一種hla-dqb1基因分型的組特異性引物pcr-sbt方法及試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因分型檢測方法，尤其涉及一種用于HLA-DQBl基因分型的分子生 物學(xué)檢測方法，本發(fā)明還涉及該方法所應(yīng)用的試劑和有關(guān)實驗參數(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類白細(xì)胞抗原（HLA)基因位于第6號染色體短臂21. 3區(qū)域，是調(diào)控人體特異性 免疫應(yīng)答的主要基因系統(tǒng)，是目前所知的最富多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)。HLA抗原與同種器官移 植的排斥反應(yīng)密切相關(guān)，器官移植術(shù)后移植物能否存活很大程度上取決于供者與受者之間 HLA型別是否相合。準(zhǔn)確的HLA分型對選擇合適的供者、降低移植物抗宿主?。℅VHD)的發(fā) 生率、提高移植物的存活率均有重要意義。
[0003] HLA-DQBl屬于經(jīng)典的HLA-II類基因，在免疫應(yīng)答中起重要作用，現(xiàn)在HLA-DQBl的 分型已被大多數(shù)免疫遺傳實驗室作為常規(guī)檢測用于移植供受者配對選擇。HLA-DQBl有6個 外顯子，目前常規(guī)檢測主要為第2和第3外顯子的多態(tài)性。HLA-DQBl具有高度遺傳多態(tài)性， 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)在內(nèi)含子和外顯子區(qū)域均有豐 富的分布，如第1內(nèi)含子中平均每7個核苷酸即存在1個SNP位點，在第2和第3外顯子平 均每6個核苷酸有1個SNP位點，并且不同組特異性等位基因 SNP位點不同。熟悉HLA-DQB1 基因這些特點，對于分析HLA-DQB1基因序列確定等位基因型有一定的幫助。
[0004] HLA測序分型為國際通用的組織配型高分辨檢測技術(shù)，基因測序分型技術(shù)的關(guān) 鍵之一在于引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增。由于HLA-DQBl每一組等位基因在內(nèi)含子和外顯子均存在 共享序列，為同時檢測多組DQBl等位基因多態(tài)性，在試劑引物中可能含有多對擴(kuò)增引物。 在PCR同時擴(kuò)增多對引物時由于存在競爭作用，某些等位基因會出現(xiàn)優(yōu)勢擴(kuò)增現(xiàn)象。國外 學(xué)者已報道DQBl基因在DQB1*02和DQB*03、DQBI*04等雜合情況下容易導(dǎo)致等位基因漏 檢。國內(nèi)也有研宄報道DQB1*06與DQB1*02雜合時，DQB*06等位基因優(yōu)先擴(kuò)增，DQB1*03 與DQB1*02雜合時，DQB1*03等位基因優(yōu)先擴(kuò)增，從而導(dǎo)致DQB1*02等位基因漏檢。我們 在前期研宄中也發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的商用試劑盒雖然可以同步檢測HLA-DQBl的第2和3號外顯 子，但是也存在類似的等位基因漏檢情況。因此，現(xiàn)有的方法存在一定缺陷，建立一種針對 HLA-DQBl單一等位基因的PCR-SBT方法可以保證不同等位基因的有效擴(kuò)增，對于提供準(zhǔn)確 的HLA-DQBl分型結(jié)果有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于HLA-DQBl基因分型的組特異性引物 PCR-SBT試劑，以克服現(xiàn)有基因分型技術(shù)中的上述不足。
[0006] 為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 它由用于擴(kuò)增的6對組特異性引物和用于測序分析的4條寡核苷酸測序引物組成； 所述用于擴(kuò)增的引物為： (1) 擴(kuò)增HLA-DQB1*02組的特異性引物 DQB1*02F :5'-CTCGTCATTCCCTTGAACTG-3' DQB1*02R :5'-AACCACCGGACTTTGATCTG-3'， (2) 擴(kuò)增HLA-DQB1*03:Ol組的特異性引物 DQB1*0301F :5'-TCAAAAGCTTGTGCTCTTTCAG-3' DQB1*0301R :5'-CAGTCCCTCCGAGCTATCAG-3'， (3) 擴(kuò)增HLA-DQB1*03組（除DQB1*03:01外）和DQB1*04組的特異性引物 DQB1*04F :5'-GATGAGGTGAGCACAGTCGG-3， DQB1*04R :5'-CTCCGAGCTATCAGGACTGG-3'， (4) 擴(kuò)增HLA-DQB1*05組的特異性引物 DQB1*05F :5'-ACAGCAGGATTTGTCATTTCA-3' DQB1*05R :5'-GTCCTGTCTCCTCGCACTTC-3'， (5) 擴(kuò)增HLA-DQB1*06:01組的特異性引物 DQB1*0601F :5'-GGAAATACAAGGCAGCAATGA-3' DQB1*0601R :5'-CCTGCTGAGGAGCTGAAGTC-3'， (6) 擴(kuò)增HLA-DQB1*06組（除DQB1*06:01外）的特異性引物 DQB1*0602F :5'-CAAGACTGCCTGGACTTAGG-3' DQB1*0602R :5'-AGGACTGGGATTCAGAGCAA-3' ； 所述用于測序的4條寡核苷酸測序引物序列如下： DQB1-2F :5'-GGCCSGTGATTCCYCGCAG-3' DQB1-2R :5'-GGKCRACSMCGCTCACCTC-3' DQB1-3F :5'-CTTTYCCTGTCTGTTACTGC-3' DQB1-3R :5'-GGCCCAYARTAACAGAAACTC-3'。
[0007] 本發(fā)明還提供一種HLA-DQB1基因分型的組特異性引物PCR-SBT方法，它對 HLA-DQBl基因進(jìn)行分型，包括以下步驟： (1) 制備人基因組DNA ; (2) 提供擴(kuò)增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴(kuò)增人基因組DNA中HLA-DQBl不同等位基因 型序列； (3) 將步驟（2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切純化； (4) 提供測序引物，將步驟（3)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行測序PCR反應(yīng)； (5) 將步驟（4)得到的測序產(chǎn)物進(jìn)行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序； (6) 將步驟（5)獲得的序列通過軟件分析，確定HLA-DQBl等位基因型。
[0008] 所述步驟（2)中的擴(kuò)增引物為上述6對組特異性引物，所述步驟（4)中的測序引物 為上述4條寡核苷酸測序引物。
[0009] 所述步驟（3)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0010] 本發(fā)明中引物設(shè)計是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，有關(guān)引物設(shè)計的方法和軟件均可從英特網(wǎng) 上免費獲得。本發(fā)明所設(shè)計的寡核苷酸引物是根據(jù)頂GT/HLA數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi. ac. uk/imgt/hla/)中HLA-DQBl位點基因序列中包括多態(tài)性位點在內(nèi)的連續(xù)寡核苷酸序列 而獲得的。所有引物的設(shè)計均避開目前已知的突變位點或采用簡并引物方法，以免因位點 的漏檢而導(dǎo)致分型錯誤。本發(fā)明中6對寡核苷酸擴(kuò)增引物分別針對HLA-DQBl位點不同等 位基因組的共有序列設(shè)計，每對擴(kuò)增引物只特異性擴(kuò)增一組等位基因第2和第3外顯子，避 免了其他組等位基因的干擾。測序引物選擇HLA-DQBl基因的保守區(qū)域設(shè)計，4條共同的測 序引物可對不同組等位基因的擴(kuò)增片段進(jìn)行雙向測序，保證清晰準(zhǔn)確檢測第2和第3外顯 子的全部序列，從而將標(biāo)本進(jìn)行精確的分型。
[0011] 本發(fā)明在明確HLA-DQBl位點組特異性的基礎(chǔ)上，選擇不同的組特異性引物擴(kuò)增 HLA-DQBl位點第2和第3外顯子，進(jìn)而應(yīng)用共同的測序引物進(jìn)行雙向測序分析，精確地確定 HLA-DQBl的等位基因型。利用這些組特異性引物可以對樣本的單體型進(jìn)行有效分離，在新 等位基因的鑒定方面有重要作用。此外，本發(fā)明可有效判定等位基因型的漏檢情況，彌補(bǔ)現(xiàn) 有分型方法的不足，有助于準(zhǔn)確指定HLA-DQBl等位基因型別。
[0012] 本發(fā)明所提供的試劑和方法可作為一種獨立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法，能成功解 決HLA-DQBl位點的準(zhǔn)確分型鑒定問題，有利于提高造血干細(xì)胞移植供受者HLA配型的準(zhǔn)確 性，從而選擇更合適的移植供者，降低移植過程中的排斥反應(yīng)，這對于進(jìn)一步提高器官移植 的成功率和生存率具有重要的意義。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明中檢測標(biāo)本的HLA-DQBl基因 PCR擴(kuò)增電泳圖譜。1孔為DQB1*02組 擴(kuò)增片段，2孔為DQB1*03:01組擴(kuò)增片段，3孔為DQB1*03組（除DQB1*03:01外)和DQB1*04 組擴(kuò)增片段，4孔為DQB1*05組擴(kuò)增片段，5孔為DQB1*06:01組擴(kuò)增片段，6孔為的DQB1*06 組（除DQB1*06:01外）擴(kuò)增片段。M為DNA marker，分子量分別為2000, 1000,750，500， 250, IOObp0
[0014] 圖2-7為本發(fā)明檢測的HLA-DQBl基因部分測序電泳圖譜，圖中A、G、C、T分別為 測序的四種堿基，A為腺嘌呤，G為鳥嘌呤，C為胞嘧啶，T為胸腺嘧啶。
[0015] 圖2為HLA-DQBl基因第2外顯子部分多態(tài)性序列圖譜，樣本分型結(jié)果為 DQB1*02:01。
[0016] 圖3為HLA-DQBl基因第2外顯子部分多態(tài)性序列圖譜，樣本分型結(jié)果為 DQB1*03:01。
[0017] 圖4為HLA-DQBl基因第2外顯子部分多態(tài)性序列圖譜，樣本分型結(jié)果為 DQB1*03:03。
[0018] 圖5為HLA-DQBl基因第2外顯子部分多態(tài)性序列圖譜，樣本分型結(jié)果為 DQB1*05:03。
[0019] 圖6為HLA-DQBl基因第2外顯子部分多態(tài)性序列圖譜，樣本分型結(jié)果為 DQB1*06:01。
[0020] 圖7為HLA-DQBl基因第2外顯子部分多態(tài)性序列圖譜，