本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及具有免疫提升功能的肽類分子--免疫增強(qiáng)肽作為藥物成份，通過作用于機(jī)體的粘膜部位提升機(jī)體的免疫功能達(dá)到預(yù)防和治療與免疫相關(guān)疾病的目的。
背景技術(shù)：
：生物體的遺傳基因被存儲(chǔ)在多聚脫氧核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執(zhí)行生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)多種多樣，它們行使著各種生物學(xué)功能維持生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)的種類雖然多不勝舉，但它們基本上都是由20個(gè)自然界存在的天然氨基酸組成。由于氨基酸的組成和排列順序的差異導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的千差萬別。一般來說，含有50個(gè)以上氨基酸的分子被稱為蛋白質(zhì)，游離出蛋白質(zhì)的一段氨基酸序列分子(序列可長(zhǎng)可短)統(tǒng)稱為肽段或肽，一般含10-50個(gè)氨基酸的肽鏈被稱為多肽，少于10個(gè)氨基酸的肽鏈被稱做寡肽或小肽。目前發(fā)現(xiàn)最小的功能小肽只有2個(gè)氨基酸，通常較為常見的是4個(gè)氨基酸以上的功能小肽。由于人類基因組計(jì)劃的完成和人類蛋白組計(jì)劃的開展，將會(huì)有越來越多的蛋白質(zhì)功能片段被發(fā)現(xiàn)并被作為藥物應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域中來。蛋白質(zhì)的功能片段通常是指被發(fā)現(xiàn)具備某種特定生物學(xué)功能的直鏈肽片段，它們通常是由幾個(gè)，或十幾個(gè)，乃至幾十個(gè)氨基酸組成的肽類片段，這些被鑒定和發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的功能片段可通過人工合成的途徑制備?，F(xiàn)已開發(fā)并在臨床上得到應(yīng)用的多肽藥物有“催產(chǎn)素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”、“tuftsin”、“bursin”等，也有在天然肽鏈的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改造的多肽藥物，比如，用于治療消化道出血和肢端肥大癥的環(huán)狀多肽藥物“奧曲肽”和用于抗凝血的肽段拼接藥物“水蛭肽”等。目前應(yīng)用于臨床的免疫增強(qiáng)肽均是人體胸腺組織產(chǎn)生的天然免疫活性肽，一個(gè)是含有28個(gè)氨基酸的肽鏈thymosinα1(胸腺肽α1),商品名“日達(dá)仙”，另一個(gè)是thymopentin-5(胸腺五肽)。“日達(dá)仙”的臨床適應(yīng)癥為慢性乙型肝炎，還可用于腫瘤和免疫功能低下的輔助治療。使用時(shí)只能注射，且不能肌肉注射或靜脈注射，只能使用隨包裝的1.0ml注射用水溶解后立即皮下注射?！靶叵傥咫摹庇糜谥委?8歲以上患者的慢性乙型肝炎、各種原發(fā)性或繼發(fā)性t細(xì)胞缺陷病(如兒童先天性免疫缺陷病)、某些自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡)和各種細(xì)胞免疫功能低下的疾病，還可用于腫瘤的輔助治療；使用時(shí)采取肌肉注射或加入葡萄糖中靜脈滴注。由于肽類藥物屬于生物活性類物質(zhì)，對(duì)溫度敏感，易降解，因此目前都是凍干粉針劑，且藥物需采取冷鏈運(yùn)輸和低溫存貯。使用時(shí)為了獲得最大的藥物生物利用度，達(dá)到良好的藥效，需要從冷柜中取出后即刻使用。并且，為了以最快速度讓藥物達(dá)到最高血藥濃度，發(fā)揮藥效，只能采取注射途徑，否則藥物還未到達(dá)作用部位就已降解，嚴(yán)重影響生物利用度。因此，目前免疫增強(qiáng)肽的給藥需要醫(yī)護(hù)人員的專業(yè)操作才能完成，并屬于創(chuàng)傷性給藥方式，對(duì)于患有慢性病、免疫功能低下需要持續(xù)接受治療的患者，注射給藥的方式造成了額外的痛苦和不便。于是，為患者開發(fā)出一種無創(chuàng)傷、無痛苦、簡(jiǎn)便易行、易于實(shí)施的免疫增強(qiáng)肽的給藥方式勢(shì)在必行。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，第一方面，提供免疫增強(qiáng)肽在制備粘膜給藥增強(qiáng)免疫功能藥物中的應(yīng)用，所述粘膜為眼部粘膜、呼吸道粘膜(優(yōu)選鼻咽腔粘膜)、消化道粘膜(優(yōu)選胃腸道粘膜)、陰道粘膜、尿道粘膜、肛門直腸粘膜、動(dòng)物泄殖腔粘膜。所述增強(qiáng)免疫功能藥物包括預(yù)防和治療鼻炎、咽炎、氣管炎的藥物，增強(qiáng)免疫功能藥物通過與分布在鼻咽腔黏膜的免疫細(xì)胞相互作用，有效提升機(jī)體免疫機(jī)能，達(dá)到預(yù)防和治療鼻炎、咽炎、氣管炎的目的；優(yōu)選的，所述鼻炎、咽炎、氣管炎是由細(xì)菌感染引發(fā)的。所述增強(qiáng)免疫功能藥物還包括預(yù)防和治療免疫相關(guān)疾病的藥物，所述免疫相關(guān)疾病如細(xì)菌性感染疾病、病毒性感染疾病，免疫功能失調(diào)或低下。所述免疫增強(qiáng)肽包括天然的免疫增強(qiáng)肽，和非天然序列、非天然結(jié)構(gòu)的免疫增強(qiáng)肽。所述免疫增強(qiáng)肽選自胸腺肽α1、胸腺五肽、促吞噬肽、囊素、cn101838305a所述t2多肽合成產(chǎn)物、cn101838306a所述k4多肽合成產(chǎn)物、cn106349334a所述多肽化合物等；所述t2多肽合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通式為(xa-xb-xc-xd-x1)2＞k-x2，xa和xc分別選自絲氨酸(ser，s)、蘇氨酸(thr，t)、半胱氨酸(cys，c)、脯氨酸(pro，p)、谷氨酰胺(asn，n)和天門冬酰胺(gln，q)中的一種，xb和xd分別選自組氨酸(his，h)、賴氨酸(lys，k)和精氨酸(arg，r)中的一種，k代表賴氨酸(lys)，x1和x2分別代表由0-10個(gè)任意氨基酸組成的氨基酸序列；優(yōu)選的，所述t2多肽合成產(chǎn)物為(tkpr)2＞k；所述k4多肽合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通式為：(xa-xb-xc-xd-x1)4＞(k-x2)2＞k-x3，xa為絲氨酸(ser，s)、蘇氨酸(thr，t)、半胱氨酸(cys，c)、脯氨酸(pro，p)、谷氨酰胺(asn，n)或天門冬酰胺(gln，q)，xb和xd分別選自組氨酸(his，h)、賴氨酸(lys，k)和精氨酸(arg，r)中的一種，xc為甘氨酸(gly，g)、丙氨酸(ala，a)、纈氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)、異亮氨酸(ile，i)或蛋氨酸(met，m)，k代表賴氨酸(lys)，x1、x2和x3分別代表由0-5個(gè)任意氨基酸組成的氨基酸序列；優(yōu)選的，所述k4多肽合成產(chǎn)物為(tklk)4＞k2＞k-g；所述多肽化合物的結(jié)構(gòu)式為：(xaxbxcxdxexfxg-x)2ky，或{(xaxbxcxdxexfxg-x)2k}2ky，或{({xaxbxcxdxexfxg-x}2k)2k}2ky，xa、xb、xd、xe和xg分別選自丙氨酸(ala,a)、纈氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)、異亮氨酸(ile，i)、蛋氨酸(met，m)、半胱氨酸(cys，c)、精氨酸(arg，r)、賴氨酸(lys，k)、甘氨酸(gly，g)、絲氨酸(ser，s)、蘇氨酸(thr，t)、天冬氨酸(asp,d)、天冬酰胺(asn，n)、谷氨酸(glu,e)或谷氨酰胺(gln，q)，xc和xf分別選自丙氨酸(ala,a)、纈氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)、異亮氨酸(ile，i)、蛋氨酸(met，m)、半胱氨酸(cys，c)、精氨酸(arg，r)、賴氨酸(lys，k)、甘氨酸(gly，g)、絲氨酸(ser，s)、蘇氨酸(thr，t)、天冬氨酸(asp,d)、天冬酰胺(asn，n)、谷氨酸(glu,e)、谷氨酰胺(gln，q)、色氨酸(trp,w)、組氨酸(his,h)或脯氨酸(pro,p)，k為賴氨酸(lys,k)，x或y為空、任意一個(gè)氨基酸、多個(gè)氨基酸組成的肽片段、或能將氨基酸或肽片段連接起來的化學(xué)基團(tuán)。所述增強(qiáng)免疫功能藥物的劑型為液體劑型，如滴眼液、滴鼻液、液體噴霧劑、軟膠囊等；或所述增強(qiáng)免疫功能藥物的劑型為固體劑型，如粉霧劑、片劑、泡騰片、膠囊、膏劑、劑型、滴丸等。所述增強(qiáng)免疫功能藥物還包括促滲劑、促溶劑、穩(wěn)定劑、等滲維持劑、支撐劑等。所述粘膜給藥的方式為眼部粘膜給藥、呼吸道粘膜給藥、消化道粘膜給藥、陰道粘膜給藥、尿道粘膜給藥、肛門直腸粘膜給藥、動(dòng)物泄殖腔粘膜給藥等，優(yōu)選眼部粘膜給藥、呼吸道粘膜給藥(優(yōu)選鼻咽腔給藥)、消化道粘膜給藥(優(yōu)選腸粘膜給藥，即口服)。所述免疫增強(qiáng)肽作為藥物的主要成份，其給藥劑量范圍：哺乳動(dòng)物口服：0.1mg/kg體重-1mg/kg體重，哺乳動(dòng)物外用：1μg/日/次-100μg/日/次，禽類口服：1μg/kg體重-100μg/kg體重。本發(fā)明提供的免疫增強(qiáng)肽采用非損傷性給藥方式，通過粘膜給藥的方式(包括口服、噴鼻、點(diǎn)眼等粘膜給藥方式)激發(fā)或提升機(jī)體的免疫功能，達(dá)到對(duì)疾病的預(yù)防及治療的目的。該粘膜給藥增強(qiáng)免疫功能藥物是以免疫增強(qiáng)肽為核心的有效成份，或與其它物質(zhì)組合形成協(xié)同效應(yīng)的復(fù)合型制劑，也可與粘膜通透劑、促滲劑、吸收促進(jìn)劑配伍幫助免疫增強(qiáng)肽更好地被吸收利用，提高藥效；還可與穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑、藥物支撐劑、保護(hù)劑配伍形成穩(wěn)定的藥物劑型。本發(fā)明提供的免疫增強(qiáng)肽作為藥物核心成份，通過機(jī)體粘膜部位(如眼部粘膜、呼吸道粘膜、消化道粘膜、陰道粘膜、尿道粘膜、肛門直腸粘膜、動(dòng)物泄殖腔粘膜等)激發(fā)和提升機(jī)體的免疫功能，通過粘膜給藥的途徑用于治療和預(yù)防與免疫相關(guān)的疾病，如細(xì)菌感染引發(fā)的眼結(jié)膜炎、鼻炎、咽炎、氣管炎、陰道炎、腸炎等。免疫增強(qiáng)肽與疫苗混合通過滴眼、噴霧吸入鼻咽腔等呼吸道、口服進(jìn)入消化道粘膜的方式使免疫增強(qiáng)肽(及疫苗)與機(jī)體粘膜接觸，起到有效預(yù)防傳染病的作用。具體實(shí)施方式1963年美國洛克菲勒大學(xué)生物化學(xué)教授r.brucemerrifield開創(chuàng)性地發(fā)明了便利省時(shí)高效的多肽固相合成技術(shù)，使得人工合成多肽分子易于實(shí)施，為開展多肽研究及開發(fā)多肽藥物提供了便利及可能。本發(fā)明提到的免疫增強(qiáng)肽可通過多肽固相合成技術(shù)制備，將它們用于臨床及畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)膊∵M(jìn)行預(yù)防及治療。本發(fā)明提到的免疫增強(qiáng)肽的固相合成機(jī)理，如下：1963年美國科學(xué)家r.b.merrifield發(fā)明創(chuàng)立了將目的肽的氨基酸的羧基端(c端)固定在不溶性樹脂上，樹脂上結(jié)合的氨基酸的氨基端(n端)與有待連接的氨基酸的羧基端進(jìn)行縮合反應(yīng)達(dá)到延長(zhǎng)肽鏈的固相合成法。也就是從多肽的羧基端(c端)開始逐個(gè)氨基酸縮合并向多肽段的氨基端(n端)方向不斷延伸。因此，在進(jìn)行氨基酸的縮合反應(yīng)時(shí)，要將有待連接的氨基酸上的氨基及側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)起來避免發(fā)生反應(yīng)。目前常用的有叔丁氧羰基(boc)保護(hù)法和芴甲氧羰基(fmoc)保護(hù)法，因此每連接上一個(gè)氨基酸就要經(jīng)歷一次脫保護(hù)的過程(即固相載體上的氨基先脫保護(hù)，再同過量的有待連接的下一個(gè)目標(biāo)氨基酸的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)以延長(zhǎng)肽鏈)。通過這樣的步驟反復(fù)多次地進(jìn)行下去，即：縮合、洗滌、脫保護(hù)、中和、洗滌，再進(jìn)入下一輪縮合(接上一個(gè)目標(biāo)氨基酸)、洗滌、脫保護(hù)、中和、洗滌，直至達(dá)到所需要合成的目標(biāo)肽鏈長(zhǎng)度。合成完成后采用tfa法將目的多肽從樹脂上裂解下來，得到目的肽的粗品。目的肽的粗品還要經(jīng)過純化，純化過程依次為：粗肽、溶解、脫鹽、純化、凍干、純品。采用色譜柱型號(hào)daisoc18(10μm,50x250mm)，色譜操作流動(dòng)相a為(按體積百分含量，含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動(dòng)相b為乙腈與水的體積比為9:1的乙腈水溶液，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米。收集流出峰溶液，獲得目的肽純品溶液。收集到的目的肽純品溶液經(jīng)過冷凍干燥呈白色絮狀固體，即目的肽純品，其純度可達(dá)99％以上。目的肽純品經(jīng)密封包裝后放入冰箱保存待用。本發(fā)明提到的免疫增強(qiáng)肽特指具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的肽類化合物，包括天然來源的免疫增強(qiáng)肽、經(jīng)過人為技術(shù)改造而成的非天然結(jié)構(gòu)及序列的免疫增強(qiáng)肽及其幾何異構(gòu)體、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化合物，或經(jīng)過附加化學(xué)修飾或包裹的免疫增強(qiáng)肽；在作為主要藥效成分制備藥物時(shí)還包括可藥用載體、賦形劑或藥用輔料，也可以是以免疫增強(qiáng)肽為核心有效成份與其它物質(zhì)組合構(gòu)成協(xié)同效應(yīng)形成的復(fù)合型制劑。免疫增強(qiáng)肽具體的，包含臨床應(yīng)用的胸腺肽α1、胸腺五肽，還包括有過報(bào)道的囊素bursin、促吞噬肽tuftsin，以及其它具有增強(qiáng)免疫活性的各種肽類物質(zhì)。人體或動(dòng)物體與外界接觸或相通的粘膜部位主要有鼻咽腔粘膜、眼睛粘膜、腸粘膜、雌性哺乳動(dòng)物陰道粘膜、肛門直腸粘膜、動(dòng)物泄殖腔。其中，鼻咽腔粘膜由于其生理特點(diǎn)成為最易于實(shí)施粘膜給藥的部位。鼻咽腔粘膜是機(jī)體呼吸道的首要門戶，也是機(jī)體粘膜最廣泛、最先接觸外界的氣息及外源微生物(包含致病微生物病原體)、顆粒、粉塵的部位。因此鼻咽腔粘膜被認(rèn)為是人體通過呼吸道阻止病原體入侵機(jī)體的第一道重要防線或屏障。哺乳類動(dòng)物(包括人類)、鳥類的鼻咽部有豐富的血流供應(yīng)并分布有大量的免疫細(xì)胞。哺乳類動(dòng)物包括人的鼻咽腔內(nèi)有鼻咽扁桃體、雙側(cè)腭扁桃體、雙側(cè)舌扁桃體、雙側(cè)咽淋巴環(huán)及雙側(cè)咽峽管。鼻咽腔粘膜附著有t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、nk細(xì)胞、多形核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等豐富的免疫細(xì)胞。將免疫增強(qiáng)肽通過滴鼻、噴霧等諸多方式使其分布至鼻咽腔，與鼻咽腔粘膜接觸并被吸收后，與分布在鼻咽腔黏膜的免疫細(xì)胞相互作用，可有效提升機(jī)體免疫機(jī)能，從而達(dá)到對(duì)人、家畜、家禽的防病治病的目的。本發(fā)明旨在將通常免疫增強(qiáng)肽的注射給藥方式轉(zhuǎn)變成行之有效的非創(chuàng)傷性粘膜給藥的方式，從而拓展受藥群體的易于接納程度和提高給藥的安全舒適度。本發(fā)明通過以下實(shí)驗(yàn)例闡述采用口服、點(diǎn)眼、滴鼻的粘膜給藥途徑給予受試動(dòng)物免疫增強(qiáng)肽，表明通過粘膜給藥的方式同樣具有提升免疫功能的作用，在臨床及畜牧業(yè)生產(chǎn)上對(duì)防病治病具有實(shí)施便捷、效率高、效果好、接受程度高的重大實(shí)際意義。實(shí)驗(yàn)例一：不同給藥方式對(duì)受試動(dòng)物免疫應(yīng)答能力的影響引起雞流行性疾病的新城疫病毒(newcastlediseasevirus,ndv)能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，根據(jù)此原理若先用特異性抗體與病毒作用，然后再加入紅細(xì)胞則可抑制紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這一試驗(yàn)被稱為“血凝抑制試驗(yàn)”(hemagglutinationinhibitiontest,hi),檢測(cè)所用的抗血清稀釋的最高倍數(shù)定義為抗體的滴度。經(jīng)過ndv疫苗免疫的雞血清內(nèi)的抗體滴度越高，說明雞體內(nèi)對(duì)ndv的免疫應(yīng)答效果越好，免疫防御效果越好。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模翰捎米⑸?、點(diǎn)眼、滴鼻、口服的方式比較免疫增強(qiáng)肽的作用效果。實(shí)驗(yàn)方法：1、選取7日齡無特定病原(specificpathogenfree)雛雞(以下簡(jiǎn)稱為spf雛雞)48只，飼養(yǎng)在隔離器內(nèi)。2、以8只為一組將spf雛雞分為空白對(duì)照組、疫苗組、皮下注射組、點(diǎn)眼組、滴鼻組、口服組，一共六組。3、將雞新城疫凍干弱毒疫苗(nd-lasota)(購自成都天邦生物制品有限公司，以下簡(jiǎn)稱為疫苗)稀釋至1羽份/0.2ml后，使1羽份/0.2ml的疫苗內(nèi)含10μg免疫增強(qiáng)肽(即cn101838305a中公開的t2多肽合成產(chǎn)物、cn101838306a中公開的k4多肽合成產(chǎn)物、cn106349334a中公開的多肽化合物)，然后分別對(duì)皮下注射組、點(diǎn)眼組、滴鼻組、口服組的spf雛雞進(jìn)行免疫。4、在免疫后的第7天和第14天分別從各組spf雞翅下靜脈采血1ml，血漿置于eppendrof試管中，室溫靜置2小時(shí)，移至4℃冰箱中靜置至少1小時(shí)以上。經(jīng)過4℃1000rpm離心10分鐘，取上層的血清部分作為樣本進(jìn)行血凝抑制(hi)抗體效價(jià)的檢測(cè)。血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)雞新城疫抗體效價(jià)方法參考《新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)操作規(guī)程》sn/t1109-2002，以cn101838305a中公開的t2多肽合成產(chǎn)物(tkpr)2k(mw：1111.34，純度>98％)為例,檢測(cè)結(jié)果見表1。表1spf雛雞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別給藥劑量第7天抗體效價(jià)平均值第14天抗體效價(jià)平均值皮下注射組疫苗+10μg免疫增強(qiáng)肽3.5(log2)6.3(log2)點(diǎn)眼組疫苗+10μg免疫增強(qiáng)肽5.7(log2)7.8(log2)滴鼻組疫苗+10μg免疫增強(qiáng)肽5.4(log2)7.5(log2)口服組疫苗+10μg免疫增強(qiáng)肽5.1(log2)7.3(log2)免疫對(duì)照組注射疫苗2.5(log2)5.3(log2)空白對(duì)照組無0(log2)0(log2)表1的結(jié)果顯示，在給予相同劑量的樣品肽條件下，最佳給藥免疫的方式為：點(diǎn)眼>滴鼻>口服>注射，說明點(diǎn)眼、滴鼻、口服等非創(chuàng)傷性給藥免疫方式能夠有效地刺激和提升機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答，粘膜部位是免疫增強(qiáng)肽所用的有效場(chǎng)所。其它免疫增強(qiáng)肽也有類似效果，在此不一一贅述。實(shí)驗(yàn)例二：口服給藥方式對(duì)受試動(dòng)物免疫應(yīng)答能力的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測(cè)免疫增強(qiáng)肽的口服給藥效果。實(shí)驗(yàn)方法：1、選取6周齡spf雞60只，飼養(yǎng)在隔離器內(nèi)。2、以10只為一組將spf雞分為空白對(duì)照組、免疫組、皮下注射低濃度組、皮下注射高濃度組、口服低濃度組、口服高濃度組，一共六組。3、將雞新城疫凍干弱毒疫苗(nd-lasota)(購自成都天邦生物制品有限公司，以下簡(jiǎn)稱為疫苗)稀釋至1羽份/0.2ml后，加入免疫增強(qiáng)肽(即cn101838305a中公開的t2多肽合成產(chǎn)物、cn101838306a中公開的k4多肽合成產(chǎn)物、cn106349334a中公開的多肽化合物)分別使1羽份/0.2ml的疫苗內(nèi)含10μg樣品肽,或1μg樣品肽(即高濃度組和低濃度組)，然后分別對(duì)免疫組、皮下注射低濃度組、皮下注射高濃度組、口服低濃度組和口服高濃度組的spf雞進(jìn)行免疫，給藥方式見表2；4、在免疫后的第21天對(duì)各組spf雞翅下靜脈采血1ml，按實(shí)驗(yàn)例1中所提及的方法，檢測(cè)新城疫抗體水平，以cn101838306a中公開的k4多肽合成產(chǎn)物〔(tklk)2k〕2kg(mw：2324.2，純度>98％)為例,檢測(cè)結(jié)果見表2。表2spf雞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別肽劑量血清抗體平均值(log2)空白對(duì)照組無0疫苗免疫組疫苗7.7皮下注射低濃度組疫苗+1μg/只8.8皮下注射高濃度組疫苗+10μg/只9.1口服低濃度組疫苗+1μg/只9.0口服高濃度組疫苗+10μg/只9.3表2結(jié)果顯示，隨著給藥劑量從1μg/只增加到10μg/只，受試雞體內(nèi)識(shí)別新城疫病毒的抗體滴度隨之提高。對(duì)于新城疫凍干弱毒疫苗的最佳免疫部位首選是粘膜區(qū)域，口服免疫方式比注射具有更好的免疫提升作用。本實(shí)驗(yàn)表明通過口服免疫增強(qiáng)肽能夠有效地刺激和提升機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)。其它免疫增強(qiáng)肽也有類似效果，在此不一一贅述。實(shí)驗(yàn)例三：口服免疫增強(qiáng)肽劑量對(duì)受試動(dòng)物細(xì)胞免疫能力的影響實(shí)驗(yàn)原理：機(jī)體各組織器官及外周血中分布著許多t淋巴細(xì)胞，通過組織液、淋巴液、血液為載體在體內(nèi)循環(huán)，發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，分泌細(xì)胞因子、免疫應(yīng)答清除病源微生物。因此血液中t淋巴細(xì)胞的數(shù)量在一定程度上與機(jī)體免疫功能呈正相關(guān)，所以檢測(cè)淋巴細(xì)胞中t淋巴細(xì)胞的比值是迅速判定免疫功能發(fā)揮程度的簡(jiǎn)便易行的操作方式。1975年mueller發(fā)現(xiàn)酸性α-醋酸萘酯酶(acidα-naphthylacetateesterase,簡(jiǎn)稱anae)能特異性地標(biāo)記小鼠t淋巴細(xì)胞，由于t淋巴細(xì)胞的胞漿中的酯酶能水解α-醋酸萘酯，產(chǎn)生α-醋酸萘酚與重氮付品紅歐聯(lián)生成棕紅色的顆粒。根據(jù)這一特點(diǎn)在普通顯微鏡下可觀察并計(jì)算出t淋巴細(xì)胞的數(shù)量。采用anae方法計(jì)數(shù)t淋巴細(xì)胞操作簡(jiǎn)便、快速、無需特殊設(shè)備，因此在臨床和畜牧獸醫(yī)得到廣泛的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)方法：1、選取剛出生1日齡的spf雛雞32只，飼養(yǎng)在隔離器內(nèi)；2、將spf雛雞分為空白對(duì)照組、給藥a組、給藥b組、給藥c組，共四組(8只/組)，每日口服給予各組雛雞免疫增強(qiáng)肽(即cn101838305a中公開的t2多肽合成產(chǎn)物、cn101838306a中公開的k4多肽合成產(chǎn)物、cn106349334a中公開的多肽化合物)一次，連續(xù)給藥2周(14天)，給藥劑量見表3；表3各組spf雛雞的每日給藥劑量給藥a組給藥b組給藥c組空白對(duì)照組免疫增強(qiáng)肽劑量/次/日10μg50μg100μg無3、分別在給藥第7天，第14天和停止給藥后第7天對(duì)各組spf雛雞翅下靜脈采血，用全血涂片。采用anae法檢測(cè)各組spf雛雞的t淋巴細(xì)胞數(shù)量，將涂片置于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞中胞質(zhì)具有紅褐色顆粒的t淋巴細(xì)胞的比值。實(shí)驗(yàn)方法參考張凌志、李福生、薛文志、韓維廉“應(yīng)用酯酶標(biāo)記染色法檢查雞血液t淋巴細(xì)胞”《家畜傳染病》1985(1)：37-39，以cn106349334a中公開的多肽化合物(trprkeg)2kg(mw:1853.1,純度>98％)為例,結(jié)果見表4-表6。表4給藥第7天各組spf雛雞血中t淋巴細(xì)胞所占比例表4結(jié)果顯示，給藥第7天給藥c組t淋巴細(xì)胞比例最高，與其它組相比差異極其顯著(p≤0.01)，給藥a組與給藥b組的t淋巴細(xì)胞比例略高于空白對(duì)照組(p>0.05)表5給藥第14天各組spf雛雞血中t淋巴細(xì)胞所占比例樣本給藥a組給藥b組給藥c組空白對(duì)照組145％52％70％26％232％42％58％35％343％37％65％37％427％49％67％39％532％51％54％32％629％38％72％27％746％40％57％30％842％35％69％38％平均值37％43％64％33％表5結(jié)果顯示，給藥第14天給藥c組t淋巴細(xì)胞比例最高，與給藥a組、空白對(duì)照組相比差異極顯著(p≤0.01)，與給藥b組相比差異顯著(p≤0.05)。表6停止給藥第7天各組spf雛雞血中t淋巴細(xì)胞所占比例樣本給藥c組空白對(duì)照組154％28％245％34％336％28％446％32％547％34％638％41％740％29％846％30％平均值44％32％表6結(jié)果顯示，停止給藥7天后給藥c組的t淋巴細(xì)胞與空白對(duì)照組相比差異依然顯著(p≤0.05)，表明受試動(dòng)物口服免疫增強(qiáng)肽對(duì)免疫系統(tǒng)的t淋巴細(xì)胞數(shù)比值的提升有顯著影響。其它免疫增強(qiáng)肽也有類似效果，在此不一一贅述。綜上，將免疫增強(qiáng)肽凍干粉經(jīng)注射用水(或生理鹽水、磷酸緩沖液)溶解后給予受試動(dòng)物，或與疫苗混合同時(shí)進(jìn)行免疫接種后，結(jié)果顯示免疫增強(qiáng)肽與疫苗聯(lián)用，采取滴鼻、點(diǎn)眼、口服處理的動(dòng)物體內(nèi)的抗體滴度明顯高于未經(jīng)處理的動(dòng)物。該結(jié)果說明通過受試動(dòng)物的粘膜給藥，可以有效提升機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而提高受試動(dòng)物的抗病生存能力。將免疫增強(qiáng)肽給予動(dòng)物口服，能有效提升t淋巴細(xì)胞的比值，表明免疫增強(qiáng)肽具有提升免疫功能的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。由于各種炎癥，包括眼結(jié)膜炎、咽炎、鼻(竇)炎、腸炎、陰道炎等諸多炎癥都與細(xì)菌或病毒的侵染有關(guān)，提升機(jī)體自身的免疫抵抗能力就是強(qiáng)化了抵抗細(xì)菌病毒的能力，就是提升了機(jī)體恢復(fù)重健的能力。從以上結(jié)果可知：免疫增強(qiáng)肽可以通過粘膜部位顯著提升體內(nèi)特異抗體的滴度，有效提升t淋巴細(xì)胞比值，證明通過粘膜途徑免疫增強(qiáng)肽可有效提高機(jī)體的免疫抗病能力，抵抗細(xì)菌病毒的侵襲，從而表明免疫增強(qiáng)肽通過粘膜途徑可以改善機(jī)體的免疫功能低下。本發(fā)明的免疫增強(qiáng)肽可以在禽類動(dòng)物的眼部粘膜、鼻咽腔粘膜，腸粘膜發(fā)揮作用，推廣到人藥的臨床應(yīng)用，考慮到腸粘膜給藥(即口服)需要經(jīng)過胃中胃酸及酶的消化，可以采用腸溶型膠囊或用腸溶型包衣包裹藥物制劑，使得免疫增強(qiáng)肽在抵達(dá)腸道后釋放出來被小腸絨毛吸收，直接與腸道免疫細(xì)胞相互作用達(dá)到提升免疫功能的效果。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12