專利名稱：重組β-內(nèi)酰胺酶與RGD融合蛋白及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗體導(dǎo)向酶-前藥療法(ADEPT)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是一種重組 β -內(nèi)酰胺酶與RGD融合蛋白及其在治療乳腺癌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高選擇性腫瘤化療是目前腫瘤研究的重要課題之一，大多數(shù)化療藥物缺乏對(duì)腫 瘤組織的高選擇性，往往在對(duì)腫瘤組織發(fā)揮作用的同時(shí)也對(duì)身體的正常組織產(chǎn)生毒副作 用。單克隆抗體技術(shù)問世以來，為腫瘤的導(dǎo)向治療提供了基礎(chǔ)。前藥是一類本身無活性或 活性很低，但在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)的藥物。利用抗體做為載體攜帶前藥的專一性活 化酶，可以選擇性地結(jié)合于腫瘤部位，使前藥可以區(qū)域特異性在腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性細(xì) 胞毒分子,這種方法被稱為“抗體導(dǎo)向酶_前藥療法(antibody-directedenzyme prodrug therapy, ADEPT)。自1987年Bagshawe提出ADEPT這一概念，已引起了人們的廣泛的關(guān)注， 他克服了以往化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素存在的許多問題。Bagshawe從綠膿桿菌中分離羧 肽酶G2并且克隆入人大腸桿菌中，最初是用來降解甲氨蝶呤，后來用來切除苯甲酸氮芥的 衍生物上谷氨酸部分使之活化。這是目前最具代表性的一套ADEPT系統(tǒng)，而且已進(jìn)入小規(guī) 模臨床試驗(yàn)階段。只需要少量的酶-抗體交聯(lián)物就可以在腫瘤部位催化大量的前體藥物變 為有毒性作用的活性藥物。ADEPT方案的優(yōu)勢(shì)在于一個(gè)酶分子可以轉(zhuǎn)化很多個(gè)分子的前體 藥物，在腫瘤部位產(chǎn)生高濃度的活性藥物，這樣可以彌補(bǔ)臨床應(yīng)用中免疫聯(lián)物結(jié)合力較低 的缺點(diǎn)，另有證據(jù)表明，在腫瘤表面產(chǎn)生高濃度藥物比全身應(yīng)用同等濃度的活性藥物更加 有效。β -內(nèi)酰胺酶是由抗生素處理過的耐藥菌株產(chǎn)生的一類外源性酶。內(nèi)酰胺類的藥 物用于治療細(xì)菌感染已經(jīng)在臨床上使用很多年了。內(nèi)酰胺類化合物對(duì)人體的毒性很 低，而且不會(huì)被人體內(nèi)源性的酶水解。而且，β-內(nèi)酰胺酶是一個(gè)單鏈的蛋白，分子量相對(duì) 較小，性質(zhì)穩(wěn)定且易于純化。一種內(nèi)酰胺酶的突變體具有更好的免疫學(xué)性質(zhì)，更適用于 ADEPT。將β-內(nèi)酰胺酶融合到一段單鏈抗體后，能夠富集于腫瘤部位，在血漿很快的清除。 β-內(nèi)酰胺酶可以激活一系列化療藥的前藥，而且，作為一種可溶性蛋白，β-內(nèi)酰胺酶可 以在大腸桿菌中量產(chǎn)，便于今后臨床使用。細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料等的粘附是細(xì)胞生存與增殖所必需的， 這種粘附主要通過一種被稱為整合素的物質(zhì)來介導(dǎo)。癌細(xì)胞表面的整合素與正常組織粘 連，造成癌轉(zhuǎn)移。整合素分子最重要的識(shí)別序列是蛋白質(zhì)中的Arg-Gly-Asp (精氨酸-甘氨 酸-天門冬氨酸，簡(jiǎn)稱RGD)序列，大多數(shù)整合素都可識(shí)別它。所以如果ADEPT中的β-內(nèi) 酰胺酶與RGD序列進(jìn)行融合表達(dá)，它就可以特異性的將β -內(nèi)酰胺酶定位于癌細(xì)胞表面，特 異性的在癌細(xì)胞表面對(duì)前藥進(jìn)行活化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種具有細(xì)胞粘附活性的β -內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白及其編碼的多核苷酸。特別是具有RGD4C =Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly 的 β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C 融合蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白在乳腺癌藥物治療中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白，它的氨基酸序列包含了源于β-內(nèi)酰 胺酶的序列以及含短肽RGD的序列。為此，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
一種β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白，其所具有的氨基酸序列如下⑶CRGDCFC GGGGS TPVSEKQLAE WANTITPLM AAQSVPGMAV AVIYQGKPHY YTFGKADIAA NKPVTPQTLF ELGSISKTFT GVLGGDAIAR GEISLDDAVTRYffPQLTGKQ WQGIRMLDLA TYTAGGLPLQ VPDEVTDNAS LLRFYQNffQPQffKPGTTRLY ANASIGLFGA LAVKPSGMPY EQAMTTRVLK PLKLDHTffINVPKAEEAHYA WGYRDGKAVR VSPGMLDAQA YGVKTNVQDMANWVMA NMAPENVADASLKQ GIALAQSRYff RIGSMYQGLG WEMLNWPVEA NTVVEGSDSKVALAPLPVAE VNPPAPPVKA SffVHKTGSTG GFGAYVAFIPEKQIGIVMLA NTSYPNPARVEAAYHILEALQ。本發(fā)明所述的β -內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白核苷酸序列如下TGTGACTGTCGTGGCGATTGTTTCTGTGGCGGTGGCGGCAGCACACCAGTTAGTGAAAAACAACTGGCA GAGGTGGTGGCGAACACGATTACCCCACTGATGGCTGCTCAATCCGTTCCAGGTATGGCAGTGGCAGTTATTTATCA GGGCAAACCGCATTACTATACTTTCGGGAAAGCGGATATCGCGGCCAACAAACCAGTCACTCCACAAACCCTGTTCG AACTGGGGAGTATTTCCAAAACGTTTACGGGTGTACTGGGCGGCGACGCTATTGCCCGCGGGGAAATTAGTCTGGAC GATGCTGTAACCCGTTACTGGCCACAACTGACTGGGAAACAGTGGCAGGGTATCCGCATGCTGGACCTGGCGACATA CACAGCCGGGGGGCTGCCACTGCAGGTCCCAGATGAGGTTACTGACAACGCCTCTCTGCTGCGTTTTTATCAGAACT GGCAACCACAATGGAAACCAGGCACAACACGCCTGTACGCAAATGCATCGATTGGTCTGTTTGGCGCTCTGGCTGTT AAACCAAGCGGTATGCCGTATGAACAGGCAATGACGACCCGCGTTCTGAAACCACTGAAACTGGACCATACGTGGAT CAACGTACCAAAAGCCGAAGAGGCCCACTACGCCTGGGGTTATCGTGACGGGAAAGCAGTACGCGTGTCGCCAGGGA TGCTGGACGCCCAGGCTTATGGCGTCAAAACCAATGTACAAGATATGGCGAACTGGGTAATGGCTAATATGGCACCA GAGAATGTGGCCGATGCGTCACTGAAACAAGGCATCGCACTGGCGCAATCCCGTTATTGGCGTATCGGGTCCATGTA TCAAGGTCTGGGCTGGGAGATGCTGAACTGGCCGGTTGAGGCGAACACCGTCGTTGAGGGCTCGGACTCAAAAGTGG CACTGGCCCCGCTGCCAGTAGCGGAGGTGAATCCACCGGCACCGCCGGTCAAAGCGTCATGGGTCCATAAAACGGGT TCTACGGGTGGTTTCGGCGCTTACGTTGCATTCATCCCAGAAAAACAAATCGGCATCGTAATGCTGGCTAATACAAG TTACCCGAACCCGGCGCGCGTAGAGGCGGCATATCACATTCTGGAAGCTCTGCAG。所述β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白含有源于β-內(nèi)酰胺酶的序列形成融合蛋白的 結(jié)構(gòu)區(qū)和短肽RGD的序列形成融合蛋白的功能區(qū)。所述β -內(nèi)酰胺酶包括所有野生型的β -內(nèi)酰胺酶及其突變體。例如β “內(nèi)酰胺 酶(genebank No :X07234)的一個(gè)突變型(K21/A，S324/A)。所述含短肽RGD的序列為包括含有氨基酸序列Arg-Gly-Asp的所有多肽。例如含 短肽RGD的序列為RGD =Arg-Gly-AspNGR :Asn-Gly-ArgGRGD =Gly-Arg-Gly-AspRGDS =Arg-Gly-Asp-Ser
RGDSP =Arg-Gly-Asp-SerGRGDS =Gly-Arg-Gly-Asp-SerRGD4C :Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly
優(yōu)選含短肽RGD的序列為GRGDS更加優(yōu)選含短肽RGD的序列為RGD4C本發(fā)明提供一種β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白的制備方法，其特征在于按以下步驟 進(jìn)行(1)融合基因的構(gòu)建包括合成低聚核苷酸，使用PCR技術(shù)將序列融合至β -內(nèi)酰 胺酶成熟肽；(2)融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建將高分子DNA連接入表達(dá)用質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化表達(dá)用大 腸桿菌宿主細(xì)胞后振蕩培養(yǎng)，以IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)；(3)細(xì)胞凍干后用B-PER提取細(xì)菌蛋白，得到可溶性蛋白；(4)破菌離心后收集上清液用金屬鎳螯合親和層析純化，再經(jīng)冷凍干燥收集目的 蛋白，既β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白。本發(fā)明提供的低聚核苷酸的長(zhǎng)度為1200個(gè)堿基或以下。本發(fā)明進(jìn)一步公開了 β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白在ADEPT治療乳腺癌藥物中 的應(yīng)用，具體內(nèi)容如下1.融合蛋白與頭孢美法侖的離體細(xì)胞試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7乳腺癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸浮 液，接種于96孔板中，溫孵培養(yǎng)24hr，每孔加入lOOng/ml的β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白 在4°C溫孵30min，洗板四次后，加入不同濃度的頭孢美法侖、美法侖溫孵48hr后，每孔中加 Λ 20 μ IMTT (5mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)4hr，1000轉(zhuǎn)xlOmin離心后棄上清，每孔加入DMSO 100 μ 1， 振蕩IOmin使其充分溶解后，于570nm測(cè)定A值。每個(gè)濃度作3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算腫瘤細(xì)胞的生 長(zhǎng)抑制率。2. β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白/頭孢美法侖的體內(nèi)分布試驗(yàn)用125I標(biāo)記融合蛋白，靜脈注射入移植乳腺癌細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)，不同時(shí)間段進(jìn)行顯 像。觀察抗體的定位情況。如圖6所示，可見融合蛋白能夠定位到腫瘤部位具有較好的靶 向性。本發(fā)明提供的β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果 在于[1],本發(fā)明提供了一種利用基因重組和原核細(xì)胞表達(dá)得到雙功能的融合蛋白，即 具有β -內(nèi)酰胺酶的活性又具有細(xì)胞粘附活性，解決了在ADEPT中單抗與酶融合后引起的 免疫原性問題。[2].本發(fā)明的重組蛋白可用于ADEPT治療，特異性的靶向于腫瘤新生血管在局部 活化前藥，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療。


圖1為本發(fā)明的重組β -內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白的基因構(gòu)建示意圖；圖2為本發(fā)明β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖；其中M 蛋白Marker，Con 空白對(duì)照，1-4 質(zhì)粒不同時(shí)間誘導(dǎo)產(chǎn)物， 5:沉淀，6:上清液。圖3為本發(fā)明實(shí)施例中的融合蛋白(β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C)的氨基酸序列；圖4為本發(fā)明的融合蛋白結(jié)合乳腺癌細(xì)胞株的活性；圖5為前體藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷曲線；圖6為融合蛋白在動(dòng)物體內(nèi)分布的小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)顯像。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中所使用的一種氨基酸序列來自于β -內(nèi)酰胺酶(genebankNo :X07234)的一個(gè)突變型(K21/A，S324/A)。另外，本發(fā)明中采用的另一個(gè)氨基酸序列Cys-Asp-Cys-Ar g-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。其特殊之處在于序列中包含了 Arg-Gly-Asp，即RGD序列。利用 基因重組技術(shù)構(gòu)建了 內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合基因，并且對(duì)該融合基因進(jìn)行了原核表達(dá)和 活性測(cè)定。實(shí)施例1β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合基因的構(gòu)建(1)根據(jù)融合蛋白的氨基酸序列，利用OptimumGene 基因優(yōu)化軟件對(duì)蛋白的DNA 序列進(jìn)行優(yōu)化，得到DNA序列如下TGTGACTGTCGTGGCGATTGTTTCTGTGGCGGTGGCGGCAGCACACCAGTTAGTGAAAAACAACTGGCA GAGGTGGTGGCGAACACGATTACCCCACTGATGGCTGCTCAATCCGTTCCAGGTATGGCAGTGGCAGTTATTTATCA GGGCAAACCGCATTACTATACTTTCGGGAAAGCGGATATCGCGGCCAACAAACCAGTCACTCCACAAACCCTGTTCG AACTGGGGAGTATTTCCAAAACGTTTACGGGTGTACTGGGCGGCGACGCTATTGCCCGCGGGGAAATTAGTCTGGAC GATGCTGTAACCCGTTACTGGCCACAACTGACTGGGAAACAGTGGCAGGGTATCCGCATGCTGGACCTGGCGACATA CACAGCCGGGGGGCTGCCACTGCAGGTCCCAGATGAGGTTACTGACAACGCCTCTCTGCTGCGTTTTTATCAGAACT GGCAACCACAATGGAAACCAGGCACAACACGCCTGTACGCAAATGCATCGATTGGTCTGTTTGGCGCTCTGGCTGTT AAACCAAGCGGTATGCCGTATGAACAGGCAATGACGACCCGCGTTCTGAAACCACTGAAACTGGACCATACGTGGAT CAACGTACCAAAAGCCGAAGAGGCCCACTACGCCTGGGGTTATCGTGACGGGAAAGCAGTACGCGTGTCGCCAGGGA TGCTGGACGCCCAGGCTTATGGCGTCAAAACCAATGTACAAGATATGGCGAACTGGGTAATGGCTAATATGGCACCA GAGAATGTGGCCGATGCGTCACTGAAACAAGGCATCGCACTGGCGCAATCCCGTTATTGGCGTATCGGGTCCATGTA TCAAGGTCTGGGCTGGGAGATGCTGAACTGGCCGGTTGAGGCGAACACCGTCGTTGAGGGCTCGGACTCAAAAGTGG CACTGGCCCCGCTGCCAGTAGCGGAGGTGAATCCACCGGCACCGCCGGTCAAAGCGTCATGGGTCCATAAAACGGGT TCTACGGGTGGTTTCGGCGCTTACGTTGCATTCATCCCAGAAAAACAAATCGGCATCGTAATGCTGGCTAATACAAG TTACCCGAACCCGGCGCGCGTAGAGGCGGCATATCACATTCTGGAAGCTCTGCAG。全DNA的合成工作由公司(金思特科技有限公司)提供，得到了融合蛋白的質(zhì)粒 DNA，測(cè)序報(bào)告和含重組質(zhì)粒的甘油菌一份。實(shí)施例2β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白的表達(dá)將測(cè)序驗(yàn)證的β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合基因克隆入載體pET30a(+)轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞BL21(DE3)細(xì)菌，挑取單菌接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1 100 接種于含25-170 μ g/ml氯霉素的液體培養(yǎng)基，當(dāng)OD6tltl達(dá)到0. 5-1. 0左右時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，IPTG的濃度為0. 5mM。繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后經(jīng)15000g轉(zhuǎn)速離心lOmin。 鎳柱親和層析純化后，冷凍干燥得到融合蛋白內(nèi)酰胺酶-RGD4C，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白 進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。本發(fā)明的特殊之處在于誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間和溫度可以根據(jù)實(shí)際情況，如目的蛋白 的可溶性，穩(wěn)定性和表達(dá)量進(jìn)行調(diào)整，可調(diào)整為30°C誘導(dǎo)4小時(shí)以上，或者20°C或12°C誘導(dǎo) 過夜。掃描SDS-PAGE的蛋白條帶。實(shí)施例3β -內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白的酶活性和細(xì)胞粘附活性測(cè)定用包被液稀釋純化后的β-內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白，使其終濃度分別為30000、 20000、10000、6000、2000、500、200ng/ml，以每孔100 μ 1的體積加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 4°C包被過夜。0. 9%的NaCl洗板3次后，每孔中加入封閉液200μ 1，37°C封閉2hr，再用 0. 9%的NaCl洗板3次。MCF-7乳腺癌細(xì)胞用0. 9%的NaCl洗滌3遍后，用不完全培養(yǎng)基 重懸細(xì)胞。每孔加入100 μ 1細(xì)胞懸液，培養(yǎng)lhr，洗板，除去未黏附的細(xì)胞。黏附在培養(yǎng)孔 內(nèi)的細(xì)胞用固定液固定后，0. 5%的結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞黏附情況并照相。結(jié) 果如圖所示，被融合蛋白包被的孔內(nèi)有細(xì)胞黏附，且黏附細(xì)胞數(shù)量隨蛋白濃度增加而增多， 而被β “內(nèi)酰胺酶包被的孔內(nèi)沒有細(xì)胞黏附。結(jié)果表明，β “內(nèi)酰胺酶-RGD4C在體外對(duì)乳 腺癌細(xì)胞MCF-7具有黏附性，證實(shí)了其靶向性。酶活性試驗(yàn)使用頭孢硝噻吩工作液進(jìn)行檢測(cè)25°C情況下，以200 μ g/ml的酶 10微升同不同濃度的頭孢硝噻吩混勻(0. 2-400 μ mol/L)，迅速測(cè)定260nm吸收值，利用 1士11冊(cè)盼卯1-811計(jì)曲線計(jì)算融合蛋白的米氏常數(shù)1(111 = 20. 1 士6. 0 μ mol/L，能夠完全的水解原藥。實(shí)施例4β -內(nèi)酰胺酶-GRGDS融合蛋白的表達(dá)該融合蛋白的基因序列如下，全基因的合成由金思特(南京)科技有限公司完成GGTCGTGGCGATAGCGGCGGTGGCGGCAGCACACCAGTTAGTGAAAAACAACTGGCAGAGGTGGTGGCG AACACGATTACCCCACTGATGGCTGCTCAATCCGTTCCAGGTATGGCAGTGGCAGTTATTTATCAGGGCAAACCGCA TTACTATACTTTCGGGAAAGCGGATATCGCGGCCAACAAACCAGTCACTCCACAAACCCTGTTCGAACTGGGGAGTA TTTCCAAAACGTTTACGGGTGTACTGGGCGGCGACGCTATTGCCCGCGGGGAAATTAGTCTGGACGATGCTGTAACC CGTTACTGGCCACAACTGACTGGGAAACAGTGGCAGGGTATCCGCATGCTGGACCTGGCGACATACACAGCCGGGGG GCTGCCACTGCAGGTCCCAGATGAGGTTACTGACAACGCCTCTCTGCTGCGTTTTTATCAGAACTGGCAACCACAAT GGAAACCAGGCACAACACGCCTGTACGCAAATGCATCGATTGGTCTGTTTGGCGCTCTGGCTGTTAAACCAAGCGGT ATGCCGTATGAACAGGCAATGACGACCCGCGTTCTGAAACCACTGAAACTGGACCATACGTGGATCAACGTACCAAA AGCCGAAGAGGCCCACTACGCCTGGGGTTATCGTGACGGGAAAGCAGTACGCGTGTCGCCAGGGATGCTGGACGCCC AGGCTTATGGCGTCAAAACCAATGTACAAGATATGGCGAACTGGGTAATGGCTAATATGGCACCAGAGAATGTGGCC GATGCGTCACTGAAACAAGGCATCGCACTGGCGCAATCCCGTTATTGGCGTATCGGGTCCATGTATCAAGGTCTGGG CTGGGAGATGCTGAACTGGCCGGTTGAGGCGAACACCGTCGTTGAGGGCTCGGACTCAAAAGTGGCACTGGCCCCGC TGCCAGTAGCGGAGGTGAATCCACCGGCACCGCCGGTCAAAGCGTCATGGGTCCATAAAACGGGTTCTACGGGTGGT TTCGGCGCTTACGTTGCATTCATCCCAGAAAAACAAATCGGCATCGTAATGCTGGCTAATACAAGTTACCCGAACCC GGCGCGCGTAGAGGCGGCATATCACATTCTGGAAGCTCTGCAG。
將測(cè)序驗(yàn)證的β -內(nèi)酰胺酶-GRGDS融合基因克隆入載體pET30a(+)轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞BL21(DE3)細(xì)菌，挑取單菌接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1 100 接種于含25-170 μ g/ml氯霉素的液體培養(yǎng)基，當(dāng)0D_達(dá)到1. 0時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋 白質(zhì)表達(dá)，IPTG的濃度為-2mM。繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)后經(jīng)10000轉(zhuǎn)/min離心lOmin。收集上 清液，用his鎳柱純化，即得到β -內(nèi)酰胺酶-GRGDS重組蛋白，對(duì)該重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。本發(fā)明的特殊之處在于誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間和溫度可以根據(jù)實(shí)際情況，如目的蛋白 的可溶性，穩(wěn)定性和表達(dá)量進(jìn)行調(diào)整，可調(diào)整為30°C誘導(dǎo)4小時(shí)以上，或者25°C或15°C誘導(dǎo) 過夜。掃描SDS-PAGE的蛋白條帶。
在詳細(xì)說明的較佳實(shí)施例之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述 申請(qǐng)專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所 作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說明 書中所舉實(shí)例實(shí)施方式的限制。序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所<120>重組β -內(nèi)酰胺酶與RGD融合蛋白及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用<160>2<210>1<211>1125<212>DNA<213>β-內(nèi)酰胺酶<220><221>gene<222>(1). . (1125)<400>1tgtgactgtc gtggcgattg tttctgtggc ggtggcggca gcacaccagt tagtgaaaaa 60caactggcag aggtggtggc gaacacgatt accccactga tggctgctca atccgttcca 120ggtatggcag tggcagttat ttatcagggc aaaccgcatt actatacttt cgggaaagcg 180gatatcgcggagtcactcca caaaccctgt tcgaactggg gagtatttcc 240aaaacgttta cgggtgtact gggcggcgac gctattgccc gcggggaaat tagtctggac 300gatgctgtaa cccgttactg gccacaactg actgggaaac agtggcaggg tatccgcatg 360ctgg已cctgg cgacatacac agccgggggg ctgccactgc aggtcccaga tgaggttact 420gacaacgcct ctctgctgcg tttttatcag aactggcaac cacaatggaa accaggcaca 480acacgcctgt acgcaaatgc atcgattggt ctgtttggcg ctctggctgt taaaccaagc 540ggtatgccgt atgaacaggc aatgacgacc cgcgttctga aaccactgaa actggaccat 600acgtggatca acgtaccaaa agccgaagag gcccactacg cctggggtta tcgtgacggg 660aaagcagtac gcgtgtcgcc agggatgctg gacgcccagg cttatggcgt caaaaccaat 720gtacaagata tggcgaactg ggtaatggct aatatggcac cagagaatgt ggccgatgcg 780tcactgaaac aaggcatcgc actggcgcaa tcccgttatt ggcgtatcgg gtccatgtat 840
caaggtctgg gctgggagat gctgaactgg ccggttgagg cgaacaccgt cgttgagggc 900tcggactcaa aagtggcact ggccccgctg ccagtagcgg aggtgaatcc accggcaccg 960ccggtcaaag cgtcatgggt ccataaaacg ggttctacgg gtggtttcgg cgcttacgtt 1020gcattcatcc cagaaaaaca aatcggcatc gtaatgctgg ctaatacaag ttacccgaac 1080
ccggcgcgcg tagaggcggc atatcacatt ctggaagctc tgcag1125<210>2<211>375bp<212>PRT<213> β-內(nèi)酰胺酶<220><221>CHAIN<222>(1). . (375)<400>2Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro151015Val Ser Glu Lys Gln Leu Ala Glu Val Val Ala Asn Thr lie Thr Pro202530Leu Met Ala Ala Gln Ser Val Pro Gly Met Ala Val Ala Val lie Tyr354045Gln Gly Lys Pro His Tyr Tyr Thr Phe Gly Lys Ala Asp lie Ala Ala505560Asn Lys Pro Val Thr Pro Gln Thr Leu Phe Glu Leu Gly Ser lie Ser65707580Lys Thr Phe Thr Gly Val Leu Gly Gly Asp Ala lie Ala Arg Gly Glu859095lie Ser Leu Asp Asp Ala Val Thr Arg Tyr Trp Pro Gln Leu Thr Gly100105110Lys Gln Trp Gln Gly lie Arg Met Leu Asp Leu Ala Thr Tyr Thr Ala115120125Gly Gly Leu Pro Leu Gln Val Pro Asp Glu Val Thr Asp Asn Ala Ser130135140Leu Leu Arg Phe Tyr Gln Asn Trp Gln Pro Gln Trp Lys Pro Gly Thr145150155160Thr Arg Leu Tyr Ala Asn Ala Ser lie Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala165170175Val Lys Pro Ser Gly Met Pro Tyr Glu Gln Ala Met Thr Thr Arg Val180185190Leu Lys Pro Leu Lys Leu Asp His Thr Trp lie Asn Val Pro Lys Ala195200205
Glu Glu Ala His Tyr Ala Trp Gly Tyr Arg Asp Gly Lys Ala Val Arg210215220Val Ser Pro Gly Met Leu Asp Ala Gln Ala Tyr Gly Val Lys Thr Asn225230235240Val Gln Asp Met Ala Asn Trp Val Met Ala Asn Met Ala Pro Glu Asn245250255Val Ala Asp Ala Ser Leu Lys Gln Gly lie Ala Leu Ala Gln Ser Arg260265270Tyr Trp Arg lie Gly Ser Met Tyr Gln Gly Leu Gly Trp Glu Met Leu275280285Asn Trp Pro Val Glu Ala Asn Thr Val Val Glu Gly Ser Asp Ser Lys290295300Val Ala Leu Ala Pro Leu Pro Val Ala Glu Val Asn Pro Pro Ala Pro305310315320Pro Val Lys Ala Ser Trp Val His Lys Thr Gly Ser Thr Gly Gly Phe325330335Gly Ala Tyr Val Ala Phe lie Pro Glu Lys Gln lie Gly lie Val Met340345350Leu Ala Asn Thr Ser Tyr Pro Asn Pro Ala Arg Val Glu Ala Ala Tyr355360365His lie Leu Glu Ala Leu Gln
370375。
權(quán)利要求
一種β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列TGTGACTGTCGTGGCGATTGTTTCTGTGGCGGTGGCGGCAGCACACCAGTTAGTGAAAAACAACTGGCAGAGGTGGTGGCGAACACGATTACCCCACTGATGGCTGCTCAATCCGTTCCAGGTATGGCAGTGGCAGTTATTTATCAGGGCAAACCGCATTACTATACTTTCGGGAAAGCGGATATCGCGGCCAACAAACCAGTCACTCCACAAACCCTGTTCGAACTGGGGAGTATTTCCAAAACGTTTACGGGTGTACTGGGCGGCGACGCTATTGCCCGCGGGGAAATTAGTCTGGACGATGCTGTAACCCGTTACTGGCCACAACTGACTGGGAAACAGTGGCAGGGTATCCGCATGCTGGACCTGGCGACATACACAGCCGGGGGGCTGCCACTGCAGGTCCCAGATGAGGTTACTGACAACGCCTCTCTGCTGCGTTTTTATCAGAACTGGCAACCACAATGGAAACCAGGCACAACACGCCTGTACGCAAATGCATCGATTGGTCTGTTTGGCGCTCTGGCTGTTAAACCAAGCGGTATGCCGTATGAACAGGCAATGACGACCCGCGTTCTGAAACCACTGAAACTGGACCATACGTGGATCAACGTACCAAAAGCCGAAGAGGCCCACTACGCCTGGGGTTATCGTGACGGGAAAGCAGTACGCGTGTCGCCAGGGATGCTGGACGCCCAGGCTTATGGCGTCAAAACCAATGTACAAGATATGGCGAACTGGGTAATGGCTAATATGGCACCAGAGAATGTGGCCGATGCGTCACTGAAACAAGGCATCGCACTGGCGCAATCCCGTTATTGGCGTATCGGGTCCATGTATCAAGGTCTGGGCTGGGAGATGCTGAACTGGCCGGTTGAGGCGAACACCGTCGTTGAGGGCTCGGACTCAAAAGTGGCACTGGCCCCGCTGCCAGTAGCGGAGGTGAATCCACCGGCACCGCCGGTCAAAGCGTCATGGGTCCATAAAACGGGTTCTACGGGTGGTTTCGGCGCTTACGTTGCATTCATCCCAGAAAAACAAATCGGCATCGTAATGCTGGCTAATACAAGTTACCCGAACCCGGCGCGCGTAGAGGCGGCATATCACATTCTGGAAGCTCTGCAG
2.如權(quán)利要求1所述內(nèi)酰胺酶-RGD4C融合蛋白，它具有SEQIDN0 :2所示的氨基 酸序列CDCRGDCFCGGGGS TPVSEKQLAE VVANTITPLM AAQSVPGMAV AVIYQGKPHY YTFGKADIAA NKPVTPQTLF ELGSISKTFT GVLGGDAIAR GEISLDDAVTRYWPQLTGKQ WQGIRMLDLA TYTAGGLPLQ VPDEVTDNAS LLRFYQNWQPQWKPGTTRLY ANASIGLFGA LAVKPSGMPY EQAMTTRVLK PLKLDHTWINVPKAEEAHYA WGYRDGKAVR VSPGMLDAQA YGVKTNVQDMANWVMA NMAPENVADASLKQ GIALAQSRYff RIGSMYQGLG WEMLNWPVEA NTVVEGSDSKVALAPLPVAE VNPPAPPVKA SWVHKTGSTG GFGAYVAFIPEKQIGIVMLA NTSYPNPARVEAAYHILEALQ。
3.如權(quán)利要求1所述內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白，其中所述內(nèi)酰胺酶為內(nèi)酰 胺酶(genebank No :X07234)的一個(gè)突變型(K21/A, S324/A)。
4.一種制備權(quán)利要求1所述內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白的方法，其特征在于按以下步 驟進(jìn)行(1)融合基因的構(gòu)建包括合成低聚核苷酸，使用重組PCR技術(shù)將序列融合至內(nèi)酰 胺酶成熟肽；(2)融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建將高分子DNA連接入表達(dá)用質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化表達(dá)用大腸桿 菌宿主細(xì)胞后振蕩培養(yǎng)，以IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)；(3)破菌后離心收集上清液用金屬鎳螯合親和層析進(jìn)行純化，再經(jīng)冷凍干燥收集目的 蛋白，既內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白的制備方法，其中的低聚核苷酸的長(zhǎng) 度為1200個(gè)堿基或以下。
6.權(quán)利要求1所述0_內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白在藥物治療乳腺癌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白及其制備方法。該重組β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白的氨基酸序列包含了源于β-內(nèi)酰胺酶的蛋白序列以及含短肽RGD的序列。本發(fā)明的重組β-內(nèi)酰胺酶-RGD融合蛋白既具有β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)和功能，又具有細(xì)胞粘附活性，這種融合蛋白能夠定位到腫瘤部位具有較好的靶向性?？捎糜诳贵w導(dǎo)向酶前藥療法，與頭孢菌素類前藥合用可以用于治療乳腺癌等一系列實(shí)體瘤，效果優(yōu)于單用美法侖且毒性很小。
文檔編號(hào)C12N9/96GK101824406SQ200910068038
公開日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者呂茜茜, 周曉靚, 施培基, 王浩, 王榮先 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所