專利名稱：：木聚糖酶酶活檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及飼料用酶酶活檢測方法，尤其涉及木聚糖酶酶活檢測方法。
背景技術(shù)：
：近年來，小麥作為一種飼料原料在飼料業(yè)大規(guī)模應(yīng)用。但是，小麥含有一定量的抗?fàn)I養(yǎng)因子——木聚糖，它影響營養(yǎng)成份的充分消化和吸收，增加動(dòng)物腸道的粘度，造成飼料利用效率降低，從而導(dǎo)致動(dòng)物營養(yǎng)不良、污染環(huán)境等影響畜牧業(yè)發(fā)展的一系列后果。在動(dòng)物飼料中添加木聚糖酶降解木聚糖，從而消除木聚糖對小麥型高粘度飼料的影響已取得顯著的成效，然而，如何檢測木聚糖酶活力，國內(nèi)并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，酶活檢測方法不同，導(dǎo)致取得的結(jié)論不一致，從而影響了木聚糖酶及其相關(guān)產(chǎn)品的推廣和應(yīng)用，也影響了小麥型高粘度伺料在飼料業(yè)中的大量推廣和應(yīng)用。目前，常用的檢測木聚糖酶活力的方法，大都釆用木燕麥做底物來測定酶制劑產(chǎn)品的酶活，但這種方法取得的結(jié)杲與實(shí)際應(yīng)用效果間存在#>大的差異，在實(shí)際應(yīng)用中，效果;f艮不理想。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種木聚糖酶酶活的檢測方法，該方法使用粉碎的小麥作為木聚糖酶水解的底物，相較木燕麥做底物，更接近實(shí)際應(yīng)用，有準(zhǔn)確的指導(dǎo)意義。本發(fā)明的技術(shù)方案是木聚糖酶分解小麥效率的檢測方法，先采用常規(guī)方法繪制木糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體步驟如下分別取lmg/ml標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.Oml于6個(gè)潔凈的試管中，補(bǔ)加蒸餾水至2.Oml，加入2.OmlDNS試劑，搖勻，沸水浴10min，冷卻后用移液管加蒸餾水10ml;用IO鵬比色皿，用分光光度計(jì)分別測定其吸光度(0D值)。所述一種木聚糖酶酶活檢測方法，包括以下步驟(1)底物制備取小麥去殼粉碎，得小麥粉；(2)待測反應(yīng)液的制備稱取數(shù)份等質(zhì)量，計(jì)為C克的小麥粉，分別加入等量的蒸餾水中，攪勻，制得計(jì)為D毫升小麥粉溶液；依次向上述小麥粉溶液中添加木聚糖酶，木聚糖酶添加量從零單位開始，依次增加，制得數(shù)份反應(yīng)液；(3)比色測定將步驟(2)中的彩:f分反應(yīng)液均置于40。C恒溫水浴鍋中，在一段時(shí)間后分別取各份反應(yīng)液中的反應(yīng)液B毫升，0.05《B<D,均加入9倍于B的pH5.3的醋酸鈉-醋酸緩沖液和10倍于B的3，5-二硝基水楊酸試劑混合均勻，沸水浴反應(yīng)10分鐘后，冷卻，再均加入50倍于B的蒸餾水，以沒加木聚糖酶的反應(yīng)液作為空白對照，用分光光度計(jì)測定各反應(yīng)液的分光度；(4)計(jì)算結(jié)果根據(jù)所測得的分光度及木糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各份反應(yīng)液的B亳升反應(yīng)液所含有的還原糖量，用下列公式計(jì)算各份反應(yīng)液中的木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉所得還原糖量，式xDfl=_2-其中n為0，1，2，3,...a。表示第n份反應(yīng)液中的木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉生成的還原糖量，單位rag/g;An表示第n份反應(yīng)液的B毫升反應(yīng)液所含有的還原糖量，單位mg;D表示反應(yīng)液總體積，單位ml;B表示比色測定時(shí)所取的反應(yīng)液體積，單位m1;C表示各份反應(yīng)液所用小麥粉的質(zhì)量，單位g。所述小麥粉過60目篩所述D取6，所述B取O.2。所述步驟(3)中的一段時(shí)間為至少1小時(shí)。所述步驟(3)中取反應(yīng)液的時(shí)間分為1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)三次吸取。本發(fā)明的有益效果為，用木燕麥做底物檢測木聚糖酶酶活是標(biāo)準(zhǔn)方法，然而，在實(shí)際應(yīng)用中，尤其是在用小麥粉作為飼料時(shí)，用小麥粉做底物檢測木聚糖酶酶活，測得的結(jié)果更跟接近實(shí)際，有較準(zhǔn)確的指導(dǎo)意義。圖1.木糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2.依表3不同單位木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉所得還原糖量數(shù)據(jù)，作出的分解時(shí)間一所得還原糖含量曲線圖。具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合具體實(shí)施過程，對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。本實(shí)驗(yàn)的目的是探索木聚糖酶分解小麥的效率，其原理為，木聚糖酶催化木聚糖水解生成二糖、木糖等還原糖，二糖、木糖等還原糖能將3,5-二硝基水楊酸(DNS)中的賄基還原成橙黃色的氨基化合物，利用比色法測定其還原物生成量來表示酶的活力。本發(fā)明所用到的主要儀器和設(shè)備有752型分光光度計(jì)、恒溫水浴箱、電熱風(fēng)恒溫干燥箱、電水箱、電子分析天平、酸度計(jì)、混勻器、秒表、電爐、5ml和lml移液器各一支以及一次性移液器吸頭、試管若干、試管夾、比色皿、燒杯和玻璃棒等。本發(fā)明涉及的材料、試劑及其制備方法(1)小麥粉小麥去殼后粉碎，過60目篩。(2)1M醋酸溶液量取5.7ml水醋酸到100ml容量瓶，用蒸餾水定容至lOOml。(3)0.05M醋酸鈉-醋酸緩沖液稱取4.lg醋酸鈉溶解于900ml蒸餾水中，用1M醋酸溶液調(diào)整pH至5.3,用蒸餾水定容至lOOOml。(4)DNS試劑稱取3，5-二硝基水楊酸(C7H4N207)20g,溶解于1500ml蒸餾水中，加入32gNaOH,加熱至45°C,攪拌直至溶液變得澄清，然后，逐步加入600g酒石酸鉀鈉，10g苯酚，10g亞硫酸鈉，攪拌直至溶液變得澄清，蒸餾水定容至2000ml,用多孔玻璃過濾器過濾，室溫下，儲(chǔ)存于棕色瓶中，溶液兩周后方可使用，試劑最多可使用6個(gè)月。(5)lmg/ml木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取0.lOOOg木糖(80。C下烘干至恒重)于100容量瓶中，用0.05MpH5.3的醋酸鈉-醋酸緩沖液定容至lOOml。所用試劑若無特殊說明均為分析純，所用水若無注明，均指蒸餾水。實(shí)驗(yàn)步驟一、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分別取lmg/ml木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.Oml于6個(gè)潔凈的試管中，補(bǔ)加蒸餾水至2.Oml，加入2.OmlDNS試劑，搖勻，沸水浴lOmin，冷卻后用移液管加蒸餾水lOml。用IO隱比色皿，在波長540nm處用752型分光光度計(jì)分別測定其吸光度(OD值)。結(jié)果如表l所示。并用三次重復(fù)結(jié)果的均值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的木糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程。如圖1所示。二、木聚糖酶分解小麥效率的檢測方法(l)原料制備小麥去殼粉碎，過60目篩。表1.不同濃度的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在54Onm處的OD值木糖含量(mg)第一次OD值第二次OD值第三次OD值平均值OD值0.20.1220.1230.1210.1220.40.2680.2670.2630.2667<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)待測反應(yīng)液的制備取數(shù)個(gè)50ml燒杯，依次編號為1，2，3……；別稱取C克，例如lg小麥粉，置于各個(gè)50ml燒杯中；每克小麥粉中加入6ml蒸餾水，攪勻，得6ml溶液，計(jì)為Dml;依次向燒杯1,燒杯2，燒杯3……中添加木聚糖酶，其木聚糖酶添加量依次為0U，5U，10U......,燒杯的個(gè)數(shù)和木聚糖酶的添加量的增加以木聚糖酶降解小麥粉生成的還原糖量不再增加為止。(3)比色測定取步驟2中各燒杯，置于40。C恒溫水浴鍋中，在O,1,2,3……小時(shí)分別取各燒杯中的反應(yīng)液上清0.2ml，計(jì)為口Bml于試管中，加入1.8mlpH5.3的醋酸鈉-醋酸緩沖液和2.OmlDNS試劑混合均勻，沸水浴反應(yīng)10分鐘后，冷卻，加入10ml蒸餾水，以沒加木聚糖酶的反應(yīng)液作為空白對照，用752型分光光度計(jì)，在540nm處測定各溶液的OD值，記錄1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)……測得的結(jié)果。結(jié)果如表2所示(4)計(jì)算結(jié)果根據(jù)所測得的分光度;M^糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各份反應(yīng)液的B毫升反應(yīng)液所含有的還原糖量，用下列公式計(jì)算M反應(yīng)液中的木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉所得還原糖量，如表3所示。其中n為0，1，2，3,...an表示第n份反應(yīng)液中的木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉生成的還原糖量，單位mg/g;An表示第n份反應(yīng)液的B毫升反應(yīng)液所含有的還原糖量，單位mg;D表示反應(yīng)液總體積，單位ml;B表示比色測定時(shí)所取的反應(yīng)液體積，單位m1;C表示各份反應(yīng)液所用小麥粉的質(zhì)量，單位g。表2不同單位木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉所得還原糖量在540nm處的OD值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>依表3數(shù)據(jù)，作出分解時(shí)間一所得還原糖含量曲線圖，如圖2所示。分析圖2可知(1)單位質(zhì)量的小麥粉中，在一定范圍內(nèi)，木聚糖酶分解小麥粉所得還原糖含量隨著木聚糖酶酶量的增加而增加；(2)單位質(zhì)量的小麥粉中，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著木聚糖酶分解小麥粉時(shí)間加長，分解所得木糖量逐步增加;(3)單位質(zhì)量的小麥粉中，相同時(shí)間，木聚糖酶分解小麥粉所得還原糖最高時(shí)，所用的木聚糖酶添加量為60U。表3不同單位木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉所得還原糖含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.一種木聚糖酶酶活檢測方法，先采用常規(guī)方法繪制木糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，其特征在于，包括以下步驟(1)底物制備取小麥去殼粉碎，得小麥粉；(2)待測反應(yīng)液的制備稱取數(shù)份等質(zhì)量，計(jì)為C克的小麥粉，分別加入等量的蒸餾水中，攪勻，制得計(jì)為D毫升小麥粉溶液；依次向上述小麥粉溶液中添加木聚糖酶，木聚糖酶添加量從零單位開始，依次增加，制得數(shù)份反應(yīng)液；(3)比色測定將步驟(2)中的數(shù)份反應(yīng)液均置于40℃恒溫水浴鍋中，在一段時(shí)間后分別取各份反應(yīng)液中的反應(yīng)液B毫升，0.05≤B≤D，均加入9倍于B的pH5.3的醋酸鈉-醋酸緩沖液和10倍于B的3，5-二硝基水楊酸試劑混合均勻，沸水浴反應(yīng)10分鐘后，冷卻，再均加入50倍于B的蒸餾水，以沒加木聚糖酶的反應(yīng)液作為空白對照，用分光光度計(jì)測定各反應(yīng)液的分光度；(4)計(jì)算結(jié)果根據(jù)所測得的分光度及木糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各份反應(yīng)液的B毫升反應(yīng)液所含有的還原糖量，用下列公式計(jì)算各份反應(yīng)液中的木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉所得還原糖量，其中n為0，1，2，3，...an表示第n份反應(yīng)液中的木聚糖酶分解單位質(zhì)量小麥粉生成的還原糖量，單位mg/g；An表示第n份反應(yīng)液的B毫升反應(yīng)液所含有的還原糖量，單位mg；D表示反應(yīng)液總體積，單位ml；B表示比色測定時(shí)所取的反應(yīng)液體積，單位ml；C表示各份反應(yīng)液所用小麥粉的質(zhì)量，單位g。2.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶酶活檢測方法，其特征在于，所述小麥粉過60目篩。3.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶酶活檢測方法，其特征在于，所述C取1，所述D取6，所述B取O.2。4.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶酶活檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中的一_^時(shí)間為至少1小時(shí)。5.如權(quán)利要求1所述的木聚糖酶酶活檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中取反應(yīng)液的時(shí)間分為1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)三次吸取。全文摘要本發(fā)明涉及木聚糖酶酶活檢測方法，尤其涉及以小麥為底物，檢測木聚糖酶酶活的方法。其方案是將小麥去殼粉碎后，過60目篩，木聚糖酶催化小麥所含木聚糖水解生成還原糖，還原糖能將3，5-二硝基水楊酸中的硝基還原成橙黃色的氨基化合物，利用比色法測定其還原糖生成量來表示酶的活力。該方法使用粉碎的小麥作為檢測木聚糖酶活力的底物，相較標(biāo)準(zhǔn)底物，更接近實(shí)際應(yīng)用，有準(zhǔn)確的指導(dǎo)意義。文檔編號G01N21/77GK101451958SQ20081022051公開日2009年6月10日申請日期2008年12月29日優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日發(fā)明者周響艷,李澤月,王志敏,王耀輝申請人:東莞泛亞太生物科技有限公司