微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶的方法。
【背景技術】
[0002]γ -內(nèi)酰胺酶(γ -1actamses，EC 3.5.2.-)是催化酰胺類化合物酰胺鍵水解的一種新型酰胺酶。(+) γ -內(nèi)酰胺酶能夠高效率動力學拆分外消旋體γ -內(nèi)酰胺，獲得光學純的(-)j-內(nèi)酰胺。光學純的(-)j-內(nèi)酰胺是制備抗病毒藥物的手性中間體，是抗艾滋病藥物(-)阿巴卡韋和(-)卡巴韋的合成原料，也是抗流感藥物帕拉米韋的合成原料。此外，γ -內(nèi)酰胺酶催化外消旋體γ -內(nèi)酰胺還可獲得不同構型的γ-氨基丁酸類似物(GABA)。GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質，它參與多種代謝活動，具有很高的生理活性[I]。人們在發(fā)現(xiàn)(+) γ -內(nèi)酰胺酶之前，一般采用不對稱合成的方法制備光學純的(-)γ -內(nèi)酰胺，此方法的缺點是原料昂貴、工藝繁瑣、生產(chǎn)成本高、造成環(huán)境污染，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[2]。運用γ -內(nèi)酰胺酶進行工業(yè)化生產(chǎn)(-)γ -內(nèi)酰胺，具有反應條件溫和、工藝簡單、生產(chǎn)成本低、環(huán)境友好、產(chǎn)物光學純度高等優(yōu)點。目前對微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶的研宄處于γ-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌種的選育和產(chǎn)酶條件優(yōu)化[3?5]、酶學性質以及相關基因克隆階段[6?8]，且主要集中于中溫γ-內(nèi)酰胺酶，目前國內(nèi)外還未見微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的相關研宄報道，微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶具有廣闊的開發(fā)潛力和應用前景。
[0003]參考文獻:
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶的方法，該方法是將能產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶菌種先活化，再經(jīng)過低溫馴化，最后于10?16°C下液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫γ-內(nèi)酰胺酶經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法具體包括以下步驟:
[0013](I)將能產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶菌種先活化，再逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，30°C —25°C —22°C —20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，當菌種在低溫環(huán)境中穩(wěn)定生長即馴化結束；該菌種的低溫馴化培養(yǎng)基組成為:酵母膏0.2?5.0g, N-乙酰-L-苯丙氨酸
1.0 ?10.0g，NH4Cl 2.0 ?15.0g，Na2HPO4 0.1 ?1.0g，NaH2PO4 0.1 ?1.0g，MgSO4 0.05 ?0.5g，瓊脂粉20g，自來水1.0L, pH為6.0?8.0，于103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0014]所述的能產(chǎn)生Y -內(nèi)酰胺酶菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號:1.219或1.758或1.1830 ；
[0015](2)按常規(guī)方法將步驟⑴中低溫馴化后的γ -內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng)基中于10?16°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；所述的液體種子培養(yǎng)基:酵母膏 20.0 ?25.0g，蛋白胨 10.0 ?20g，NaCl 10.0 ?15.0g, MgSO4 0.05 ?0.5g，ZnSO4.7H20 2.4 ?8.0mg，自來水 1.0L，pH 為 6.0 ?8.0，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌30min ；
[0016](3)將液體二級種子按發(fā)酵液體積的3?9%接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10?16°C培養(yǎng)72?144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶結束；所述的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基:牛肉膏10.0?25.0g，蛋白胨2.0?20.0g,乙酰胺5.0?20g，Tween80 0.1?
0.4g，(NH4)2SO4 1.0 ?1.5g，KH2PO4 1.4 ?2.0g, MgSO4 0.1 ?0.4g，CaCl2 0.2 ?0.3g，ZnSO4.7H20 2.4 ?8.0mg，自來水 1.0L，pH 為 5.0 ?8.0，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌30min ；
[0017](4)將步驟(3)的發(fā)酵液在4000?8000rpm離心收集菌體，超聲破碎，收集到的上清液即為粗酶液；
[0018](5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，還可以將步驟(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0019]進一步的，步驟(I)產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶菌種的活化培養(yǎng)基為:酵母膏20.0g，蛋白胨 10.0g, NaCll0.0g，瓊脂 20.0g,自來水 1.0L, ρΗ7.4，于 103kpa，121 °C 高壓蒸汽滅菌30mino
[0020]本發(fā)明中能產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶菌種初期活化和生長條件按中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提供的說明進行。菌種先活化、再經(jīng)過逐級低溫馴化后發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶時按本發(fā)明產(chǎn)酶條件進行培養(yǎng)，低溫馴化后的菌種在4°c環(huán)境中可保存2個月，用10?25vt%甘油制成的菌懸液、在_80°C條件下可以長期保藏。
[0021]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0022](I)本發(fā)明生產(chǎn)的低溫γ -內(nèi)酰胺酶經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理并不會影響產(chǎn)品的品質，尤其是在低溫下還具有高酶活力及高催化效率；提高了生產(chǎn)效率，改善并提高產(chǎn)品質量；
[0023](2)本發(fā)明的方法簡化了加工工藝，縮短加工時間并從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備的環(huán)節(jié)，省卻昂貴的加熱或冷卻費用，降低了生產(chǎn)成本，在節(jié)能方面有相當大的優(yōu)勢；
[0024](3)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫Y -內(nèi)酰胺酶主要應用于拆分外消旋體γ -內(nèi)酰胺，獲得光學純的㈠γ -內(nèi)酰胺，低溫γ -內(nèi)酰胺酶的應用可進一步提高原料的利用率及轉化率，而且該酶制劑在應用中操作簡單、方便、快捷、成本低，具有更廣闊的工業(yè)開發(fā)價值與市場應用優(yōu)勢。
【具體實施方式】
[0025]下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不限制本發(fā)明。
[0026]實施例1
[0027](I)培養(yǎng)基制備
[0028]①菌種活化培養(yǎng)基:酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g, NaCll0.0g，瓊脂20.0g,自來水
1.0L, pH7.4，于 103kpa，121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0029]②菌種低溫馴化培養(yǎng)基:酵母膏0.2g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0g, NH4Cl 2.0g,Na2HPCM 0.lg, NaH2PCM 0.lg, MgSO4 0.05g，瓊脂粉 20g，自來水 1.0L, pH 值為 6.0，于103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0030]③液體種子培養(yǎng)基:酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g, MgSO4 0.05g ；ZnSO4.7H20 2.4mg，自來水 1.0L, pH6.0，于 103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0031]④液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基:牛肉膏10.0g，蛋白胨2.0g，乙酰胺5.0g，Tween80 0.lg,(NH4)2SO4 1.0g, KH2PO4 1.4g，MgSO4 0.lg, CaCl2 0.2g，ZnSO4.7H20 2.4mg，自來水 1.0L, pH值 5.0，121 °C，于 103kpa，121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0032](2)將產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMC