵體內(nèi)，自細(xì)菌中回收表達(dá)的蛋白必須先以尿素將此包涵體變性及溶解，再以透析膜恢復(fù)活性后才能獲得具有活性的可溶性木聚糖酶。
在本發(fā)明進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，分別將含有xylns及xyldl序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中表達(dá)，并分別收集兩種轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析(見圖5A和5B)。依照野生型或重組木聚糖酶，表達(dá)量占總蛋白質(zhì)份量的比例，顯示經(jīng)過刪除突變的重組Xyld蛋白質(zhì)產(chǎn)率遠(yuǎn)大于野生型Xylns。經(jīng)重組后的木聚糖酶自包涵體溶出并恢復(fù)活性后，所得產(chǎn)率較野生株大5倍(重組蛋白約占細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)總量的60％)。
而在酵母菌表達(dá)方面，因在重組過程中木聚糖酶之編碼信號(hào)肽的基因片段也插入表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)而使酵母菌生產(chǎn)的木聚糖酶能夠被分泌之培養(yǎng)液中而簡(jiǎn)化了純化步驟。在30℃的溫度下培養(yǎng)36-38小時(shí)，木聚糖酶的產(chǎn)量約可達(dá)1微克/毫升。
在本發(fā)明進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，將經(jīng)由xyldl、xylns及xylds序列表達(dá)的蛋白質(zhì)酶Xyld、Xylns及Xylds與市售的出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)木聚糖酶液(Sigma)進(jìn)行比活性比較。令人驚異地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明經(jīng)過刪除突變的木聚糖酶重組基因，其所表達(dá)的蛋白酶的比活性均明顯優(yōu)于野生型基因產(chǎn)物及市售產(chǎn)物(見圖6及10)。
由本發(fā)明方法制得的木聚糖酶在與出芽短柄霉酶(買自Sigma)及原酶(未經(jīng)改造者)比較活性后發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明酶高出出芽短柄霉10～20倍，高出原酶達(dá)25倍，且產(chǎn)率較大，因而成本亦較已商業(yè)化者便宜。應(yīng)用在造紙工業(yè)、食品工業(yè)或飼料添加劑甚有產(chǎn)業(yè)價(jià)值。
在本發(fā)明進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，分別對(duì)本發(fā)明重組木聚糖酶進(jìn)行不同溫度及酸堿值條件下的活性測(cè)定(見圖7及8)。
根據(jù)上述具體實(shí)施方案，本發(fā)明亦提供一種利用基因工程技術(shù)制造具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)的方法，其包含(a)將木聚糖酶基因利用遺傳工程進(jìn)行刪除性突變，得到重組基因；(b)將重組木聚糖酶基因插入適當(dāng)載體上以構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；(c)將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(d)于適合該轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)木聚糖酶基因的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；及(e)純化所表達(dá)的木聚糖酶蛋白質(zhì)。
本發(fā)明制造具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)的方法除可生產(chǎn)前述的重組木聚糖酶外，亦適用于生產(chǎn)其他微生物來源的木聚糖酶。具體而言，本發(fā)明方法是以木聚糖酶基因的共有DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出適當(dāng)?shù)囊?，以PCR擴(kuò)增所要的重組基因、以其構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并令其表達(dá)而制得具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。
由于本發(fā)明重組酶亦具有連結(jié)纖維素的功能，除了可以用充填纖維素基質(zhì)的管住進(jìn)行大量純化外，還可利用纖維素將此酶固定，充填于管柱之中，可提供快速體外分解木聚糖的用途。
在本發(fā)明說明書中所有前人文獻(xiàn)及公開專利均以參考資料形式并入本發(fā)明。
為使本發(fā)明的內(nèi)容更為明確，茲以示范說明性實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1 pET20b/xylns表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建熒光假單胞菌染色體的抽取首先將10克的Bacto-trypton、5克的細(xì)菌—酵母抽提物及10克的NaCl溶于1公升的去離子水中，以1N NaOH溶液調(diào)整pH值至7.5，高壓滅菌后冷卻制得Luria-Betani(LB)培養(yǎng)液，再加入葡萄糖至0.25％即完成假單胞菌培養(yǎng)液的制備。
取5毫升的LB+葡萄糖培養(yǎng)液于37℃振蕩培養(yǎng)熒光假單胞菌株(Pseudomonas fluorescens，N.C.I.N.B.10462)，24小時(shí)后離心(5千轉(zhuǎn)/分)15分鐘，以水清洗沉淀菌體一次，再次離心后倒掉上清液，加入0.75毫升水并加入0.75毫升酚抽提30分鐘，再離心(12千轉(zhuǎn)/分)15分鐘，取出上清液后再加入0.75毫升酚抽提30分鐘，離心(12千轉(zhuǎn)/分)15分鐘后取出上清液，再以0.75毫升氯仿抽提15分鐘，離心(12千轉(zhuǎn)/分)，取出上清液后加入2倍體積乙醇，離心(12千轉(zhuǎn)/分)15分鐘。倒掉上清液，將沉淀DNA以75％酒精洗一次，再用10mMTris-Cl(pH7.5)溶解得到的染色體DNA。假單胞菌木聚糖酶基因(xylns)的擴(kuò)增5’端及3’端引物的合成根據(jù)Millward-Sadler及Davidson等人，Biochem.J.312，39-48(1995)所揭示的木聚糖酶基因序列的5’及3’端DNA序列，其中5’端不含信號(hào)肽DNA，合成兩端引物，并分別帶有NdeI及XhoI酶切除特定序列，其DNA序列如下
5’-GGAATTCCATATGAATGCCCAAACCCTGAGT此序列含NdeI酶切除序列。
5’-CCCCGGCTCGAGTCAATTACAAACGACACC此序列含XhoI酶切除序列。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)取約1微克假單胞菌染色體DNA，加入8微升2.5 mM dNTPs、10微升10倍Taq緩沖液、1微克5’端引物、1微克3’端引物及1微升的5 U/微升Takara Taq，再加入水至總體積為100微升，最后加50微升礦物油于上層。設(shè)定溫度循環(huán)機(jī)(Thermal cycler，美商Perkin Elmer公司)的反應(yīng)參數(shù)如下于94℃加熱3分鐘；以94℃×1分鐘，50℃×1分鐘，72℃×1分鐘為一個(gè)循環(huán)，共反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后再于72℃放置10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，以0.8％低熔點(diǎn)瓊脂凝膠進(jìn)行電泳分析和溴化乙啶染色觀察，確定DNA片段如預(yù)期大量擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度約為1.9kb。將其切下來后以糖原于65～70℃加熱15分鐘使DNA溶離出來，趁熱用酚抽提，離心10分鐘，取上層液再分別以酚/氯仿及氯仿如上述方式各抽提一次，最后加入1/10體積的3N醋酸鈉及2倍體積酒精，于-70℃冰凍，2小時(shí)后離心(12千轉(zhuǎn)/分)，將沉淀物用70％酒精清洗一次后再離心(12于轉(zhuǎn)/分)，移除上清液后使DNA沉淀物干燥，將DNA溶在水中即得純化之標(biāo)的DNA。pET20b/xylns表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以Ndel及XhoI限切酶于37℃分別切割PCR產(chǎn)物和pET20b載體(美商N(yùn)ovogen公司)20小時(shí)，再利用上述低熔點(diǎn)凝膠及加熱溶離方式得到產(chǎn)物DNA和載體，并利用T4DNA粘合酶于16℃反應(yīng)24小時(shí)，使二者粘合，接著將反應(yīng)后的混合物轉(zhuǎn)化DH5α菌株，將所得的轉(zhuǎn)化菌落個(gè)別培養(yǎng)并少量抽取質(zhì)粒DNA，經(jīng)限切酶分析初步篩選含有約與xylns等大小的插入物的質(zhì)粒，再利用Sanger’s方法以Sequence Version2.0DNA定序套組(購(gòu)自美商United States Biochemical公司)，以T7啟動(dòng)子序列(ATTAATACGACTCACTATAGG)為引物，定序初步切選得到的DNA序列，確定得到的1.9kbDNA片段為xylns基因，而完成pET 20b/xylns表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。實(shí)施例2 pET20b/xyldl表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建依照xylns的DNA序列于內(nèi)部設(shè)計(jì)兩段引物(JLF+，JLF-)JLF+5’-ATTACCGTTAGCGAATCAAGCTCCGGTGGCAGCAGCJLF-5’-GCCACCGGAGCTTGATTCGCTAACGGTAATGTCGGA接著以pET20b/xylns作模板，分別以兩組引物(5’-NdeI順向引物，JLF-反向引物；JLF+順向引物，3’-XhoI反向引物)運(yùn)用前述的聚合酶鏈反應(yīng)得到xylns中的催化性區(qū)域基因片段(ES)及纖維素結(jié)合區(qū)域基因(CBD)片段。最后再以此二段DNA作模板，5’-NdeI及3’-XhoI當(dāng)順、反引物，大量擴(kuò)增DNA(圖1)。將擴(kuò)增的DNA進(jìn)行電泳分析并將長(zhǎng)約0.83kb的DNA片段純化出來(步驟同前述)，即為xyldl(圖3)。以NdeI和XhoI于37℃反應(yīng)20小時(shí)后，將大小約0.83kb的DNA純化后與已用NdeI和XhoI切割過的pET20b載體以T4粘合酶于16℃反應(yīng)20小時(shí)后，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸菌并用前述方法篩選及定序確認(rèn)，即完成pET20b/xyldl表達(dá)質(zhì)粒(見圖2)的構(gòu)建，該質(zhì)粒已于1997年12月18保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所，保藏編號(hào)為CCRC940190。實(shí)施例3 p416/xylds表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建首先以含有木聚糖酶的信號(hào)肽核苷序列的引物與JLF-引物，從假單胞菌染色體DNA大量復(fù)制含信號(hào)肽的催化性區(qū)域基因片段后，再以重新設(shè)計(jì)的BamHI+與EcoRI-兩端引物以上述催化性區(qū)域DNA及前述的纖維素結(jié)合區(qū)域DNA作模板，用Taq聚合酶鏈反應(yīng)大量復(fù)制出約0.9kb的DNA片段，并命名為xylds。此兩段引物列示如下BamHI+5’-CGGGATCCATGAATGCCCAAACCCTGAGTEcoRI-5’-CGGAATTCTCAATTACAAACGACACC接著用前述方法純化PCR產(chǎn)物、限切酶切除、T4粘合酶粘合至P416載體上成表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化至DH5α、篩選含表達(dá)質(zhì)粒的克隆、定序確認(rèn)，由此完成p416/xylds表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(圖11)。該質(zhì)粒已于1998年1月13日保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所，保藏編號(hào)為CCRC940192。實(shí)施例4木聚糖酶的表達(dá)將pET20b/xylns、pET20b/xyldl等表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，然后以10毫升LB/Amp培養(yǎng)液于37℃下震蕩培養(yǎng)至OD600＝2.0時(shí)，加入1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)，并在30℃下震蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)木聚糖酶表達(dá)，3小時(shí)后收集菌體。取1.5毫升菌液，離心并倒掉上清液，加入100微升100mM Tris-Cl，pH7.5緩沖液于菌體中，再加入200微升的1.5倍電泳蛋白染料(其配方為0.1M二硫蘇糖醇、2％SDS、0.08mM Tris-Cl，pH6.8、15％甘油及0.06％溴酚藍(lán))，混合后于95℃下加熱5分鐘再以12千轉(zhuǎn)/分離心，取上層液10微升以12％聚乙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析菌體全部蛋白質(zhì)。分析結(jié)果如圖5A和5B所示。由圖5B結(jié)果可知，當(dāng)縮短基因長(zhǎng)度后，重組木聚糖酶(Xyld)在BL21(DE3)內(nèi)的表達(dá)量將大為增加，占總蛋白質(zhì)的一半左右，而野生木聚糖酶表達(dá)量在總蛋白質(zhì)中所占比例約為10％，兩者相差5倍，這表示重組木聚糖酶基因的表達(dá)明顯優(yōu)于野生木聚糖酶基因的表達(dá)。
由于被表達(dá)的木聚糖酶大量存在于大腸桿菌中的包涵體，所以先以8M尿素(Urea)溶于100mM Tris-Cl、10mM NaH2PO4緩沖液將包涵體溶解，接著利用透析方式逐步降低尿素濃度由8M→6M→4M→2M→0M(100mM Tris，10mM NaH2PO4)使酶復(fù)活化且成可溶性后再測(cè)酶活性。
在釀酒酵母菌(Saccharomyces cereversiae)方面，將p416/xylds以電穿透法(2500V，25μFD，400ohms)轉(zhuǎn)化至BT3501菌株，30℃培養(yǎng)3天后，于SD培養(yǎng)液(0.67％YNB w/o氨基酸，2％葡萄糖，0.5％酪氨酸)10毫升中，30℃震蕩培養(yǎng)至OD600＝1.2后，取1毫升培養(yǎng)至50毫升SD培養(yǎng)液中，30℃震蕩培養(yǎng)至OD600＝2后，5千轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。取上清液用膜過濾方式將體積濃縮10倍，取10微升液體真空抽干后加入10微升蛋白染料，95℃加熱5分鐘，跑12％聚乙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(見圖9)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量為1微克/毫升菌液。實(shí)施例5木聚糖酶的活性測(cè)定及比較各取2毫升溶于0.05M醋酸鈉緩沖液(pH5.4)的RBB-xylan(Sigma，5mg/ml)先置于試管內(nèi)，再于每個(gè)試管中分別加入10微升Xyld溶液、10微升市售的出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)木聚糖酶液(Sigma公司)、100微升Xylns溶液及40微升濃縮10倍的含Xylds的酵母菌培養(yǎng)液，于37℃反應(yīng)1、2、5、10、30、60分鐘時(shí)分別取200微升反應(yīng)液加入2倍體積的96％EtOH進(jìn)行終止反應(yīng)，于室溫下靜置10分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。吸取上清液在吸收光波長(zhǎng)595微毫米下測(cè)定吸收值，畫出對(duì)時(shí)間的關(guān)系曲線(見圖6和10)。
依上述方法測(cè)得的每單位活性(U)定義為每微克酶每分鐘作用產(chǎn)生1微升的RBB-木寡糖或木糖。此等木聚糖酶的比活性如下
由上表可知，本發(fā)明所制備的重組木聚糖酶的活性甚佳，除較野生型酶優(yōu)異外，且較市售的木聚糖酶高6～20倍左右。實(shí)施例6木聚糖酶的熱穩(wěn)定性檢驗(yàn)各取20微升Xyld酶液分別先置于16、30、37、52、70、95℃1小時(shí)后再根據(jù)實(shí)施例5的方法做酶活性測(cè)定。以4℃中取出的酶液的酶活性當(dāng)基準(zhǔn)，比較其他條件下酶的活性百分比(見圖8)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30至37℃，活性最佳，對(duì)熱穩(wěn)定性而言則應(yīng)低于52℃。實(shí)施例7蛋白質(zhì)濃度測(cè)定利用染料結(jié)合方式以不同，將已知濃度(5～40微克/毫升)的牛血清白蛋白(BSA)各取800微升加入蛋白試驗(yàn)用染料(Bio-Rad)200微升，在波長(zhǎng)595微毫米測(cè)吸收值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將未知的蛋白質(zhì)濃度稀釋后加入蛋白試驗(yàn)用染料測(cè)其吸收值，并使其在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，即可反推求出未知蛋白質(zhì)濃度及真正量。實(shí)施例8木聚糖酶對(duì)酸堿質(zhì)的穩(wěn)定性分別將RBB-Xylan反應(yīng)緩沖液的pH值調(diào)成8、7、6、5、4、3、2、1后，加入10微升Xyld酶液，37℃反應(yīng)30分鐘，測(cè)Xyld在不同pH值下的酶活性(見圖7)，結(jié)果在pH值5至8時(shí)活性最佳，在pH＝3時(shí)仍保有約50％活性。
權(quán)利要求
1.一種編碼具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，其選自以下組(a)具如下序列或其片段的核苷酸分子；和
(b)編碼具有如下所示氨基酸序列或其活性片段的核酸分子。10203040MNAQTLSSNSTGTNNGFYYTFWKDSGDASMTLLSGGRYQS50607080SWGNSTNNWVGGKGWNPGNNSRVISYSGSYGVDSSQNSYL90 100 110 120ALYGWTRSPLIEYYVIESYGSYNPASCSGGTDYGSFQSDG130 140 150 160ATYNVRRCQRVNQPSIDGTQTFYQYFSVRNPKKGFGNISG170 180 190 200TITFANHVNFWASKGLNLGNHNYQVLATEGYQSRGSSDIT210 220 230 240VSESSSGGSSSVALSSSSRSSSSAGGNTGGNCQCNWWGTF250 260 270 280YPLCQTQTSGWGWENSRSCISTSTCNSQGTGGGGVVCN..
2.一種具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)，其具有如下所示氨基酸序列或其活性片段10203040MNAQTLSSNSTGTNNGFYYTFWKDSGDASMTLLSGGRYQS50607080SWGNSTNNWVGGKGWNPGNNSRVISYSGSYGVDSSQNSYL90 100 110 120ALYGWTRSPLIEYYVIESYGSYNPASCSGGTDYGSFQSDG130 140 150 160ATYNVRRCQRVNQPSIDGTQTFYQYFSVRNPKKGFGNISG170 180 190 200TITFANHVNFWASKGLNLGNHNYQVLATEGYQSRGSSDIT210 220 230 240VSESSSGGSSSVALSSSSRSSSSAGGNTGGNCQCNWWGTF250 260 270 280YPLCQTQTSGWGWENSRSCISTSTCNSQGTGGGGVVCN..
3.一種引物，其具有如下序列或其反義序列5’-ATTACCGTTAGCGAATCAAGCTCCGGTGGCAGCAGC，或5’-GCCACCGGAGCTTGATTCGCTAACGGTAATGTCGGA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的引物，其可用以插入xylns序列。
5.一種質(zhì)粒，其包括根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子及與該核酸分子作動(dòng)性連接的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的質(zhì)粒，其中，所述載體能夠在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的質(zhì)粒，其為pET20b/xyldl。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的質(zhì)粒，其中，所述載體能夠在直核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的質(zhì)粒，其中，所述真核宿主細(xì)胞為酵母菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的質(zhì)粒，其中，所述真核宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的質(zhì)粒，其中，所述真核宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞。
12.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其是經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求6或8的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
13.一種制造根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)的方法，其步驟包含(a)將木聚糖酶基因利用遺傳工程進(jìn)行刪除性突變，得到重組基因；(b)以(a)得到的重組基因構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；(c)將(b)中表達(dá)質(zhì)粒送入合適的宿主細(xì)胞中；(d)于適合表達(dá)該重組基因的條件下培養(yǎng)(c)得到的宿主細(xì)胞；及(e)純化被表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中，(a)中重組基因?yàn)楦鶕?jù)權(quán)利要求1的核酸分子所編碼。
15.一種用于快速分解木聚糖的纖維素管柱，其含有固定于纖維素的根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種產(chǎn)量高且活性佳的重組木聚糖酶,以及生產(chǎn)該重組木聚糖酶的方法。本發(fā)明亦提供該重組木聚糖酶的編碼序列,含該序列的載體及含有此載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)而提供一種含有固定化重組木聚糖酶的管柱。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1266903SQ9910331
公開日2000年9月20日 申請(qǐng)日期1999年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月15日
發(fā)明者莊明恒, 鄭金松, 吳孝蕓, 林龍參, 張立言 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人生物技術(shù)開發(fā)中心