環(huán)氧琥珀酸水解酶及其載體和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種環(huán)氧琥珀酸水解酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還設(shè)計(jì)了含有環(huán)氧琥珀酸水解酶的重組質(zhì)粒以及含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌，并公開(kāi)了大腸桿菌重組菌在超聲輔助全細(xì)胞生產(chǎn)D?酒石酸中的應(yīng)用，同時(shí)對(duì)超聲輔助大腸桿菌全細(xì)胞催化環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化為酒石酸的條件進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)更高的全細(xì)胞環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化率，節(jié)約了時(shí)間，超聲條件下的全細(xì)胞催化穩(wěn)定性也比振蕩條件下要好。
【專利說(shuō)明】
環(huán)氧琥珀酸水解酶及其載體和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及基因工程，生物催化領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種環(huán)氧琥珀酸水解酶及其載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]D-酒石酸在醫(yī)藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途。在醫(yī)藥方面，手性合成的手性源及拆分劑，用于多種產(chǎn)品的合成，如D-葡萄糖-甘油-1，5-內(nèi)酰胺、D-半乳糖-甘油-1，5-內(nèi)酰胺等;在化工方面，因?yàn)樽笮墓鈱W(xué)活性，可用作拆分劑;在食品工業(yè)方面，D-酒石酸有著比檸檬酸更強(qiáng)的酸味，因此可以用作食品酸味劑，也可以用作穩(wěn)定劑和防腐劑。具有良好的市場(chǎng)前景。
[0003]目前D-酒石酸主要以環(huán)氧琥珀酸為原料，采用生物酶法生產(chǎn)。但是不論是通過(guò)添加溶菌酶，還是凍融等方法來(lái)得到粗酶液，都會(huì)耗費(fèi)時(shí)間及金錢(qián)，無(wú)形中增加了生產(chǎn)成本。如果直接用全細(xì)胞催化會(huì)減少這一部分的支出，但是直接利用全細(xì)胞催化會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，所以要找出行之有效的辦法來(lái)增加全細(xì)胞催化的效率。
[0004]超聲可以產(chǎn)生瞬時(shí)空化作用，即使細(xì)胞產(chǎn)生瞬時(shí)非特異性孔道(臨時(shí)針孔)，以增加細(xì)胞膜通透性，從而可以使底物與酶更充分接觸，提高全細(xì)胞催化效率。目前這一技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于粘質(zhì)沙雷氏菌，乳酸桿菌。目前利用超聲輔助大腸桿菌全細(xì)胞催化環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化為酒石酸還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一目的是提供一種環(huán)氧琥珀酸水解酶。
[0006]本發(fā)明的第二目的是提供含有上述環(huán)氧琥珀酸水解酶的重組質(zhì)粒。
[0007]本發(fā)明的第三目的是提供含有上述重組質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌。
[0008]本發(fā)明的第四目的是提供上述大腸桿菌重組菌的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
一、一種環(huán)氧琥珀酸水解酶，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]二、含有上述的環(huán)氧琥珀酸水解酶的重組質(zhì)粒。
[0011]三、含有上述的重組質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌。
[0012]四、上述的大腸桿菌重組菌在超聲輔助全細(xì)胞生產(chǎn)D-酒石酸中的應(yīng)用。
[0013]進(jìn)一步的，利用超聲輔助大腸桿菌全細(xì)胞催化環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化為酒石酸，其催化時(shí)間為10 min?60 min，催化功率為60 W?100 W，底物濃度為60g/L?180g/L，菌體濃度為5mg/ml ?12.5mg/ml0
[0014]作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，所述的催化時(shí)間為20min。
[0015]作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，所述的催化功率為70W。
[0016]作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，所述的底物濃度為100g/L。
[0017]作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，所述的菌體濃度為7.5mg/ml。
[0018]作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，利用超聲輔助大腸桿菌全細(xì)胞催化環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化為酒石酸，其催化時(shí)間為20 min，催化功率為70 W，底物濃度為100g/L，菌體濃度為7.5mg/ml。
[0019]具體如下:
1、獲得環(huán)氧琥珀酸水解酶基因，具體步驟為:
(1)土壤樣品采自南京工業(yè)大學(xué)東操場(chǎng)邊上小花園附近；
(2)土壤總DNA的提取:稱取Ig土壤樣品，加入Iml 0.1mol ml,pH 8.0磷酸緩沖液、玻璃珠，振蕩Imin，加入溶菌酶2.5mg ml，室溫振蕩15min，放置冰箱30min，加125μ1 20%SDS振蕩處理15min后離心，加酚(1:1體積)抽提I次，氯仿_異戊醇(1:1體積)抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置Ih，離心，70 %乙醇清洗，30μ1 TE溶解；
(3)引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GenBank中Bordetellasp.BK-52菌株的CESH基因設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列如下:
Pl: 5’- ATGGGTCGCGGATCCATGACTCGAACCAAGTTGAT-3’(SEQ ID N0.2)P2:5’-CTCGAATTCGGATCC TTAGTTGCTAATACCCAGAATTTCC-3’ (SEQ ID N0.3)
(4)CESH基因的擴(kuò)增:以土壤總DNA為模板，以P1、P2為引物，對(duì) CESH基因進(jìn)行擴(kuò)增。
[0020]2、以E.coli BL21為宿主菌，構(gòu)建含有環(huán)氧琥珀酸水解酶(CESH)的重組菌，具體步驟為:
(1)利用酶切線性化質(zhì)粒pet_28a，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳后，用凝膠回收試劑盒回收線性化質(zhì)粒片段。將回收得到的基因片段與質(zhì)粒片段，利用一步克隆體系連接，得到連接產(chǎn)物；
(2)將上述連接產(chǎn)物利用Cac12轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，挑取陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；
(3)將上述得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21，經(jīng)PCR和雙酶切篩選，得到陽(yáng)性克隆，測(cè)序。
[0021]3、酶的誘導(dǎo)表達(dá)，具體步驟為:
(1)挑取測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆于LB培養(yǎng)基中(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl為5g/L)，培養(yǎng)OD6qq達(dá)到0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo) 20h;
(2)離心收集菌體，0.1M磷酸緩沖液(PBS)洗滌三次，超聲破碎得到粗酶液，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有蛋白表達(dá)，且大部分為可溶性表達(dá)；
(3)將離心收集的菌體及超聲破碎得到的粗酶液與環(huán)氧琥珀酸反應(yīng)，利用偏釩酸銨法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)顯色明顯，CESH表達(dá)成功。
[0022]4、考察超聲輔助是否能提高本文構(gòu)建的重組菌全細(xì)胞催化效率，具體步驟為:
(1)采用LB培養(yǎng)基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L)，按1%ν/ν接種量從凍存管接入試管中，有氧培養(yǎng)10?12h，進(jìn)一步按1%(ν/ν)接種量接種至搖瓶(培養(yǎng)基也為L(zhǎng)B)，培養(yǎng)菌體OD6qq至0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，誘導(dǎo)20h ；
(2)離心收集0.2g濕細(xì)胞，用40ml，pH6.8，80g/L的環(huán)氧琥珀酸一鈉溶液重懸。將反應(yīng)體系置于振蕩以及超聲條件下進(jìn)行反應(yīng)，每隔I Omin取一次樣，每組反應(yīng)做三個(gè)平行樣。
[0023](3)酶活定義為每生成Immol的酒石酸所需要的濕細(xì)胞的量，酒石酸的含量用偏釩酸銨顯色法進(jìn)行測(cè)定。
[0024]5、考察振蕩反應(yīng)條件及超聲反應(yīng)條件的催化穩(wěn)定性，具體步驟為:
(1)采用LB培養(yǎng)基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl為5g/L)，按1%ν/ν)接種量從凍存管接入試管中，有氧培養(yǎng)10?12h，進(jìn)一步按1%(ν/ν)接種量接種至搖瓶(培養(yǎng)基也為L(zhǎng)B)，培養(yǎng)菌體OD6qq至0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，誘導(dǎo)20h ；
(2)離心收集0.08g濕細(xì)胞，用5ml，pH6.8，80g/L的環(huán)氧琥珀酸一鈉溶液重懸。將反應(yīng)體系置于振蕩以及超聲條件下進(jìn)行反應(yīng)，每次反應(yīng)結(jié)束換新鮮的底物，進(jìn)行6個(gè)批次反應(yīng)，每組反應(yīng)做三個(gè)平行樣。
[0025](3)酶活定義為每生成Immol的酒石酸所需要的濕細(xì)胞的量，酒石酸的含量用偏釩酸銨顯色法進(jìn)行測(cè)定。
[0026]6、優(yōu)化超聲輔助反應(yīng)條件，具體步驟為:
(1)采用LB培養(yǎng)基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl為5g/L)，按1%ν/ν)接種量從凍存管接入試管中，有氧培養(yǎng)10?12h，進(jìn)一步按1%(ν/ν)接種量接種至搖瓶(培養(yǎng)基也為L(zhǎng)B)，培養(yǎng)菌體OD6qq至0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，誘導(dǎo)20h ；
(2)對(duì)以下四個(gè)因素進(jìn)行探索，分別為反應(yīng)時(shí)間(10min-60min)，底物濃度(60g/L-180g/L)，菌體濃度(5mg/ml_12.5mg/ml)及超聲功率(60W-100W)。
[0027](3)酶活定義為每生成Immol的酒石酸所需要的濕細(xì)胞的量，酒石酸的含量用偏釩酸銨顯色法進(jìn)行測(cè)定。
[0028]采用上述技術(shù)方案的積極效果:(I)可實(shí)現(xiàn)更高的全細(xì)胞環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化率，節(jié)約了時(shí)間，且較優(yōu)超聲反應(yīng)條件是超聲功率70W，超聲時(shí)間20min，菌體濃度，7.5mg/ml，底物濃度100g/L; (2)超聲條件下的全細(xì)胞催化穩(wěn)定性也比振蕩條件下要好，在超聲功率為100W的條件下，反應(yīng)20min時(shí)，超聲輔助反應(yīng)轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達(dá)56.71%，而振蕩條件還檢測(cè)不到酒石酸的產(chǎn)生，并且經(jīng)過(guò)6批反應(yīng)之后，振蕩條件下的酶活有所降低，而超聲輔助反應(yīng)的酶活依然可以保持在一個(gè)比較高的水平。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1是單酶切質(zhì)粒驗(yàn)證凝膠電泳圖；
圖2是蛋白電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制:
實(shí)施例1
本實(shí)施例說(shuō)明環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的獲得。
[0031]以土壤總DNA為模板，以GenBank中Bordetella sp.BK-52菌株的CESH基因設(shè)計(jì)PCR引物，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到目的片段。PCR擴(kuò)增體系為:合成得到的DNA I μ L，引物Primer I和Primer 2各I yL，dNTP 4 yL，5 XPrimer star緩沖液 10 pL,Primer star聚合H0.5 UUddH2O 37.SlILt3PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s;然后52°C退火30 s，72°C延伸I min，循環(huán)30次;72°C延伸10 min。將擴(kuò)增條帶切膠后用柱式割膠回收試劑盒回收。
[0032]實(shí)施例2
本實(shí)施例說(shuō)明重組大腸桿菌的構(gòu)建。
[0033]質(zhì)粒pet-28a用BamHI酶切。酶切體系為:質(zhì)粒80 μL,BamHI 5 yL，10 X緩沖液25 μUddH2O 140 yL，總體積250 yL。將酶切體系切膠后用柱式割膠回收試劑盒回收。
[0034]經(jīng)膠回收的PCR片段和質(zhì)粒進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為:PCR產(chǎn)物IyL，酶切質(zhì)粒3PU—步克隆Pro連接酶2 nL，5 X連接酶緩沖液4 HUddH2OlOlIL,總體積20 yL。連接得到重組質(zhì)粒 pet-28a-CESH。
[0035]將上述連接體系pet-28a-CESH于200 yL感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42°C水浴熱激90秒，快速置于冰上卜3分鐘。加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基800 uL，于37°C振蕩培養(yǎng)Ih，取200 UL菌體涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)12-16 h。將陽(yáng)性菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定(如圖1)。經(jīng)電泳結(jié)果證明，該陽(yáng)性克隆菌落含有DNA片段插入質(zhì)粒，即構(gòu)建完成含纖環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的重組大腸桿菌。
[0036]實(shí)施例3
本實(shí)施例說(shuō)明環(huán)氧琥珀酸水解酶的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0037]將構(gòu)建的重組大腸桿菌E.coli BL21接種于5 ml添加了卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng);再以1%接種量轉(zhuǎn)接100 ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)2~4小時(shí)至OD6QQ達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入終濃度0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTGMI續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)20 h。結(jié)果如圖2。
[0038]實(shí)施例4
本實(shí)施例說(shuō)明粗酶液酶活的測(cè)定。
[0039]取5ml發(fā)酵液，離心，收集菌體。同等體積0.1M PBS洗滌三次，稱濕重。5ml，pH 6.8，100g/L環(huán)氧琥珀酸一鈉重懸菌體，超聲破碎lOmin，離心取上清。置于37°C搖床，反應(yīng)lh。利用偏釩酸銨顯色法測(cè)定酒石酸的量，顯色體系:1ml IM硫酸，2.5 ml 1%偏釩酸銨，加適量反應(yīng)液，搖勻，室溫顯色5min，產(chǎn)生的紅色物質(zhì)在波長(zhǎng)480nm處有特殊吸收，將分光光度計(jì)讀數(shù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到酒石酸的量。酶活定義:每小時(shí)生產(chǎn)Immol的酒石酸所需要的濕細(xì)胞的量定義為1U。最后測(cè)得的粗酶液的酶活為32.48 U/g濕細(xì)胞。
[0040]實(shí)施例5
本實(shí)施例說(shuō)明全細(xì)胞酶活的測(cè)定。
[0041 ] 取5ml發(fā)酵液，離心，收集菌體。同等體積0.1M PBS洗滌三次，稱濕重。5ml，pH 6.8，100g/L環(huán)氧琥珀酸一鈉重懸菌體，置于37°C搖床，反應(yīng)lh。利用偏釩酸銨顯色法測(cè)定酒石酸的量。最后測(cè)得的全細(xì)胞酶活為7.22U/g濕細(xì)胞。
[0042]實(shí)施例6
本實(shí)施例說(shuō)明超聲輔助反應(yīng)及振蕩條件反應(yīng)在不同時(shí)間的對(duì)比。
[0043]取20ml發(fā)酵液，離心，收集菌體。同等體積0.1M PBS洗滌三次，稱濕重。20ml，pH
6.8，100g/L環(huán)氧琥泊酸一鈉重懸菌體，置于37 °C搖床，每1min取一次樣。還有一組同樣的反應(yīng)體系，置于超聲清洗器中反應(yīng)，也是每隔1min取一次樣。利用偏釩酸銨顯色法測(cè)定酒石酸的量。
[0044]結(jié)果表明，超聲輔助反應(yīng)在20min時(shí)，可以轉(zhuǎn)化55.61%的底物，此時(shí)振蕩條件下檢測(cè)不到酒石酸的產(chǎn)生。Ih后，超聲輔助反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為70.77%，振蕩條件反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為
26.3%ο
[0045]實(shí)施例7
本實(shí)施例說(shuō)明重組大腸桿菌的全細(xì)胞催化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
[0046]取反應(yīng)結(jié)束的發(fā)酵液離心收集菌體，用同樣量的底物，將菌體重懸，進(jìn)行第二輪轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)發(fā)酵液的酶活，如此循環(huán)，分別測(cè)定2、3、4、5、6個(gè)周期后發(fā)酵液的酶活。發(fā)現(xiàn)酶活振蕩條件下的酶活有所降低，而超聲條件下一直能保持一個(gè)較高的水平，說(shuō)明超聲輔助反應(yīng)的催化穩(wěn)定性良好。具體數(shù)據(jù)為:振蕩條件下，第一批的酶活為9.22 U/g，而第六批的酶活為5.90 U/g，為初始酶活的63.99%;超聲條件下，第一批酶活為21.26 U/g，而第六批酶活為59.63 U/g。超聲輔助反應(yīng)的催化穩(wěn)定性良好。
[0047]實(shí)施例8
本實(shí)施例說(shuō)明超聲輔助反應(yīng)條件探索。
[0048]對(duì)底物濃度，反應(yīng)時(shí)間，菌體濃度及超聲功率進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)較優(yōu)條件如下:底物濃度100g/L，反應(yīng)時(shí)間20min，菌體濃度7.5mg/ml和超聲功率70W。
[0049](I)酶活隨著底物濃度的增大而增大，但是當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到100g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，并且之后酶活的增幅較小，即100g/L是本施例較優(yōu)條件；
(2)酶活隨著反應(yīng)時(shí)間先增大后減小，所以選擇酶活最高時(shí)的時(shí)間為本施例較優(yōu)條件，即20min;
(3)酶活隨著菌體量增加而增大直至平穩(wěn)，所以選擇酶活變平穩(wěn)時(shí)的菌體濃度為本施例較優(yōu)條件，即7.5mg/ml ；
(4)酶活隨著菌體量增加而增大后減小，所以選擇酶活最高時(shí)的功率為本施例較優(yōu)條件，即70W。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種環(huán)氧琥珀酸水解酶，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.含有權(quán)利要求1所述的環(huán)氧琥珀酸水解酶的重組質(zhì)粒。3.含有權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌。4.權(quán)利要求3所述的大腸桿菌重組菌在超聲輔助全細(xì)胞生產(chǎn)D-酒石酸中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，利用超聲輔助大腸桿菌全細(xì)胞催化環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化為酒石酸，其催化時(shí)間為10 min?60 min，催化功率為60 W?100 W，底物濃度為60g/L ?180g/L，菌體濃度為5mg/ml ?12.5mg/ml。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的催化時(shí)間為20min。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的催化功率為70W。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的底物濃度為100g/L。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的菌體濃度為7.5mg/ml。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，利用超聲輔助大腸桿菌全細(xì)胞催化環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化為酒石酸，其催化時(shí)間為20 min，催化功率為70 W，底物濃度為100g/L，菌體濃度為 7.5mg/ml。
【文檔編號(hào)】C12N9/14GK105861463SQ201610222929
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月12日
【發(fā)明人】姜岷, 趙鳳蓮, 馬江鋒, 董維亮, 張?jiān)?
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué)