家蠶血細(xì)胞特異表達(dá)基因組織蛋白酶o調(diào)控元件的鑒定的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，家蠶血細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白酶〇基因啟動(dòng) 子分析與鑒定。具體涉及家蠶血細(xì)胞特異性表達(dá)基因的篩選方法及由蛋白酶〇基因啟動(dòng)子 的克隆，分析發(fā)現(xiàn)其血細(xì)胞特異表達(dá)調(diào)控元件的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 家蠶是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲，作為鱗翅目的模式生物，家蠶在理論研宄 和生產(chǎn)應(yīng)用方面都具有重要作用。目前對(duì)家蠶血細(xì)胞的研宄比較少，主要原因是可以利用 的研宄手段有限。隨著家蠶基因組框架圖和精細(xì)圖譜繪制工作的相繼完成，人類對(duì)家蠶的 研宄和認(rèn)識(shí)已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代，"發(fā)現(xiàn)基因，研宄基因，利用基因"是我們現(xiàn)在研宄家蠶 的主要策略，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多的家蠶血液特異表達(dá)基因，面對(duì)這些大量的未知基因，如何 研宄和利用這些基因是我們目前要解決的主要任務(wù)之一。隨著家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的突破和完 善，轉(zhuǎn)基因已經(jīng)成為家蠶研宄基因和利用基因的強(qiáng)有力工具，但轉(zhuǎn)基因技術(shù)也需要其他研 宄工具的配合才能更好的發(fā)揮功效。這些血細(xì)胞特異高量表達(dá)的基因可能具有非常重要的 作用，其中也包括不少和家蠶免疫抗性相關(guān)的基因，要通過轉(zhuǎn)基因來研宄和利用這些家蠶 血細(xì)胞特異高量表達(dá)的基因就需要有一個(gè)家蠶血細(xì)胞特異高量表達(dá)的啟動(dòng)子，但目前沒有 家蠶血細(xì)胞特異高量表達(dá)啟動(dòng)子的相關(guān)報(bào)道。研宄家蠶血細(xì)胞特異性的表達(dá)基因及其功能 與調(diào)控，對(duì)于闡釋家蠶血細(xì)胞的生長發(fā)育分子機(jī)理具有重要意義。
[0003] Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提供快速有效的方法產(chǎn)生重組桿狀病毒。此方 法基于讓已經(jīng)轉(zhuǎn)入桿狀病的質(zhì)粒的位點(diǎn)特意轉(zhuǎn)座子的表達(dá)框的質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增。 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)主要包括：pFastBac捐獻(xiàn)質(zhì)粒的選擇，它要能夠產(chǎn)生包含目 的位點(diǎn)的表達(dá)結(jié)構(gòu)，這個(gè)目的基因的產(chǎn)生被桿狀病毒特意位點(diǎn)啟動(dòng)子控制。一個(gè)大腸桿菌 宿主，DHlOBac，包含桿狀病毒質(zhì)粒（桿粒）和輔助質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染pFastBac表達(dá)結(jié)構(gòu)后可以 產(chǎn)生重組桿粒。一個(gè)控制表達(dá)的質(zhì)粒，包括Gus或CAT基因，以便在感染細(xì)胞后產(chǎn)生重組桿 狀病毒，表達(dá)β -葡萄糖酸酐酶或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Y. Zhai等人以Bac-to-Bac系統(tǒng)結(jié)合 螢光素酶報(bào)告基因重構(gòu)載體分析了家蠶乙酰葡糖胺糖苷酶的啟動(dòng)子活性，表明啟動(dòng)子活性 與基因表達(dá)水平一直于在血液、皮膚、脂肪體高表達(dá)，截?cái)喾治霭l(fā)現(xiàn)基因 -347~-223bp存 在核心調(diào)控元件。J. 等人應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分析了家蠶內(nèi)源性卵黃蛋白原基因啟動(dòng)子 的功能特性，實(shí)驗(yàn)表明其啟動(dòng)子只在蛹期雌性家蠶脂肪體表達(dá)，具有性別，組織、時(shí)間三重 特異的表達(dá)模式。高志宏等利用Bac-to-Bac系統(tǒng)對(duì)絲素重鏈啟動(dòng)子進(jìn)行研宄，在絲腺中， 2. Ikb的啟動(dòng)子僅在后部絲腺驅(qū)動(dòng)EGFP蛋白的表達(dá)，而在中部絲腺中不表達(dá)，0. 9k~2. Ik 的區(qū)域可能存在其他的順式調(diào)控元件
[0004] 本研宄首先通過家蠶組織芯片表達(dá)數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RT-PCR等方法，篩選出蛋 白酶0基因?yàn)檠?xì)胞特異表達(dá)候選基因。然后對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行克隆，并對(duì)候選基因的啟動(dòng) 子區(qū)進(jìn)行克隆。我們成功對(duì)Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一套有效的 血細(xì)胞啟動(dòng)子檢測體系。最后在細(xì)胞和個(gè)體水平對(duì)候選基因啟動(dòng)子活性進(jìn)行檢測，并對(duì)其 組織特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。通過本研宄得到家蠶血細(xì)胞特異性基因蛋白酶O基因啟動(dòng)子，分 析發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-333到-80之間片段具有組織特異性調(diào)控元件，控制 該基因在血細(xì)胞的特異表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及到家蠶血細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白酶0基因啟動(dòng)子分析與鑒定。具體涉及 家蠶血細(xì)胞特異性表達(dá)基因的篩選方法及由蛋白酶〇基因啟動(dòng)子的克隆，分析發(fā)現(xiàn)其血細(xì) 胞特異表達(dá)調(diào)控元件的方法。
[0006] 1、首先通過家蠶組織芯片表達(dá)數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和定量RT-PCR等方法，篩選出血 細(xì)胞特異表達(dá)候選基因蛋白酶〇基因，成功驗(yàn)證該基因家蠶血細(xì)胞特異表達(dá)。
[0007] 2、成功對(duì)相關(guān)基因啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，并進(jìn)行功能分析。
[0008] 3、克服了無家蠶血細(xì)胞特異啟動(dòng)子這一困難，我們成功對(duì)Bac-to-Bac桿狀病毒 表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一套有效的血細(xì)胞啟動(dòng)子檢測體系。最后在細(xì)胞和個(gè)體水平 對(duì)候選基因啟動(dòng)子活性進(jìn)行檢測，并對(duì)其組織特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。為家蠶血細(xì)胞特異高量 表達(dá)基因的研宄和利用提供了有利的工具。
[0009] 4、通過本研宄得到家蠶血細(xì)胞特異性基因蛋白酶0基因啟動(dòng)子，分析發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng) 子在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-333到-80之間片段具有組織特異性調(diào)控元件，控制該基因在血細(xì) 胞的特異表達(dá)。
[0010] 為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說明如下
【附圖說明】
[0011] 圖1芯片數(shù)據(jù)篩選家蠶血細(xì)胞特異基因
[0012] 家蠶組織芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，表達(dá)強(qiáng)度大于800,則認(rèn)為該基因表達(dá)，分析發(fā)現(xiàn)芯 片探針號(hào)為SW05834和SW17255,兩個(gè)探針在SilkDB數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)的同一個(gè)注釋基因編號(hào) 為BGIBMGA009231，該基因表達(dá)集中在血液中，且表達(dá)量較高，表明具有血液特異性。
[0013] 圖2家蠶組織蛋白酶0組織表達(dá)譜
[0014] 提取家蠶各組織的RNA反轉(zhuǎn)成cDNA之后進(jìn)行Real Time PCR檢測，結(jié)果證明了組 織蛋白酶0基因在血液中特異表達(dá)。
[0015] 圖3 5' RACE片段克隆結(jié)果
[0016] 1 :保守序列克隆；2 :5' RACE片段；
[0017] 利用PCR和RACE技術(shù)，克隆得到了家蠶組織蛋白酶0的5'末端序列，確定了組織 蛋白酶0基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS)。
[0018] 圖4 TFSEARCH對(duì)啟動(dòng)子組織蛋白酶0啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子
[0019] 在線使用TFSEARCH對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析HSF :heat shock facteor (熱 激蛋白因子）Dfd :Deformed 元件 BR-C :Broad_Complex 元件 Hb : (Hunchback)元件 Kr : (Krueppel)元件 TSS :轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。圖中表示了 pBmCat0(1912bp，_1836/+76，）、 pBmCatOl(1530bp，-1454/+76)、pBmCat02(938bp，-862/+76)、pBmCat03(409bp，-333/+76)、 and pBmCat04(l56bp，_8〇/+76)引物的位點(diǎn)。
[0020] 圖5組織蛋白酶0啟動(dòng)子序列各截?cái)嗍疽鈭D
[0021] 圖6組織蛋白酶0啟動(dòng)子序列各截?cái)嗥蜳CR圖
[0022] I :PBmCat0(1912bp，-1836/ + 76,）2 :pBmCat01 (1530bp，-1454/ + 76) 3 : pBmCat02(938bp， -862/+76)4 :pBmCat03(409bp， -333/+76)5 :and pBmCat04 (156bp, -80/+76) M ：marker
[0023] 按照（圖4)示意圖對(duì)家蠶組織蛋白酶0基因組序列分別設(shè)計(jì)該基因各截短啟動(dòng) 子。SEQ ID No :16 ~SEQ ID No :21 所示的擴(kuò)增引物 pBmCat〇-F/pBmCat〇-R，pBmCat01-F/ pBmCat〇-R，pBmCat02_F/pBmCat〇-R，pBmCat03_FpBmC/pBmCat〇-R 和 pBmCat04_F/pBmCat〇-R 引物對(duì)分別擴(kuò)增出 pBmCat0(1912bp，-1836/+76,），pBmCat01(1530bp，-1454/+76)， pBmCat02(938bp，-862/+76)，pBmCat03(409bp，-333/+76)，and pBmCat04(156bp，-80/+76) 的啟動(dòng)子片段，分別測序驗(yàn)證，證明克隆啟動(dòng)子的正確。
[0024] 圖7 pFastBac?Dual載體以及載體改裝示意圖
[0025] 圖7-a為pFastBac?Dual載體結(jié)構(gòu)圖，圖7-b為載體改裝示意圖：pPH作為陽性對(duì) 照含有兩個(gè)啟動(dòng)子P pitl啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)的，P PH啟動(dòng)DsRed的表達(dá)，P Λ P作為陰性對(duì) 照，只含有能驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)的Ppici, PHS為實(shí)驗(yàn)組Ppici驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)，而我們的組織蛋白酶 〇的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DsRed的在組織中的表達(dá)。EGFP信號(hào)代表了被病毒侵染的程度，而DsRed 信號(hào)表示啟動(dòng)是否在該組織有活性。
[0026] 圖8組織蛋白酶0啟動(dòng)子片段重組Bacmid的鑒定
[0027] 圖 8-a 中，1 :藍(lán)斑 2 :白斑 A 3 :白斑 B 4 :白斑 C (1-4 引物為 EGFP-R/M13-R) 5 : 藍(lán)斑6 :白斑A 7 :白斑B 8 :白斑C(5-8引物為M13-F/M13-R) 9、Marker圖8-b中1 :藍(lán)斑 2 :pFast 空載 3 :pPH 4 :pCat0(l-5 引物為 EGFP-R/M13-R) 6 :2K plus marker 7 :藍(lán)斑 8 : pFast 空載 9 :pPH 10 :pCatO
[0028] (7-11 引物為 M13-F/M13-R) 12 :marker
[0029] 白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)提取重組病毒Bacmid，M13F/M13R引物分別位于病毒Bacmid 的轉(zhuǎn)座元件mini-attTn7的兩側(cè)，當(dāng)無外源基因插入時(shí)PCR擴(kuò)增會(huì)出現(xiàn)約300bp，轉(zhuǎn)化后發(fā) 生重組的Bacmid PCR產(chǎn)物會(huì)明顯增大大小為2560bp加上插入克隆片段的大小，如圖所示 pCatO重組Bacmid用SEQ ID NO 14~SEQ ID吣：15所示的擴(kuò)增引物組34/]?13-1?對(duì)可 以擴(kuò)出6000bp的片段，而藍(lán)斑沒發(fā)生重組只有300bp大小，說明發(fā)生了重組，EGFP-R/M13-R 引物對(duì)能在白斑擴(kuò)出4000bp左右的特異片段，而藍(lán)斑無法擴(kuò)出任何片段說明，插入的片段 就是我們克隆的啟動(dòng)子序列已經(jīng)EGFP和dsred的片段。同樣的原理對(duì)pFast空載以及pPH 也做了鑒定，說明了載體的構(gòu)建準(zhǔn)確，已經(jīng)重組Bacmid的正確性。
[0030] 圖9組織蛋白酶0啟動(dòng)子各截短片段在細(xì)胞系SWU-3上啟動(dòng)子活性檢測
[0031] 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和病毒感染swu-3細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照p Λ P只能表達(dá)綠色熒光蛋白 說明病毒感染的狀況，陽性對(duì)照PPH能