重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut、編碼基因、工程菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化領(lǐng)域，尤其涉及一種重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut及其在 兩相體系中生物酶法不對稱合成(S)-N-Boc_3-哌啶醇的應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] (S)-N-Boc-3-哌啶醇是一種重要的手性含氮飽和雜環(huán)醇，具有活潑的官能團(tuán) 0H"和"-NH-"，是合成多種生物活性物質(zhì)的重要手性切塊。高抗瘧疾活性的天然藥物常山堿 和異常山堿、神經(jīng)激肽受體的拮抗劑L-733,060,以及周期素依賴性激酶的抑制劑夫拉平度 都含有(S)-3-哌啶醇結(jié)構(gòu)。此外，（S)-N-Boc-3-哌啶醇還是合成套細(xì)胞淋巴癌治療新藥依 魯替尼的中間體。（S)-N-Boc-3-哌啶醇的制備方法包括化學(xué)法和生物法，其中生物法因反 應(yīng)條件溫和、綠色、高效、立體選擇性高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。目前所知的生物法不對稱合成 (S)-N-Boc-3-哌啶醇的制備方法是通過羰基還原酶(或酮還原酶)對前手性底物N-Boc-3-哌啶酮的不對稱還原而獲得(S) -N-Bo c-3-哌啶醇。生物酶法不對稱合成(S) -N-Bo c-3-哌啶 醇的工業(yè)化應(yīng)用，要求適用高濃度的底物，而高濃度的底物和輔底物以及生成的高濃度產(chǎn) 物均會抑制酶活力，從而降低催化效率。因此，獲得一種能夠不對稱還原高濃度底物的羰基 還原酶是生物酶法不對稱合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵所在。
[0003] 具有優(yōu)秀催化性能的羰基還原酶的獲得可通過野生酶的大規(guī)模篩選以及酶的定 向進(jìn)化與改造。相比于野生酶的篩選，基于結(jié)構(gòu)信息對酶進(jìn)行定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)可克服 天然酶的先天不足，理性高效地改善酶的催化性能，極大地降低了篩選工作量。羰基還原酶 的分子改造目前已有許多成功的例子。日本學(xué)者Itosh等人的研究團(tuán)隊(duì)對紅球菌ST-10的苯 乙醛還原酶PAR進(jìn)行改造實(shí)現(xiàn)了高濃度異丙醇下的生物催化。PAR的突變株HAR1以20%異丙 醇為輔底物，還原32.5%的N-Boc-3-吡咯烷酮為（S)-N-Boc-3-吡咯烷醇，得率94%，產(chǎn)物 e.e.值大于99%。德國學(xué)者M(jìn)anfred T.Reetz最近報(bào)道了基于結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的三聯(lián)體的飽和突 變成功改變了酶的立體選擇性，所采用的策略有效地縮減了篩選規(guī)模，提高了改造效率。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是利用一種高酶活力、高立體選擇性、高底物耐受性的羰基還原酶突 變體為生物催化劑，在兩相催化體系中實(shí)現(xiàn)生物酶法不對稱還原高濃度N-Boc-3-哌啶酮合 成(S)-N-Boc_3-哌啶醇。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種羰基還原酶突變體ReCR-Mut，所述重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut 是將 SEQ ID N0.2 所示氨基酸序列中第 54 位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼岖@得的，所述突變體 ReCR-Mut的氨基酸序列為SEQ ID N0.4所示。
[0007] 本發(fā)明還提供一種所述重組羰基還原酶ReCR-Mut編碼基因，所述編碼基因的核苷 酸序列為SEQ ID N0.3所示。
[0008] 所述的重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut編碼基因由如下方法得到：設(shè)計(jì)引物F1 (5 ' -TACACCTTCGGCCTTCCTCTCACGC-3 '）和引物R1 (5 ' -AAGGCCGAAGGTGTACTGCTCCTCG-3 '），利 用反向PCR技術(shù)，以質(zhì)粒pEASY-E2-recr(recr基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.l所示，對應(yīng) 羰基還原酶ReCR的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示）為模板，克隆出全質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化于大腸桿菌BL21(DE3)。對突變后的質(zhì)粒測序，并利用軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，該序列 含有一個長為l〇47bp的開放閱讀框，第54位氨基酸成功由酪氨酸變?yōu)楸奖彼幔ㄍ蛔凅w ReCR-Mut的氨基酸序列為SEQIDN0.4所示，其編碼基因的核苷酸序列為SEQIDN0.3所 示)。
[0009] 本發(fā)明還涉及一種含所述重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut基因的載體及所述載 體構(gòu)建的重組基因工程菌。優(yōu)選所述的突變體ReCR-Mut的獲得及重組基因工程菌的構(gòu)建包 括如下步驟：以質(zhì)粒pEASY-E2-recr為模板，利用帶有突變堿基的引物經(jīng)過反向PCR擴(kuò)增全 質(zhì)粒，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpnl酶消化甲基化的模板，酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中， 即可得到所述含重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut基因的重組基因工程菌E.coli BL21 (DE3)/pEASY-E2-recr-mut，其中含重組羰基還原酶突變體編碼基因的質(zhì)粒命名為pEASY-E2-recr-mut〇
[0010] 此外，本發(fā)明還提供一種所述重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut在生物酶法制備 (S)-N-Boc-3-哌啶醇的中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為：以含重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut編碼 基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以N-Boc-3-哌啶酮為底物，以仲辛醇為 輔助底物，以NAD+為輔酶，以pH 8.0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在35°C、300rpm條 件下反應(yīng)，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液分離純化，獲得(S)-N-Boc-3-哌啶醇;所述反應(yīng)體系中，催 化劑用量以濕菌體重量計(jì)為240g/L，所述底物終濃度為300g/L，輔酶終濃度為1.2mM，仲辛 醇體積終濃度為60% (v/v)。
[0011] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述濕菌體按如下方法制備：將含重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut編碼基因的工程菌(E. coli BL21 (DE3)/pEASY-E2-recr-mut)接種至含100μg/mL氨節(jié)青 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)12h，獲得種子液，將種子液以體積濃度2 %的接種量接種 至新鮮的含l〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8，再加入 終濃度為〇. 3mM的IPTG，20 °C誘導(dǎo)12h，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)液，再將誘導(dǎo)培養(yǎng)液于4 °C和lOOOOrpm 下離心10min，棄去上清液，收集濕菌體。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明所述立體選擇性專一的 重組羰基還原酶突變體ReCR-Mut與野生型羰基還原酶ReCR相比，具有更高的酶活力和催化 效率；突變體ReCR-Mut還原N-Boc-3-哌啶酮的比酶活力是野生型ReCR的1.42倍，突變體 ReCR-Mut對N-Boc-3-哌啶酮的kcat/Km值是野生型的1.37倍。利用突變體ReCR-Mut為生物催 化劑，以仲辛醇為輔底物和有機(jī)相，利用NAD+為輔酶高效不對稱合成光學(xué)純(S)-N-Boc-3-哌啶醇（圖1)。在優(yōu)選兩相體系中，300g/L N-Boc-3-哌啶酮經(jīng)整細(xì)胞法催化其不對稱還原 反應(yīng)12h，產(chǎn)物(S)-N-Boc-3-哌啶醇的產(chǎn)物e.e.值>99%，得率為93.9% ;與野生型羰基還原 酶ReCR作為生物催化劑相比，產(chǎn)物得率提高了 11.9%。 (四）【附圖說明】
[0013] 圖1為兩相體系中生物酶法不對稱合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇原理圖。
[0014]圖2為羰基還原酶ReCR編碼基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳圖；Μ為marker; 1 為羰基還原酶ReCR編碼基因。
[0015] 圖3為質(zhì)粒pEASY-E2-recr經(jīng)反向PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳圖;Μ為marker; 1為 質(zhì)粒反向PCR產(chǎn)物。
[0016] 圖4為分離純化后羰基還原酶ReCR的SDS-PAGE圖;Μ為marker; 1為分離純化后的羰 基還原酶ReCR。
[0017] 圖5為分離純化后羰基還原酶突變體ReCR-Mut的SDS-PAGE圖;Μ為marker; 1為分離 純化后的羰基還原酶突變體ReCR-Mut。
[0018] 圖6為不對稱合成中底物和產(chǎn)物的氣相色譜圖;A，N-Boc_3-哌啶酮標(biāo)樣;B，（S)-N-Boc-3-哌啶醇標(biāo)樣;C，（R)-N-Boc-3-哌啶醇標(biāo)樣;D，不對稱還原反應(yīng)后的底物和產(chǎn)物。
[0019] 圖7為突變體ReCR-Mut和野生型ReCR催化高濃度底物的反應(yīng)進(jìn)程。 (五)【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明實(shí)施例所述重組羰基還原酶ReCR編碼基因源自紅串紅球菌WZ010 (Rhodococcus erythropolis WZ010)。紅串紅球菌WZ010保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址：中國武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號:CCTCC No:M2011336，保藏日期：2011年9月29 日，已在先前申請專利（【申請?zhí)枴?01110364085.8)中提交了相關(guān)菌種保藏信息并披露了其 遺傳資源來源。
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0022] 實(shí)施例1:重組表達(dá)質(zhì)粒pEASY-E2-recr與基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2_recr的構(gòu)建
[0023] 以紅串紅球菌WZ010菌株中的基因組DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物F1和R1進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見表1所示。
[0024] 表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
[0025]
[0026] 引物如下：F1，5 ' -ATGAAGGCAATCCAGTACAC-3 ' ； R1，5 ' -CTACAGACCAGGGACCACA-3 '。 PCR反應(yīng)進(jìn)程為:94°C預(yù)變性5min;之后，以94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C保持lmin為一 個循環(huán)，重復(fù)這樣循環(huán)30次;最后，72°C保持lOmiruPCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 從圖2中可看到約1000bp處有明亮的條帶，條帶與理論值1047bp相符。
[0027]將PCR產(chǎn)物片段（核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示）與pEASY-E2載體進(jìn)行ΤΑ克隆，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Transl-Tl感受態(tài)細(xì) 胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布含l〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。LB 固體培養(yǎng)基上形成的菌落經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后接入含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，37 °C培養(yǎng)12h，離心收集菌體，提取質(zhì)粒，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pEASY-E2-recr。重組表達(dá)質(zhì) 粒pEASY-E2-recr轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，得到大腸桿菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr 〇
[0028] 將構(gòu)建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2-recr接種至含100yg/mL氨芐 青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)12h，獲得種子液，將種子液以體積濃度2 %的接種量接 種至新鮮的含l〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8，再加 入終濃度為0.3mM的IPTG，20 °C誘導(dǎo)12h，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)液，再將培養(yǎng)液于4°C和lOOOOrpm下 離心10min，棄去上清液收集濕菌體，作為整細(xì)胞催化的催化劑。
[0029] 實(shí)施例2:重組表達(dá)質(zhì)粒pEASY-E2-recr-mut與基因工程菌E.coli BL21(DE3)/ pEASY_E2_r ecr-mut 的構(gòu)建
[0030] 以質(zhì)粒pEASY-E2-recr為模板，設(shè)計(jì)引物F2和引物R2，反向PCR擴(kuò)增出突變質(zhì)粒，擴(kuò) 增體系見表2所示。
[0031] 表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
[0032]
[0UJJJ 0| 5U 卜：h 2，fc) - - T A U A U U T T U Lr Lr U U T T U U T U T U A U Lr U - 3 - ; KZ , b -AAGGCCGAAGGTGTACTGCTCCTCG-3 '。PCR反應(yīng)進(jìn)程為:95 °C 預(yù)變性2min;之后，以95 °C 變性20s， 68°C復(fù)性20s，72°C保持3min為一個循環(huán)，重復(fù)這樣循環(huán)30次;最后，72°C保持lOmiruPCR產(chǎn) 物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從圖3中可看到約6000bp處有明亮的條帶，