一種耐熱的重組木聚糖酶及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組木聚糖酶及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖水解酶系是一類降解木聚糖的酶系，包括β-l，4-內(nèi)切木聚糖酶、β_木糖苷 酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙?；揪厶敲负头铀狨ッ?，可降解自然界中大 量存在的木聚糖類半纖維素。在木聚糖水解酶系中，β-1，4_內(nèi)切木聚糖酶是最關(guān)鍵的水解 酶，它通過水解木聚糖分子的β-l，4-糖苷鍵，將木聚糖水解為小寡糖和木二糖等低聚木糖， 以及少量的木糖和阿拉伯糖。
[0003] 隨著社會(huì)的發(fā)展，木聚糖酶得到了廣泛的工業(yè)應(yīng)用，同時(shí)也對木聚糖酶的穩(wěn)定性 (耐熱、耐酸堿)有了更高的要求。在飼料工業(yè)中，木聚糖在飼料中的添加能夠顯著提高飼料 的消化性，也有利于非常規(guī)飼料代替常規(guī)糧食飼料，能夠有效避免人畜爭糧。而作為一種飼 料添加劑時(shí)，木聚糖酶需要在較廣泛的pH范圍內(nèi)有較好的耐受能力，以適應(yīng)動(dòng)物消化道內(nèi) 變化的pH環(huán)境。其次在飼料的混合制粒過程中會(huì)產(chǎn)生大量熱量，這也要求木聚糖酶有較好 的耐熱能力。同時(shí)在造紙行業(yè)木聚糖酶的使用可以提高漂白率以及降低漂白成本。但紙張 漂白時(shí)的堿性環(huán)境，則需要耐堿性木聚糖酶的開發(fā)。
[0004] 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們可以通過蛋白質(zhì)化學(xué)修飾，功能基團(tuán)修飾、穩(wěn)定劑、包 被劑等方式來間接提高木聚糖酶在生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)的穩(wěn)定性。但能從根本上提高蛋白質(zhì)工業(yè)性 能需要從蛋白質(zhì)分子自身結(jié)構(gòu)出發(fā)，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。目前解決木聚糖酶穩(wěn)定性 的手段，主要集中在三個(gè)方向。一、利用易錯(cuò)PCR篩選方法獲得木聚糖酶突變基因。二、通過 定點(diǎn)突變技術(shù)，理性改造木聚糖酶基因。三、將兩種木聚糖酶進(jìn)行嵌合設(shè)計(jì)。
[0005] 目前的研究發(fā)現(xiàn)了眾多能分泌木聚糖酶的微生物，以曲霉屬及木霉屬的絲狀真菌 為主。基于木聚糖酶的結(jié)構(gòu)，木聚糖酶主要可以被分成GH10和GH11兩個(gè)家族。GH10家族的木 聚糖酶一般結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，分子量較大，不利于工業(yè)生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的研究也不如GH11族木 聚糖深入。當(dāng)前已有眾多的研究證實(shí)GH11族木聚糖酶的N端對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有重要的意義。 a螺旋區(qū)的穩(wěn)定性也直接關(guān)系到蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性，而分子表面的電荷分布則關(guān)系到蛋 白質(zhì)分子的pH耐受范圍?？偨Y(jié)已有研究表明引入二硫鍵對于增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性是相 對有效的方法，但二硫鍵的引入常常容易改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而使改造后的酶分子活性 大大降低甚至消失，并且含二硫鍵的蛋白質(zhì)不易表達(dá)，表達(dá)量低。因此，制備得到穩(wěn)定且酶 活高的木聚糖酶并非易事。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供了一種熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性良好的重組木聚糖酶。
[0007] 本發(fā)明首先提供了一種重組木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008] 其中，編碼如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N01所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
[0010]本發(fā)明還提供了一種重組載體，它包括SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
[0011] 優(yōu)選地，所述重組載體是重組pET32a。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種重組菌，它包括前述的重組載體.
[0013] 優(yōu)選地，所述重組菌為重組大腸桿菌。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種制備前述重組木聚糖酶的方法，它包括如下步驟：
[0015] (1)菌體生長:將前述的重組菌接種到大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600 = 1.0;
[0016] (2)誘導(dǎo)表達(dá)：取菌液，加入到大腸桿菌培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)至0D600 = 0 · 5，加入終濃度為 lmmol/L 的 IPTG，于 37°C，250rpm 培養(yǎng) 10h;
[0017 ] ⑶離心，收集菌體，菌體破碎，純化，即可。
[0018] 步驟(3)中，純化的方法是用鎳柱純化。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述重組木聚糖酶在制備飼料添加劑中的用途。
[0020] 本發(fā)明用基因工程的方法制備得到具有熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性好，而且酶活也非常 高的重組木聚糖酶，作為飼料添加劑時(shí)能更好的發(fā)揮作用，在造紙時(shí)也能有效保持酶活，而 且本發(fā)明方法的表達(dá)量高，工業(yè)應(yīng)用前景良好。
[0021] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0022] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0023] 圖1 SDS-PAGE結(jié)果圖，泳道1:未經(jīng)DDT處理的Xyn2;泳道2:2mM DDT處理的Xyn2;泳 道3:10mM DDT處理的Xyn2;泳道M:Mark;泳道4:未經(jīng)DDT處理的Xyn2-14-52;泳道5:2mM DDT 處理的Xyn2-14-52;泳道6:10mM DDT處理的Xyn2-14-52;
[0024] 圖2熱穩(wěn)定性結(jié)果圖；
[0025] 圖3熱穩(wěn)定性結(jié)果圖；
[0026]圖4 pH熱穩(wěn)定性結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1制備含有目標(biāo)基因片段的工程菌
[0028] 將里氏木霉無菌孢子轉(zhuǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：0.3g Xylan from Oat spelts，0.4g KH2P〇4，1.0g(NH4)2HP〇4，1.0g Tryptone0.3g Yeast Extract。30°C，250rpm震蕩培養(yǎng)7h〇
[0029] 提取里氏木霉總RNA:
[0030] 取上述培養(yǎng)基離心收集菌絲，用液氮研磨成粉狀。Trizol法提取里氏木霉總RNA。
[0031] 合成 CDNA:
[0032] 取上述總RNA為模板，用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成 cDNA〇
[0033] 以上述所得cDNA為模板，用一對帶有EcoRI和Notl的引物，酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo) 注。
[0034] 引物序列如下：
[0035] Up:5-GCTGAATTCCAGACGATTCAGCCCGGCA-3
[0036] Down:5-ATGCGGCCGCTTAGCTGACGGTGATGGAA-3
[0037] 里氏木霉木聚糖酶基因(Xyn2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：
[0038] PCR反應(yīng)體系
[0040] 反應(yīng)程序如下
[0041 ] PCR反應(yīng)條件
[0043]取5μ1，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。
[0044] PCR產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit純化，經(jīng)EcoRI、 Not I雙酶切后，與同樣雙酶切的載體pET32a連接，得重組載體，命名為Xyn2。
[0045]連接體系及條件如下：
[0046]連接反應(yīng)體系
[0048]突變基因的構(gòu)建
[0049]以上述重組的載體為模板，分別用兩對突變引物將14位的苯丙氨酸(F)和52位的 谷氨酰胺(Q)替換成半胱氨酸(C)，得到本發(fā)明突變重組載體Xyn2-14-52。突變位點(diǎn)用下劃 線標(biāo)注。實(shí)驗(yàn)步驟參照Trans Fast Mutagenesis System Kit〇
[0050] 引物序列如下：
[0051] V59C
[0052] MF1：5-CTGCCCGAGAAGTTGATGCACTTGTTCTTGGTGCCGG-3
[0053] MR2:5-TGCATCAACTTCTCGGGCAGCTACAACCCCAACGG-3
[0054] V59C
[0055] MF3：5-CTGCCCGAGAAGTTGATGCACTTGTTCTTGGTGCCGG-3
[0056] MR3:5-TGCATCAACTTCTCGGGCAGCTACAACCCCAACGG-3
[0057] 上述重組載體Xyn2、突變的重組載體Xyn2-14_52送至上海生工測序鑒定顯示Xyn2 序列與數(shù)據(jù)庫一致，Xyn2-14-52序列與預(yù)期突變序列相符。
[0058]本發(fā)明突變重組載體Xyn2-14-52中重組木聚糖酶對應(yīng)的基因片段的核苷酸序列 (SEQ ID N0.1)為：
[0060] 本發(fā)明重組載體Xyn2-14-52也可以采用如下方式制備：按照SEQ ID N0.1所示序 列合成基因片段，在兩端添加 EcoRI和Notl酶切位點(diǎn)，經(jīng)EcoRI、NotI雙酶切后，與同樣雙酶 切的載體pET32a連接，即可。
[0061 ]實(shí)施例2本發(fā)明重組木聚糖酶的表達(dá)純化
[0062] 1、重組蛋白的制備
[0063] 本發(fā)明重組木聚糖酶Xyn2-14_52的制備：
[0064] (1)表達(dá)
[0065] 取實(shí)施例1得到的突變重組載體載體Xyn2-14-52,轉(zhuǎn)入Origami B(DE3)，并涂布與 含有100mg/ml Amp的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜。
[0066] 挑取單克隆，接種于10ml含100mg/ml Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)