屬于GH3家族的耐熱性β-木糖苷酶的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種耐熱性β-木糖苷酶、編碼上述耐熱性β-木糖苷酶的多核苷酸、 用于表達上述耐熱性β-木糖苷酶的表達載體、整合了上述表達載體的轉(zhuǎn)化體、以及使用 上述耐熱性β-木糖苷酶的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法。
[0002] 本申請要求基于2014年9月17日在日本申請的特愿第2014-189007號的優(yōu)先權(quán)， 并在本文中引用其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003] 除了對運輸用能源供應的擔憂之外，由于全球變暖和大氣污染等環(huán)境上的問題， 近年來，石油替代能源的開發(fā)成為非常重要的課題。植物生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生 能源，作為石油替代資源而備受期待。作為植物生物質(zhì)的主要成分的木質(zhì)纖維素為纖維素、 半纖維素（包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖）等多糖類，以及木質(zhì)素。這些多糖類被各 種糖苷水解酶水解為葡萄糖或木糖等單糖后，用作生物燃料或化學品原料。
[0004] 具有復雜結(jié)構(gòu)的木質(zhì)纖維素是難分解性的，難以用單一的酶分解或糖化 (hydrolysis)。因此，對于多糖類中的纖維素的水解，通常需要糖苷水解酶中的內(nèi)切葡聚糖 酶（內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶，EC3. 2. 1. 4)、外切型纖維二糖水解酶（1，4-β-纖維二糖糖 苷酶（cellobiosidase)或纖維二糖水解酶，EC3. 2. 1. 91、EC3. 2. 1. 176)、β-葡糖苷酶 (EC3. 2. 1. 21)這三種酶。另一方面，半纖維素的構(gòu)成因植物的種類而異，例如，在闊葉樹和 草本植物中，木聚糖構(gòu)成了主要成分。對于木聚糖的水解，需要木聚糖酶（內(nèi)切-1，4-β-木 聚糖酶，EC3. 2. 1. 8)、β-木糖苷酶（EC3. 2. 1. 37)。β-木糖苷酶對通過木聚糖酶水解半纖 維素生成的低聚糖進行水解，是涉及單糖生成工藝的水解酶之一。
[0005] 在以往的以木質(zhì)纖維素為資源的生物乙醇的制備中，以乙醇的高能效轉(zhuǎn)化為目 的，嘗試了基于高固液比（30~60%的固液比）的糖化處理（hydrolysisprocess)。這種 基于高固液比的木質(zhì)纖維素的酶糖化，生物質(zhì)糖化液的粘性高，難以進行木質(zhì)纖維素的水 解反應。因此，通過使用耐熱性酶在例如80°C以上的高溫下進行酶解糖化處理，除了加快水 解反應速度之外，降低了生物質(zhì)糖化液的粘性，從而有望實現(xiàn)縮短糖化反應時間并降低酶 量。因此，對于各種糖苷水解酶，期望開發(fā)耐熱性更優(yōu)異的酶。
[0006] 大多數(shù)耐熱性糖苷水解酶可以通過如下方式獲得：對生存于高溫環(huán)境下的嗜熱性 微生物進行分離鑒定，從這些分離培養(yǎng)的微生物中克隆基因，確定DNA序列后，利用大腸桿 菌或絲狀真菌等表達而獲得。例如，專利文獻1公開了來源于絲狀真菌的β-木糖苷酶，專 利文獻2公開了在30°C表現(xiàn)出酶活性的、來源于絲狀真菌米曲霉（Aspergillusoryzae)的 β-木糖苷酶。專利文獻3中公開了在pH5. 5以下、50°C以上表現(xiàn)出酶活性的、來源于酸熱 脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillusacidocaldarius)的β-木糖苷酶。專利文獻4公開 了在45°C表現(xiàn)出酶活性的、來源于解纖維頂孢霉（Acremoniumcellulolyticus)的β-木 糖苷酶。另外，非專利文獻1~6報道了最適溫度為60°C左右的、分離自特定細菌或絲狀真 菌的β-木糖苷酶。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0008] 專利文獻
[0009] 專利文獻1 :特表平第11-507837號公報
[0010] 專利文獻2 :特開平第11-313683號公報
[0011] 專利文獻3 :特表第2011-523346號公報
[0012] 專利文獻4 :特開第2013-59272號公報
[0013] 非專利文獻
[0014] 非專利文獻 1:Kormelink等，《JournalofBiotechnology(生物技術(shù)雜志）》， 1993 年，第 27 卷，第 249-265 頁。
[0015] 非專利文獻 2:Herrmann等，《BiochemicalJournal(生化雜志）》，1997 年，第 321 卷，第375-381頁。
[0016] 非專利文獻 3:kitamoto等，《AppliedandEnvironmentalMicrobiology(應用 與環(huán)境微生物學）》，1999年，第65卷，第20-24頁。
[0017]非專利文獻 4:LaGrange等，《AppliedandEnvironmentalMicrobiology(應用 與環(huán)境微生物學）》，2001年，第67卷，第5512-5519頁。
[0018] 非專利文獻 5:Shao等，《AppliedandEnvironmentalMicrobiology(應用與環(huán) 境微生物學）》，2011年，第77卷，第719-726頁。
[0019] 非專利文獻 6:Morais等，《JournalofBiologicalChemistry(生物化學雜 志）》，2012年，第287卷，第9213-9221頁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0021] 本發(fā)明的目的是提供一種至少在80°C且pH4.0的條件下表現(xiàn)出以對硝基苯 基-β-D-吡喃木糖苷（下文有時縮寫為PNPX)為底物的水解活性的新耐熱性β-木糖苷 酶、編碼上述耐熱性β-木糖苷酶的多核苷酸、用于表達上述耐熱性β-木糖苷酶的表達載 體、整合了上述表達載體的轉(zhuǎn)化體、以及使用上述耐熱性β-木糖苷酶制備木質(zhì)纖維素分 解產(chǎn)物的方法。
[0022] 解決技術(shù)問題的技術(shù)手段
[0023] 本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題，通過從溫泉高溫土壤中直接提取DNA來進行 難培養(yǎng)微生物群的大規(guī)模宏基因組測序，成功獲取具有新的氨基酸序列的耐熱性β-木糖 苷酶，從而完成本發(fā)明。
[0024] S卩，作為本發(fā)明的耐熱性木糖苷酶、多核苷酸、表達載體、轉(zhuǎn)化體、耐熱性 β-木糖苷酶的制備方法、糖苷水解酶混合物、以及木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法，可以 列舉下列[1]~[10]。
[0025] [1] -種耐熱性β_木糖苷酶，其具有由下列⑷、⑶或（C)構(gòu)成的β_木糖苷 酶催化區(qū)域：
[0026] (Α)由序列號1、3或5所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽；
[0027] (Β)由序列號1、3或5所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添加而 形成的氨基酸序列所構(gòu)成、并且至少在80°C且ρΗ4. 0的條件下具有以對硝基苯基-β-D-吡 喃木糖苷為底物的水解活性的多肽；
[0028] (C)由與序列號1、3或5所示氨基酸序列具有80%以上序列一致性的氨基酸序列 所構(gòu)成、并且至少在80°C且pH4. 0的條件下具有以對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷為底物的 水解活性的多肽。
[0029] [2]上述[1]的耐熱性β-木糖苷酶，其進一步具有β-葡糖苷酶活性。
[0030] [3] -種多核苷酸，其具有由下列（a)~（e)的堿基序列構(gòu)成的編碼β-木糖苷酶 催化區(qū)域的區(qū)域：
[0031] (a)編碼由序列號1、3或5所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽的堿基序列；
[0032] (b)編碼由序列號1、3或5所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或 添加而形成的氨基酸序列所構(gòu)成的、并且至少在80°C且pH4. 0的條件下具有以對硝基苯 基-β-D-吡喃木糖苷為底物的水解活性的多肽的堿基序列；
[0033] (c)編碼由與序列號1、3或5所示氨基酸序列具有80%以上序列一致性的氨基酸 序列構(gòu)成的、并且至少在80°C且ρΗ4. 0的條件下具有以對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷為底 物的水解活性的多肽的堿基序列；
[0034] (d)與序列號2、4或6所示堿基序列具有80%以上序列一致性、并且編碼至少在 80°C且pH4. 0的條件下具有以對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷為底物的水解活性的多肽的 喊基序列；
[0035] (e)與由序列號2、4或6所示堿基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴格條件下進行雜交的 多核苷酸的堿基序列、且編碼至少在80°C且pH4. 0的條件下具有以對硝基苯基-β-D-吡喃 木糖苷為底物的水解活性的多肽的堿基序列。
[0036] [4]上述[3]的多核苷酸，上述多肽進一步具有β-葡糖苷酶活性。
[0037] [5] -種表達載體，其整合了上述[3]或[4]的多核苷酸，在宿主細胞中可表達具 有β-木糖苷酶活性的多肽。
[0038] [6] -種轉(zhuǎn)化體，其導入有上述[5]的表達載體。
[0039] [7]上述[6]的轉(zhuǎn)化體，其為真核微生物。
[0040] [8]上述耐熱性β-木糖苷酶的制備方法，其包括在上述[6]或[7]的轉(zhuǎn)化體中生 產(chǎn)上述耐熱性β-木糖苷酶。
[0041] [9] -種糖苷水解酶混合物，其包含上述[1]或[2]的耐熱性β-木糖苷酶、上述 [3]或[4]的多核苷酸編碼的耐熱性β-木糖苷酶、或者利用上述[8]的耐熱性β-木糖苷 酶的制備方法制得的耐熱性β-木糖苷酶、以及至少一種其他糖苷水解酶。
[0042] [10] -種木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法，其包括使含有纖維素、半纖維素及木 質(zhì)素的木質(zhì)纖維素所形成的材料與上述[1]或[2]的耐熱性木糖苷酶、上述[3]或[4] 的多核苷酸編碼的耐熱性β-木糖苷酶、上述[6]或上述[7]中記載的轉(zhuǎn)化體、利用上述
[8]的耐熱性β-木糖苷酶的制備方法制得的耐熱性β-木糖苷酶、或者上述[9]的糖苷水 解酶混合物接觸，由此生產(chǎn)木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物。
[0043] 發(fā)明效果
[0044] 本發(fā)明的耐熱性β-木糖苷酶至少在80°C且ρΗ4.0的條件下具有以對硝基苯 基-β-D-吡喃木糖苷（下文有時縮寫為PNPX)為底物的水解活性。因此，上述耐熱性β-木 糖苷酶適合于高溫條件下的、由木質(zhì)纖維素所形成的材料、例如由含有半纖維素或纖維素 的木質(zhì)纖維素所形成的材料的糖化處理（hydrolysisprocess)。
[0045] 此外，作為另一方面，上述耐熱性木糖苷酶適合于高溫條件下的、包含具有 β-木糖苷鍵的化合物、優(yōu)選包含具有β-木糖苷鍵的低聚糖的材料的糖化處理。
[0046] 此外，作為又一方面，上述耐熱性β-木糖苷酶適合于高溫條件下的、包含具有 β-糖苷鍵的化合物、優(yōu)選包含具有β-糖苷鍵的低聚糖的材料的糖化處理。
[0047] 此外，本發(fā)明的多核苷酸、整合了上述多核苷酸的表達載體、導入有上述表達載體 的轉(zhuǎn)化體適合用于制備本發(fā)明的耐熱性β-木糖苷酶。
【附圖說明】
[0048] 圖1為β_木糖苷酶基因克隆AR19M-311-2的氨基酸序列（序列號1)與屬于嗜 熱網(wǎng)球菌（Dictyoglomusthermophilum)的GH3家族的β-木糖苷酶（序列號10)的氨基 酸序列比對圖。
[0049]圖2為開放閱讀框AR19M-311的氨基酸序列（序列號1)、AR19M-311-2蛋白的氨 基酸（序列號3)和AR19M-311-11蛋白的氨基酸序列（序列號5)的氨基酸序列比對圖。
[0050] 圖3Α為表示實施例1中的AR19M-311-2基因在大腸桿菌中表達得到的 AR19M-311-2蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果的圖。
[0051] 圖3Β為表示實施例1中的AR19M-311-11基因在大腸桿菌中表達得到的 AR19M-311-11蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果的圖。
[0052] 圖4為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-311-2蛋白對各底物的水解活 性的測定結(jié)果的圖。
[0053] 圖5為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-311-2蛋白在各溫度下的ΡΝΡΧ 水解活性（ΡΗ4.0)的測算結(jié)果的圖。
[0054] 圖6為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-311-2蛋白在各pH的ΡΝΡΧ水 解活性（70°C)的測算結(jié)果的圖。
[0055] 圖7A為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-311-2蛋白示出的、伴隨熱變 性而引發(fā)的SYPR0Orange(寶石橙蛋白染色試劑）的熒光強度變化實測值的圖。
[0056] 圖7B為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-311-2蛋白示出的、伴隨熱變 性而引發(fā)的SYPR0Orange的焚光強度變化的一級微分"_d(Fluorescence)/dt"的圖。
【具體實施