一種新型耐熱雙功能糖苷水解酶MtCel2及其編碼序列和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物工程，具體地說是一種以嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila的DUF4360超家族基因MtCel2表達的耐熱雙功能糖苷水解酶MtCel2及其編碼 序列和應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 糖苷水解酶(英語:Glycoside hydrolases，又稱糖苷酶)是一種專門水解配糖鍵 (glycosidic bond)，并產(chǎn)生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這 類蛋白質(zhì)在人類的產(chǎn)業(yè)上也有所應(yīng)用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質(zhì)能降解成可 用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。
[0003] 嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。 該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中50°C條件下可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶和糖苷 水解酶。
[0004] 嗜熱毀絲菌產(chǎn)生的耐熱糖苷水解酶MtCel2屬于DUF4360超家族蛋白，具有很強的 纖維素酶活性和木聚糖酶活性，但之前從未發(fā)現(xiàn)DUF4360超家族具有水解活性的任何報道。 MtCe 12對羧甲基纖維素的水解活力高達31 · 6U/mg，對木聚糖的水解活力高達56 · 2U/mg。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明從嗜熱毀絲菌My cel iophthora thermophila獲得DUF4360超家族耐熱糖苷 水解酶基因的cDNA序列全長，命名為MtCel2，基因cDNA全長612bp，編碼203個氨基酸。 MtCel2具有信號肽序列（l-15aa MKALSLLTLLPLAAA)及一個N糖基化位點和5個0糖基化位 點。將MtCel2編碼的氣基酸序列在國際基因庫中進彳丁檢索，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。
[0006] 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒載體pPIC9K/MtCel2,利用電轉(zhuǎn)儀進行電擊轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115,在MD和麗培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝轉(zhuǎn) 化子，然后進行甲醇誘導(dǎo)表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-MT-Cel2。該工程菌株接種于含 BMGY培養(yǎng)基中，在28°C200rpm/min搖床培養(yǎng)6d后，糖苷水解酶的表達量為2.82mg/ml，分子 量為77 · 5KDa，對羧甲基纖維素的水解活力高達31 · 6U/mg，對木聚糖的水解活力高達56 · 2U/ mg，MtCel2在60°C下是穩(wěn)定的，處理60min后仍有85%以上的酶活性;70°C處理60min后仍保 持52 %的活性;80°C處理60min后保持31 %的活性;90°C處理60min后保持18 %。
[0007] 耐熱糖苷水解酶MtCel2對長鏈纖維素具有很強的水解能力，其對羧甲基纖維素的 水解活力高達31.6U/mg，對木聚糖的水解活力高達56.2U/mg。并且MtCel2有很好的熱穩(wěn)定 性，在70°C的處理lh條件下仍可以保持52 %的活性，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。 (四）
【附圖說明】：
[0008] 圖1耐熱糖苷水解酶MtCel2的SDS-PAGE分析
[0009] 泳道1:低分子量蛋白標準
[0010] 泳道2:純化的耐熱糖苷水解酶MtCel2
[0011] 圖2A:耐熱糖苷水解酶MtCe 12的最適溫度 [0012] B:耐熱糖苷水解酶MtCel2的熱穩(wěn)定性測定 [0013]圖3耐熱糖苷水解酶MtCel2的最適pH
[0014] 圖4A耐熱糖苷水解酶MtCel2水解羧甲基纖維素產(chǎn)物的TLC分析
[0015] 泳道1:標準寡糖(DP2-DP7)
[0016] 泳道2:水解羧甲基產(chǎn)物
[0017] B耐熱糖苷水解酶MtCel2水解木聚糖產(chǎn)物的TLC分析 [0018] 泳道1:標準寡糖(DP2-DP7)
[0019] 泳道2:水解木聚糖產(chǎn)物 (五)【具體實施方式】
[0020] 實施例1:嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila的分離鑒定
[0021] (1)標本采集:從堆肥中采集。
[0022] (2)分離培養(yǎng):將采集標本取0.5克放置在PDA平板上50°C培養(yǎng)3天后，進行分離純 化。操作步驟參考Cooney and Emerson( 1964)文獻。
[0023] (3)鑒定：參考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文獻。
[0024] 實施例2:耐熱糖苷水解酶基因MtCel2的克隆
[0025] (1)嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophi 1 a總RNA的提?。簠⒄誘riζο 1試劑盒說 明。
[0026] (2)cDNA第一條鏈的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0試 劑盒說明書進行：取1~2yg總RNA，加RNase Free ddH20至9.5yL，將RNA樣品在75°C變性 5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分： 10mmol/L dNTP Mixture 2yL，10XRT Buffer(Mg2+)2yL，25mmol/L MgCl2 4yL，01igo d (T)-Adaptor Primer lyL，RNase Inhibiter 0.5yL,AMV Reverse Transcriptase lyL (Final Volume 20yL)，將反應(yīng)液混合后，室溫下放10min，然后42°C溫育60min，再煮沸5min 以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。加入180yL DEPC處理的ddH20，稀釋至200yL，混勻，稍微離心，保存于-20 〇C，備用。
[0027] (3)PCRiS(25yL):cDNA2yL，10XBufTer2.5yL，10mmol/LdNTP2yL，25mmol/ 11%(：12 2以1^，上、下游引物各2以1^，了39〇嫩聚合酶0.5以以51]/^〇，(1冊20 12以匕反應(yīng)條件為 94°C5min 預(yù)變性;94°C40s，52°C40s，72°C lmin，共 32 個循環(huán)，72°C 延伸 10min，4°C 保存。
[0028] 上游引物：5 ' -ATGAAGGCCCTCTCG-3 '
[0029] 下游引物：5 ' -TTACTCGCACTTGCG-3 '
[0030] (4)基因克?。喝?.5μ1 PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照TAKARA公 司產(chǎn)品說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，在表面涂有氨卞青霉素（100yg/ mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[0031] (5)質(zhì)粒DNA的提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。
[0032] (6)序列測定:DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行。序列 引物為M13啟動子引物。嗜熱毀絲菌MtCel2基因cDNA全長612bp，包含起始密碼子和終止密 碼子，無內(nèi)含子，編碼203個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，尚未發(fā)現(xiàn)報 道。該序列如下：
[0033] (A)SEQ ID NO 1 的信息
[0034] (a)序列特征:*長度:612堿基對;*類型:核酸;*鏈型:雙鏈;*拓撲結(jié)構(gòu):線性
[0035] (b)分子類型：DNA
[0036] (c)假設(shè):否
[0037] ⑷反義:否
[0038] (e)最初來源：嗜熱毀絲霉Myceliophthora thermophila
[0039] (f)序列描述：
[0040] 1 ATGAAGGCCC TCTCGCTCTT GACCCTCCTC CCCCTGGCCG CGGCCGCGCC CACGAACACT '61 CTTGCGGCCC GTGGCCTCAC CGTCCCGACC GGCCCCGTGC CCGAGACGGT CCGGGTGGTG 1.21 GGCGTCTCGC TGCTGGGATC CGGCTGCCCC GCGGGCACGG CCGACGTCCA GATCGACGCC ?β.1 ACCAAGACCC TGCTCGAGGT CACTTTCTCC GAGTACATTG TCCAGACGGG ACCCGGCACC 2；41 AAGGCGGCCG ACTGGCGCAA GAACTGCAAG CTCACCCTTA ACATGGAGTT TGACGAGGGC 3:01 TTCTCATTCT CAACCCTCGC GACCGACATG AGCGGCTTCG CGCAGATCCC CGCTGGCTCC 3G AGGGGCCTGT GCACCAACAC GTTCGACTTC： ACGGGCATCA GTGGGCAGTC ATACTACTCG 421 ATCGCCCTGC CGGGCGAGCG CGAGGGCCCC TTCACGCTCA GCGCCGACCC GGACGTGGTC 481 TCGTGGTCCC CCTGCGGCGT CACCACGGCC ATCCTGAACA TGAACACGCA GTGCAACATC 54:1 TCCCC