專利名稱：：一種木聚糖酶編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種木聚糖酶編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：木聚糖是由e-l，4-木糖苷鍵連接而成的線狀木糖多聚體，側(cè)鏈上連著多種不同的取代基。在自然界中，木聚糖是第二豐富的半纖維素類多糖，在被子植物中木聚糖占植株干物質(zhì)重的15%~30%，在裸子植物中占植株干物質(zhì)重的7%~12%。木聚糖在動物的消化道內(nèi)不能被消化和吸收，而且會影響其他養(yǎng)分的吸收利用，具有很強的抗?fàn)I養(yǎng)作用，因而大大地限制了富含木聚糖的飼料(如大麥、小麥和黑麥等)的應(yīng)用。工業(yè)上降解木聚糖的方法主要有兩種，即酸解和酶解。酸解作用較快，但常伴隨著有毒物質(zhì)的生成，而且容易引起容器的腐蝕。降解木聚糖的酶類主要是內(nèi)切e-1，4-木聚糖酶(EC3.2丄8)，該酶能將木聚糖分解成低聚糖、木糖和少量的阿拉伯糖。自然界中，除細(xì)菌、真菌等微生物能產(chǎn)生木聚糖酶外，藻類、原生動物、甲殼類動物、昆蟲、蝸牛和植物的種子等都可產(chǎn)生木聚糖酶。目前，用于生產(chǎn)實踐中的木聚糖酶主要來自于真菌，因為真菌產(chǎn)生的木聚糖酶能夠分泌到培養(yǎng)基中，易于純化，而且其活性較高。在產(chǎn)木聚糖酶的真菌中，研究較多的是曲霉0^/^"http:///^*.)，到目前為止，己有十幾種曲霉產(chǎn)木聚糖酶的性質(zhì)獲得了深入的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種木聚糖酶編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的木聚糖酶編碼基因可為如下l)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼木聚糖酶的DNA分子；3)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼木聚糖酶的DNA分子。序列表中的序列l(wèi)由624個堿基組成，其開放閱讀框架(0RF)為自5'末端第1-624位堿基，編碼木聚糖酶。所述木聚糖酶的氨基酸序列如GenBankAccessionNo.DQ168666所示。上述嚴(yán)格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C條件下雜交并洗膜。擴增上述木聚糖酶編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述木聚糖酶編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體具體可為在畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPzaA的多克隆位點間插入上述木聚糖酶編碼基因得到的重組載體，如pGAP-xynB。所述重組菌具體可為在畢赤酵母x-33中導(dǎo)入含有上述木聚糖酶編碼基因的重組載體得到的重組菌。本發(fā)明的第三個目的是提供一種制備木聚糖酶的方法。本發(fā)明所提供的制備木聚糖酶的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)上述含有木聚糖酶編碼基因的重組菌，得到木聚糖酶。上述重組菌可用于制備豬、雞等單胃動物的飼料添加劑，以提高飼料的利用率。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，利用硫色曲霉木聚糖酶xynB的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.DQ168666)和畢赤酵母的密碼子偏好性，合成了一個木聚糖酶編碼基因，并將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，從而能高效生產(chǎn)木聚糖酶。搖瓶發(fā)酵研究表明，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的木聚糖酶的產(chǎn)量達(dá)到20000U/mL，該木聚糖酶的最適催化溫度為5(TC，最適催化pH為4.4，適合作為豬、雞等單胃動物的飼料添加劑使用。圖1為木聚糖酶基因的重疊PCR擴增結(jié)果圖2為重組菌株表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果圖3為木聚糖酶的最適pH值圖4為木聚糖酶的最適溫度具體實施例方式實施例l、木聚糖酶編碼基因的重疊PCR法從頭合成根據(jù)已報道的硫色曲霉木聚糖酶xynB的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.DQ168666)和畢赤酵母的密碼子偏好性，設(shè)計8對引物(見表1)，利用重疊PCR方法，擴增木聚糖酶編碼基因序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>具體PCR擴增方法為以B-F-1和B-R-1為引物，進(jìn)行PCR擴增，得到二聚體;再以此二聚體為模板，以B-F-2和B-R-2為引物，進(jìn)行PCR擴增；然后以上一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，以B-F-3和B-R-3為引物，進(jìn)行PCR擴增；如此依次以上一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增條件為先94°C30S、然后68°C30S、最后72°Clmin，共35個循環(huán)。將上述PCR擴增產(chǎn)物分別進(jìn)行化瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖l所示。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1-8依次分別為以B-F-l和B-R-l、B-F國2和B-R-2、B隱F-3和B陽R-3、B-F隱4和B-R-4、B-F隱5和B-R-5、B-F隱6和B-R-6、B-F-7和B-R-7、B-F-8和B-R-8為引物的PCR擴增結(jié)果。純化并回收約600bp的PCR擴增產(chǎn)物(即以B-F-8和B-R-8為引物的PCR擴增產(chǎn)物)進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，擴增得到624bp的木聚糖酶編碼基因，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。實施例2、利用含有木聚糖酶編碼基因的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶一、含有木聚糖酶編碼基因的重組菌的構(gòu)建將上述實施例1擴增得到的木聚糖酶編碼基因(即以B-F-8和B-R-8為引物擴增得到的PCR產(chǎn)物)經(jīng)過純化后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)過同樣酶切的畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPzaA(購自Invitrogen公司，USA)相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T叩IO感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素Zeocin篩選后，獲得陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒，將得到的重組表達(dá)載體命名為pGAP-xynB。將10嗎重組表達(dá)載體pGAP-xynB用限制性內(nèi)切酶BspHI(購自NewEnglandBiolabs公司，USA)線性化后，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母x-33(購自Invitrogen公司，USA)的感受態(tài)細(xì)胞中(電轉(zhuǎn)化條件2000V，25pF)，經(jīng)抗生素Zeocin篩選后，獲得陽性重組菌，將得到的陽性重組菌命名為x-33'。二、利用重組菌x-33'搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶挑取上述步驟一獲得的重組菌x-33'的單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，28。C振蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)物按照l:1000的體積比轉(zhuǎn)接到100mL新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，28t:振蕩培養(yǎng)48h，得到發(fā)酵液。同時以未轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的畢赤酵母x-33的發(fā)酵液作為對照。將發(fā)酵液離心，取上清液進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。其中，泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為未轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的畢赤酵母x-33培養(yǎng)上清的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果，泳道2和3為重組菌x-33'搖瓶培養(yǎng)48小時后上清液的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果。結(jié)果表明，重組菌x-33'的培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE檢測得到一條約20kDa的特異性表達(dá)條帶，即木聚糖酶。對上述得到的木聚糖酶進(jìn)行酶活檢測。酶活測定采用DNS法，將l個酶活單位(U)定義為50°C、pH4.4的條件下，每分鐘從質(zhì)量百分含量為0.8%的木聚糖溶液中降解釋放l叱還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位。實驗設(shè)三次重復(fù)，每個樣品測定均設(shè)三個平行實驗，相對誤差控制在5%以內(nèi)。結(jié)果表明，搖瓶培養(yǎng)48小時后，發(fā)酵液中的木聚糖酶的平均酶活為20000U/mL。三、木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析1、酶反應(yīng)最適溫度的測定在20-65'C范圍內(nèi)，pH4.4的條件下測定上述步驟二獲得的木聚糖酶的酶活，并計算木聚糖酶的相對活力。以20-65t;溫度范圍內(nèi)測得的最高酶活力為基礎(chǔ)，其它溫度下測得的酶活力與之相比，所得數(shù)值即為該溫度下的相對酶活力。實驗設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，pH4.4的條件下，上述步驟二獲得的木聚糖酶在50。C時酶活最高，此時的平均相對酶活力為100%。2、酶反應(yīng)最適pH值的測定采用pH值分別為2.4、3.4、4.4、5.4、6.4和7.4的Na2HP04-檸檬酸緩沖液，將上述步驟二獲得的含有木聚糖酶的上清液稀釋100倍，底物(木聚糖)也用相同的緩沖液配制，5(TC條件下測定木聚糖酶的酶活，并計算木聚糖酶的相對活力。以pH值2.4-7.4范圍內(nèi)測得的最高酶活力為基礎(chǔ)，其它pH值下測得的酶活力與之相比，所得數(shù)值即為該pH值下的相對酶活力。實驗設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，5(TC條件下，上述步驟二獲得的木聚糖酶在pH4.4時酶活最高，此時的平均相對酶活力為100%。序列表〈160〉1<210>1〈211〉624<212〉腿<213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>1gttccacacgactctgtcgtcgagagatctgacgctttgcacaagttgtctgagagatct60accccatcctctaccggtgagaacaacggtttctactactccttctggaccgacggtggt120ggtgacgtcacctacaccaacggtgacgctggttcctacaccgtcgagtggtccaacgtt180ggtaacttcgttggtggtaagggttggaacccaggttctgctcaagacatcacctactcc240ggtaccttcaccccatccggtaacggttacttgtccgtctacggttggaccactgaccca300ttgatcgagtactacatcgtcgagtcctacggcgactacaacccaggttccggtggtact360tacaagggtaccgtcacttccgacggttccgtctacgacatctacaccgctaccagaacc420aacgctgcttctatccaaggtaccgctaccttcacccaatactggtccgttagacaaaac480aagagagttggtggtactgttaccacttccaaccacttcaacgcttgggctaagttgggt540atgaacttgggtactcacaactaccaaatcgtcgctaccgagggttaccaatcctctggt600624200810239321.1tcttcctccatcactgttcaatga權(quán)利要求1、一種木聚糖酶編碼基因，為如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼木聚糖酶的DNA分子；3)與1)的基因具有90％以上的同源性，且編碼木聚糖酶的DNA分子。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因，其特征在于所述木聚糖酶的氨基酸序列如GenBankAccessionNo.DQ168666所示。3、含有權(quán)利要求l所述基因的重組表達(dá)載體和表達(dá)盒。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPzaA的多克隆位點間插入權(quán)利要求1所述基因得到的重組表達(dá)載體。5、含有權(quán)利要求l所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。6、含有權(quán)利要求l所述基因的重組菌。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母x-33中得到的重組菌。8、擴增權(quán)利要求l所述木聚糖酶編碼基因全長或其任一片段的引物對。9、一種制備木聚糖酶的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求6或7所述的重組菌，得到木聚糖酶。10、權(quán)利要求6或7所述的重組菌在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種木聚糖酶編碼基因。該基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼木聚糖酶的DNA分子；3)與1)的基因具有90％以上的同源性，且編碼木聚糖酶的DNA分子。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，合成了上述木聚糖酶編碼基因，并將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，從而能高效生產(chǎn)木聚糖酶。搖瓶發(fā)酵研究表明，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的木聚糖酶的產(chǎn)量達(dá)到20000U/mL，該木聚糖酶的最適催化溫度為50℃，最適催化pH為4.4，適合作為豬、雞等單胃動物的飼料添加劑使用。文檔編號C12N5/10GK101418308SQ20081023932公開日2009年4月29日申請日期2008年12月10日優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日發(fā)明者于貴平,曹云鶴,李一航,李德發(fā),王春林申請人:北京德寶群興科技有限公司