一種天冬氨酸類蛋白酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種天冬氨酸類蛋白酶及其編碼基 因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 天冬氨酸類蛋白酶(asparticprotease，EC3·4·23)是一種內(nèi)切型淀粉酶，它的活 性中心由兩個催化性天冬氨酸殘基組成。它廣泛存在于動物，植物，微生物中，是一種工業(yè) 酶，在食品，釀酒，飲料，制藥等行業(yè)中具有廣泛應(yīng)用。目前已經(jīng)分離并鑒定的120種天冬氨 酸類蛋白酶，從數(shù)量上看微生物來源的天冬氨酸類蛋白酶占大多數(shù)。微生物中能產(chǎn)生酸性 蛋白酉每的有：Bacillus，Thermomonospor，Acinetobacter，Pseudomonas，Streptomyces， Aspergillus，Penicillus等。目前在工業(yè)上大量使用的天冬氨酸類蛋白酶主要來源于枯草 芽抱桿菌屬（Bacillussubtilis)，地衣（Bacilluslicheniformis)，黑曲霉 (八8卩6坪；[11118111區(qū)61')和米曲霉（八8卩6坪；[111180獷5^&6) 0
[0003]雖然天冬氨酸類蛋白酶的工業(yè)應(yīng)用和微生物的天冬氨酸類蛋白酶已經(jīng)研究了幾 十年，并取得了一定的進(jìn)展，但是符合工業(yè)應(yīng)用要求的仍然有限。
[0004]近年來，一系列植物微生物天冬氨酸類蛋白酶實現(xiàn)了在大腸桿菌或者在酵母中的 異源表達(dá)，如來源于棘孢木霉(Trichodermaasperellum)的天冬氨酸類蛋白酶被克隆到大 腸桿菌中實現(xiàn)了可溶性表達(dá)（KaiDoua，ZhiyingWang,RongshuZhang，etal.Cloning andcharacteristicanalysisofanovelasparticproteasegeneAsp55from TrichodermaasperellumACCC30536)，即便如此，還是沒有篩選得到適冷的、高效的天冬 氨酸類蛋白酶，因此開發(fā)這一類新酶依舊是研究熱點。1990年以來不少產(chǎn)蛋白酶的南極低 溫菌被分離和鑒定出來，1997年，M.FeniceAL等從南極維多利亞島上分離出5株都具有蛋白 酶活性的G.pannorumvar.pannorum,其中no· 1顯示出了顯著的活力，有產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用價值 (參見M.FeniceaLetal. 1997.ProductionofextracellularenzymesbyAntarctic fungalstrains.PolarBiol,17:275-280)。2011年，AbiramyKrishn等再次在南極島上篩 選到了數(shù)株低溫下分泌蛋白酶的真菌，其中主要菌種為Geomycespannorum(參見 AbiramyKrishnetal.2011.Extracellularhydrolaseemzymeproductionby soilfungifromKingGeorgeIsland,Antarctic.PolarBiol，34:1535-1542) 〇雖然已知 Geomycespannorum具有客觀的蛋白酶活性，但是關(guān)于其淀粉酶的基因序列和淀粉序列并沒 有報道，且由于該菌培養(yǎng)條件限制，至今還沒有分離純化出其蛋白酶，對其酶學(xué)性質(zhì)也沒有 研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種天冬氨酸類蛋白酶及其編碼基因與應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有 技術(shù)中的天冬氨酸類蛋白酶較少符合工業(yè)應(yīng)用要求的缺陷。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種天冬氨酸類蛋白酶，所述天冬氨酸類蛋白酶是 如下（a)或(b)的蛋白質(zhì)：（a)由SEQIDN0:3所不的氣基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；（b)將 SEQIDN0:3所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且具有天冬氨酸類蛋白酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 該天冬氨酸類蛋白酶來源于南極低溫菌Geomycespannorum(菌種保藏號CCTCC AF2014016)。
[0009]為了便于天冬氨酸類蛋白酶的純化，可在由SEQIDN0:3限定的氨基酸殘基序列 組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0010] 表1
[0012] 本發(fā)明還提供一種天冬氨酸類蛋白酶基因，編碼如上所述的天冬氨酸類蛋白酶。
[0013] 所述天冬氨酸類蛋白酶基因的堿基序列如下：1)如SEQIDN0:2所示的堿基序列； 或2)在嚴(yán)格條件下可與SEQIDN0:2限定的堿基序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的 DNA分子;或3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA 分子。
[0014] 上述嚴(yán)格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1 %SDS的溶液中，在65°C條件下 雜交并洗月旲。
[0015]上述(b)限定的天冬氨酸類蛋白酶可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生 物表達(dá)得到。上述(b)中的淀粉酶的編碼基因可通過將SEQIDN0:2的自5'末端第1 -1542位 堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對 的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0016]本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒如上所述的天冬氨酸類蛋白酶基因與 表達(dá)載體質(zhì)粒連接構(gòu)建而成。
[0017] 所述表達(dá)載體質(zhì)粒是米曲霉表達(dá)載體pSKNHG。
[0018]本發(fā)明還提供包含如上所述的天冬氨酸類蛋白酶基因的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重 組菌。
[0019]優(yōu)選地，所述重組菌是將上述含有天冬氨酸類蛋白酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入米曲霉 中獲得的重組菌。
[0020] 本發(fā)明還提供一種制備天冬氨酸類蛋白酶的方法。
[0021] 本發(fā)明所提供的制備天冬氨酸類蛋白酶的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)上述含有天冬氨酸類 蛋白酶基因的重組菌，得到天冬氨酸類蛋白酶。
[0022] 本發(fā)明還提供一種如上所述的天冬氨酸類蛋白酶在食品，釀酒，飲料，制藥行業(yè)中 的應(yīng)用。
[0023]該天冬氨酸類蛋白酶的最適作用溫度為60°C，且在50_70°C仍然保持較高酶活力， 屬于中溫蛋白酶，在pHl.0~5.0的區(qū)間內(nèi)均具有較好的pH穩(wěn)定性。
[0024]本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，從南極低溫菌Geomycespannorum中擴(kuò)增得到天冬氨酸 類蛋白酶基因，并將其轉(zhuǎn)入米曲霉中成功實現(xiàn)異源表達(dá)。本發(fā)明提供的天冬氨酸類蛋白酶 具有較高的最適反應(yīng)溫度，且熱穩(wěn)定性好，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明純化的天冬氨酸類蛋白酶的SDS-PAGE圖，其中，Μ為蛋白Marker，l為 純化后的GpAl蛋白；
[0026]圖2是Geomycespannorum天冬氨酸類蛋白酶的溫度曲線；
[0027]圖3是Geomycespannorum天冬氨酸類蛋白酶的溫度耐受性；
[0028]圖4是Geomycespannorum天冬氨酸類蛋白酶的pH曲線；
[0029]圖5是Geomycespannorum天冬氨酸類蛋白酶的pH耐·受性。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0031]下述實施例中所述試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法;所述試劑或耗材，如 無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑獲得。實驗按《分子克隆：實驗室手冊》（NewYork:Cold SpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件進(jìn)行，或按照廠商所建議的條件進(jìn) 行。
[0032]實施例1天冬氨酸類蛋白酶基因的擴(kuò)增
[0033] 1.1菌株及其培養(yǎng)
[0034] 從馬來西亞大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院合作項目中獲贈南極低溫菌Geomycespannorum(菌 種鑒定NCBI登錄號JF20026,已保藏在CCTCC，編號為AF2014016)。
[0035]用無菌水從培養(yǎng)10天的PDA斜面上洗下G.pannorum孢子，接種液體培養(yǎng)基，20°C培 養(yǎng)7天收集菌絲體，用于基因組提取：用牙簽接種奶粉固體培養(yǎng)基，20°C培養(yǎng)5天收集菌絲， 用于總RNA提取。
[0036] 1.2基因組提取
[0037]按照Omega真菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0038]1.3總RNA提取
[0039] 按照TakaraRNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0040]1 · 4cDNA第一鏈合成
[0041]以抽提的總mRNA為模板，用Takara試劑盒的方法獲得cDNA第一鏈，PCR體系(如表 2和表3所述)及操作步驟如下：
[0042]表2
[0043]
[0044] 65°C保溫5min，冰上迅速冷卻，向上述反應(yīng)管中加入
[0045] 表 3
[0047] 42°C45min，95°C5min，冰上冷卻。
[0048] 1.5Geomycespannorum天冬氨酸類蛋白酶基因的克隆
[0049] 在NCBI上找到另一株Geomycespannorum菌種的天冬氨酸蛋白酶氨基酸序列，該菌 株與本申請所采用Geomycespannorum屬于不同種，根據(jù)該序列設(shè)計正向引物Alf，反向引物 Air。其中：
[0050] Pl〇f:5'ATGCCTTCTTCGGCGGCCGT3'
[0051] P1Or：5'TCAAACAACAATCAACAATC3'
[0052] 表 4
[0054]以1.2獲得的基因組為模板，采用表4所示反應(yīng)體系進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為:94°C預(yù) 變性4min; 94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)；72°C延伸10min;保存在4 °C。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收，連pMD19-TSimpleVector，菌落PCR驗證陽性克 隆送測序，測序由華大基因完成。
[0055]1.6天冬氨酸類蛋白酶cDNA的克隆
[0056]分析1.5得到的天冬氨酸類蛋白酶基因DNA序列，根據(jù)保守氨基酸序列以3的倍數(shù) 遞推，同時結(jié)合NCBIBlastX比對結(jié)果，找到了可能性最大的起始密碼子ATG和終止密碼子 丁八八。在密碼子上預(yù)測網(wǎng)站（111^卩：//1；[111^1.80；1^1^61^7.(3 0111/^61'巧.卩111：1111?81'0叩= programs&subgroup=gfind&topic=fgenesh)，得到了主要可能的內(nèi)含子，設(shè)計0RF的特異 性引物：
[0057] Pl〇f2:5'ATGCCTTCTTCGGCGGCCGT3'
[0058] Pl〇r2:5'TCAAACAACAATCAACAATC3'
[0059]以1·4獲得的GeomycespannorumcDNA為模板，采用特異性引物P10f2和P10r2，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增a-淀粉酶0RF，PCR體系如下表5所示：
[0060]表 5
[0062]反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min;94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循 環(huán);72°C延伸lO