動物糞便宏基因組來源的多功能木聚糖降解酶、其編碼基因及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種動物糞便宏基因組來源的多功能木 聚糖降解酶、其編碼基因及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖是一個由β-1，4或β_1，3糖苷鍵連接的高度分支的異聚多糖，主鏈由木糖苷 鍵連接吡喃木糖基而成，側(cè)枝包括乙?；?，L型阿拉伯糖基，葡萄糖醛酸基等。與木聚糖的結(jié) 構(gòu)相適應(yīng)，木聚糖降解酶種類豐富，完全降解木聚糖需要內(nèi)切l(wèi)，4-i3-D-木聚糖酶(endo-1， 4-0-D-xylanohydrolase，EC 3· 2 · 1 ·8)、β_木糖苷酶（β-D-xylosidase，EC 3· 2· 1 · 37)，a_L_ 阿拉伯咲喃糖苷酶(&-1^-&瓜13；[110;1^11瓜1108丨(1&86 40 3.2.1.55)、&-0葡萄糖酸酸苷酶(&-0-glucatronidase，EC 3.2.1.139)等多種酶的協(xié)同作用，通過這些酶的協(xié)同作用，木聚糖能 夠有效地被水解(Collins et al.FEMS Microbiol Rev，2005,29:3-23)0
[0003] 植食性動物胃腸道中存在豐富的與木質(zhì)纖維素降解有關(guān)的多種酶類，但不同動物 之間存在差異（Hess et al.Science，2011，331:463-467;Dai et al.PLoS 0ne，2012,7: e40430)。研究表明，不同環(huán)境及微生物來源的木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)差異較大（Kimura et al.Biosci Biotechnol Biochem,2000,64:1230-1237；Gessesse et al.Appl Environ Microbiol ,1998,64:3533-3535)，因此研究鑒定不同來源的木聚糖降解酶對拓寬其應(yīng)用領(lǐng) 域具有重要意義。
[0004] 胃腸道微生物群落是動物長期進(jìn)化的結(jié)果，和動物的食性、機(jī)體的免疫功能、營養(yǎng) 需求等有著密切的關(guān)系。滇金絲猴(Rhinopithecus bieti)是典型的植食性靈長類動物，主 食粗纖維食物，研究發(fā)現(xiàn)其腸道中存在大量能分解纖維素、半纖維素的細(xì)菌，如纖維桿菌 屬、密螺旋屬、假單胞菌屬以及瘤胃球菌屬的細(xì)菌（Xu et al.BMC Genomics, 2015,16: 174)，但其與纖維素降解相關(guān)酶的研究工作很少。
[0005] 微生物是獲取酶的主要來源，因此分離微生物是獲取酶的首要步驟，一直以來研 究者多利用純培養(yǎng)技術(shù)預(yù)先從環(huán)境樣品中分離出能夠利用纖維素的微生物，再從其體內(nèi)提 取相關(guān)的酶。然而，傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)使得占微生物種類99%以上的不可培養(yǎng)微生 物無法分離獲得，因此通過分離培養(yǎng)微生物來篩選新型酶的傳統(tǒng)方法大大限制了篩選的廣 泛性和有效性。近年發(fā)展起來的宏基因組技術(shù)避開傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)過程，直接研究 特定環(huán)境中的基因組DNA，借助新一代測序技術(shù)和生物信息學(xué)平臺，挖掘利用大量過去無法 獲得的新基因資源。
[0006] 宏基因組技術(shù)的應(yīng)用拓寬了木聚糖降解酶的篩選與克隆的范圍，Gong等從奶牛瘤 胃宏基因組文庫中篩選得到高活性的GH10木聚糖酶(Gong et al，BMC Research Notes, 2012,1:566-576),該酶在4 °C時能保持25%的相對活性。Kim等從土壤宏基因組文庫中篩選 得到一種新型雙功能木聚糖酶/內(nèi)切葡聚糖酶CelM2,可同時水解大麥葡聚糖及木聚糖(Kim et al,Biochem Biophy Res Commun,2009,383:183-186)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種動物糞便宏基因組來源的多功能木聚糖降解酶、其編 碼基因及其制備方法，本發(fā)明提供的多功能木聚糖降解酶同時具有木聚糖酶、木糖苷酶和 阿拉伯糖苷酶活性，且具有部分低溫活性。
[0008] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種動物糞便宏基因組來源的多功能木聚糖降解酶， 其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，共402個氨基酸，其理論分子量為47.74kDa。本發(fā)明從滇 金絲猴糞便宏基因組中得到木聚糖降解酶基因 XynRBM，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá) 和重組酶的酶學(xué)特性分析，發(fā)現(xiàn)獲得的多功能木聚糖降解酶XynRBM同時具有木聚糖酶、木 糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性，且具有部分低溫活性，在0°(：、10°(：、20°(：下分別具有13.5%、 46.9%、72.6%的酶活，可應(yīng)用于低溫產(chǎn)品加工，且本發(fā)明中的多功能木聚糖降解酶來源于 動物胃腸道，因此其性質(zhì)具有進(jìn)一步應(yīng)用于飼料等領(lǐng)域的潛力。
[0009] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種編碼上述技術(shù)方案所述的多功能木聚糖降解酶 的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本發(fā)明從滇金絲猴的糞便中制備微生物宏基因組DNA，通過Hiseq基因組測序儀測 序宏基因組DNA，經(jīng)功能注釋發(fā)現(xiàn)木聚糖降解酶的編碼基因 XynRBM，通過PCR的方法分離克 隆該基因，其全長為1209bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TAA。經(jīng)NCBI網(wǎng)站的BLASTP比對發(fā) 現(xiàn)，該木聚糖降解酶基因編碼的氨基酸序列與GenBank中Treponema 1^5^]11:;[;[來源的匕6七&-1，4_xylanase(WP_022931984· 1)具有最高的一致性，為55%，但該Treponema bryantii來 源的蛋白活性并未研究，說明該木聚糖降解酶XynRBM是一種新的糖苷水解酶。
[0011] 本發(fā)明的目的之三在于提供一種包含上述技術(shù)方案所述的基因的重組表達(dá)載體， 優(yōu)選為pEasy-E2-XynRBM。將本發(fā)明的基因 XynRBM插入到表達(dá)載體中，使其核苷酸序列與表 達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，將本發(fā)明基因和表達(dá)載體 pEasy-E2通過T-A方式相連接，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pEasy-E2_XynRBM。
[0012] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種利用上述技術(shù)方案所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿 主細(xì)胞所得的重組菌株，所述菌株包括但不限于大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌， 優(yōu)選為重組菌株BL21(DE3)/XynRBM。
[0013] 本發(fā)明的目的之五在于提供一種上述技術(shù)方案所述的多功能木聚糖降解酶的制 備方法，包括以下步驟：
[0014] 將木聚糖降解酶的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞得到重組菌株，培養(yǎng)重組菌株，誘 導(dǎo)重組木聚糖降解酶的表達(dá)；
[0015] 回收并純化所表達(dá)的重組木聚糖降解酶，得到多功能木聚糖降解酶。
[0016] 其中，所述木聚糖降解酶基因按照以下方法獲得：
[0017]以SEQ ID N0.3所示的上游引物和SEQ ID N0.4所示的下游引物為引物對，以滇金 絲猴糞便微生物宏基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到木聚糖降解酶基因；
[0018] 其中，上游引物的序列為:5 ' ATGAACGGAAGAACTTTAAAAAC3 ' ；下游引物的序列為:5 ' AATTATAATTTCAAGCAGTTTATC3'。
[0019] 具體而言，所述木聚糖降解酶按照以下方法獲得：
[0020] 首先按照以下方法提取滇金絲猴糞便微生物宏基因組DNA:
[0021] 1)取出糞便樣品，采用滅菌水清洗2次，稱取0.2g糞便，置于5mL滅菌的離心管中。 [0022] 2)加 ASL buffer 1.4mL，震蕩渦旋至充分混勻，70°C孵育5min后震蕩15s。
[0023] 3)12 OOOrpm離心lmin，轉(zhuǎn)移上清液到干凈的離心管中。
[0024] 4)加入1片Inhibit EX Tablet，充分混勻后室溫靜止2min，確保Inhibit EX基質(zhì) 吸附完抑制劑，12 000r pm離心5m i η。
[0025] 5)轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，12 OOOrpm離心5min。
[0026] 6)轉(zhuǎn)移上清至新的離心管，加入15μ1蛋白酶K，和200μ1的buffer AL，混勻后70°C 孵育lOmin。
[0027] 7)加200μ1的無水乙醇，混勻后將液體轉(zhuǎn)移到QIAamp吸附柱，12000g離心2min。
[0028] 8)用500μ1 的AW1 buffer清洗柱子，12 OOOrpm離心2min。
[0029] 9)加入500μ1的AW2 buffer，12 OOOrpm離心2min后，轉(zhuǎn)移柱子到新的離心管。
[0030] 10)加30μ1 buffer AE，室溫放置5min，12 OOOrpm離心2min。
[0031]獲得的微生物宏基因組DNA置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] 用超聲打斷儀Biorupter將5yg上述提取的微生物宏基因組DNA打斷為400~600bp 的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration試劑盒對打斷的DN