調(diào)節(jié)植物中ω酰胺酶表達(dá)以增加植物生長的制作方法
【專利說明】調(diào)節(jié)植物中《酰胺酶表達(dá)以增加植物生長
[0001] 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/US2011/026552,國際申請日為2011年2月 28日，進(jìn)入中國國家階段的申請?zhí)枮?201180021352.X"，發(fā)明名稱為"調(diào)節(jié)植物中《酰胺 酶表達(dá)以增加植物生長"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 本申請要求2010年2月28日提交的美國臨時專利申請第61/308, 971號的權(quán)益， 其公開通過引用全文納入本文。
[0004] 聯(lián)邦資助的研宄或開發(fā)下完成發(fā)明的權(quán)利聲明
[0005] 本發(fā)明是在美國能源部授予洛斯阿拉莫斯國家安全有限公司（LosAlamos NationalSecurity,LLC)的第DE-AC52-06NA25396合同號的政府資助下進(jìn)行的。政府享有 本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0006] 以ASCII文本文件提交序列表
[0007] 下面以ASCII文本文件提交的內(nèi)容通過引入全文納入本文：序列表的計算機可讀 形式（CRF)(文件名：686522000440SEQLISTING.txt，記錄日期：2011 年 2 月 28 日，大?。?158KB)〇 技術(shù)背景
[0008]因為世界范圍內(nèi)人口增加并且可用耕地持續(xù)被毀壞或者被損壞，對更有效和可持 續(xù)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的需求是人類的重要利益。提高農(nóng)作物產(chǎn)量，蛋白含量和植物生長速率代表了 能應(yīng)對現(xiàn)有挑戰(zhàn)的更有效農(nóng)業(yè)系統(tǒng)發(fā)展的主要目標(biāo)。
[0009] 近些年，由于很多發(fā)展良好的農(nóng)作物的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到平臺期，僅增加了改善作物 生產(chǎn)技術(shù)的重要性。很多農(nóng)業(yè)活動對時間敏感，成本和利潤依賴于農(nóng)作物的快速周轉(zhuǎn)或上 市時間。因此，快速農(nóng)作物生長對很多涉及高價值作物（例如谷物、植物、衆(zhòng)果和其他水果） 的農(nóng)業(yè)企業(yè)是經(jīng)濟上重要的目標(biāo)。
[0010] 遺傳工程改造在發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)技術(shù)上已經(jīng)并且繼續(xù)發(fā)揮越來越重要但是有 爭議的作用。近年來已經(jīng)開發(fā)出很多遺傳改良植物和相關(guān)技術(shù)，其中很多目前已廣泛使 用，（Factsheet:GeneticallyModifiedCropsintheUnitedStates(情況說明書：美 國的遺傳改良農(nóng)作物），皮氏食品與生物科技資訊基金會（PewInitiativeonFoodand Biotechnology)，2004 年 8 月，http://pewagbiotech.org/resources/factsheets)〇米用 轉(zhuǎn)基因植物變種目前非常重要并且呈上升趨勢，2006年約2. 5億英畝種植轉(zhuǎn)基因植物。
[0011] 盡管接受轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)特別在美國、加拿大和澳大利亞逐漸增加，世界上很多 地區(qū)特別是歐洲在接受農(nóng)業(yè)遺傳改良植物上仍然緩慢。因此，與遵循負(fù)責(zé)的和可持續(xù)農(nóng)業(yè) 的目標(biāo)一致，對發(fā)展不向植物和/或環(huán)境引入毒素或其他潛在問題物質(zhì)的遺傳工程改造植 物有強烈興趣。對實現(xiàn)如提高除草劑耐受性、蟲害和疾病抗性和整體農(nóng)作物產(chǎn)量等目標(biāo)的 成本最小化也有強烈興趣。因此，仍需要能符合這些目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因植物。
[0012]通過對多個植物調(diào)節(jié)系統(tǒng)的很多研宄尋求快速植物生長的目標(biāo)，其中很多調(diào)節(jié)系 統(tǒng)尚未完全理解。特別地，沒有完全闡明協(xié)調(diào)碳和氮代謝的植物調(diào)節(jié)機制。假定這些調(diào)節(jié) 機制對植物生長和發(fā)育有根本性影響。
[0013] 光合生物中碳和氮的代謝必須以協(xié)調(diào)的方式調(diào)節(jié)以確保有效利用植物資源和能 量。目前對碳和氮代謝的理解包含作為更大系統(tǒng)的子系統(tǒng)的一些步驟和代謝通路的細(xì)節(jié)。 在光合生物中，碳代謝開始于C02固定，其通過兩個主要過程完成，名為C-3和C-4代謝。 C-3代謝的植物中，酶核酮糖二磷酸羧化酶（RuBisCo)催化C02和核酮糖二磷酸的組合以生 成3-磷酸甘油酸，其是植物用于合成含碳化合物的三碳化合物（C-3)。C-4代謝的植物中， 〇)2和磷酸烯醇丙酮酸結(jié)合，在由酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)中形成含4碳的酸 (C-4)。所述酸轉(zhuǎn)移到維管束鞘細(xì)胞，脫羧釋放C02，然后在與C-3植物使用的相同反應(yīng)中結(jié) 合核酮糖二磷酸。
[0014] 許多研宄發(fā)現(xiàn)多個代謝物在植物調(diào)節(jié)氮代謝中重要。這些化合物包含有機酸蘋果 酸和氨基酸谷氨酸和谷氨酰胺。通過光合生物經(jīng)酶谷氨酰胺合成酶（GS)作用來進(jìn)行氮同 化，所述谷氨酰胺合成酶催化氨和谷氨酸結(jié)合形成谷氨酰胺。
[0015] 通過催化添加氨到谷氨酸以在ATP依賴性反應(yīng)中形成谷氨酰胺，GS對植物中氮同 化起重要作用（Miflin和Habash，2002,JournalofExperimentalBotany，第 53 卷第 370 期，第979-987頁）。GS也再同化作為光呼吸和蛋白及氮運轉(zhuǎn)化合物降解的結(jié)果而釋放出 的氨。GS酶可以分成兩大類，一個代表胞質(zhì)形式（GS1)而另一個代表質(zhì)體（即葉綠體）形 式（GS2)。
[0016] 盡管報道不一致，前面的工作已經(jīng)顯示GS1表達(dá)水平增加造成GS活性和植物生長 的水平增加。例如，F(xiàn)uentes等報道CaMVS35啟動子驅(qū)動的煙草中苜蓿（Alfalfa)GSl過 表達(dá)（胞質(zhì)形式）造成葉組織中GS表達(dá)和GS活性水平的增加，氮饑餓下的生長增加，但 是對最優(yōu)氮施肥條件下的生長沒有影響（Fuentes等，2001，J.Exp.Botany52:1071-81)。 Temple等報道過量表達(dá)全長苜蓿GS1編碼序列的轉(zhuǎn)基因煙草植物包含水平大幅提高 的GS轉(zhuǎn)錄物，和組裝成活性酶的GS多肽，但是沒有報道生長的表型效果（Temple等， 1993，MolecularandGeneralGenetics236:315-325)。Corruzi等已經(jīng)報道在CaMVS35 啟動子控制下過量表達(dá)豌豆胞質(zhì)GS1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因煙草顯示GS活性增加，胞質(zhì)GS蛋白 增加和生長特性提高（美國專利號6, 107, 547)。Unkefer等更近期報道葉部組織中過量表 達(dá)苜蓿GS1的轉(zhuǎn)基因煙草植物按照通過自花授精實現(xiàn)GS1轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)目增加的遺傳分離 就葉-根（leaf-t〇-r〇〇t)GS活性增加進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)基因煙草植物在其葉部生成 2-羥基-5-氧脯氨酸水平增加，發(fā)現(xiàn)引起生長率顯著高于野生型煙草植物（見美國專利號 6, 555, 500 ;6, 593, 275 和 6, 831，040)。
[0017]Unkefer等進(jìn)一步描述了使用2-羥基-5-氧脯氨酸（也稱為2-氧代縮環(huán)戊酸單酰 胺（2-oxoglutaramate))提高植物生長（美國專利號 6, 555, 500 ;6, 593, 275 ;6, 831，040)。
[0018] 特別地，Unkefer等公開了葉部組織中2-羥基-5-氧脯氨酸濃度的增加（相對于 根組織）產(chǎn)生造成植物生長特性增加的級聯(lián)事件。Unkefer等描述某些方法，所述方法可以 增加2-羥基-5-氧脯氨酸的葉部濃度以引起植物生長特性的增加，特定通過向植物的葉部 直接應(yīng)用2-羥基-5-氧脯氨酸和優(yōu)先在葉組織中過量表達(dá)谷氨酰胺合成酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明是基于增加植物根組織中《酰胺酶（Q酰胺酶）表達(dá)造成植物的信號代 謝物2-氧代縮環(huán)戊酸單酰胺和相關(guān)脯氨酸分子的葉-根比率增加的驚人發(fā)現(xiàn)。另外，植物 根組織中《酰胺酶表達(dá)的增加造成葉組織中《酰胺酶表達(dá)的下降。有利地，調(diào)節(jié)植物中 ?酰胺酶的表達(dá)產(chǎn)生氮利用效率提高的植物，進(jìn)而造成生長和其他農(nóng)藝學(xué)特性的提高，包 含更快的生長速率，更多的種子和果實/莢產(chǎn)量，更早和更多產(chǎn)的開花，對高鹽條件的耐受 性增加和提高的生物量產(chǎn)量。
[0020] 因此，本發(fā)明一方面涉及包含《酰胺酶轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述《酰胺酶 轉(zhuǎn)基因與根優(yōu)先性啟動子操作性連接。
[0021] 本發(fā)明的另一方面提供葉組織中內(nèi)源性W酰胺酶表達(dá)被抑制的轉(zhuǎn)基因植物。
[0022] 本發(fā)明的另一方面涉及使某一植物相對于相同種的野生型或未轉(zhuǎn)化植物的氮利 用效率提高的方法，通過：(a)向植物中引入《酰胺酶，其中所述《酰胺酶轉(zhuǎn)基因與根優(yōu) 先性啟動子操作性連接；(b)在所述植物根組織或所述植物后代中表達(dá)《酰胺酶轉(zhuǎn)基因； 和（c)選擇相對于不含《酰胺酶轉(zhuǎn)基因的相同種植物中2-氧代縮環(huán)戊酸單酰胺的葉-根 比率增加的植物，其中所述2-氧代縮環(huán)戊酸單酰胺的葉-根比率增加使得氮利用效率提 尚。
[0023] 本發(fā)明的另一方面涉及使某一植物相對于相同種的野生型或未轉(zhuǎn)化植物的氮利 用效率提高的方法，通過：(a)抑制植物的葉組織中內(nèi)源性《酰胺酶的表達(dá)；和（b)選擇 相對于不抑制葉組織中內(nèi)源性《酰胺酶表達(dá)的相同種植物內(nèi)2-氧代縮環(huán)戊酸單酰胺的 葉-根比率增加的植物，其中所述2-氧代縮環(huán)戊酸單酰胺的葉-根比率增加使得氮利用效 率提尚。
[0024] 附圖簡要說明
[0025] 圖1顯示氮同化和2-氧代縮環(huán)戊酸單酰胺生物合成的代謝通路的示意圖。
[0026] 圖2顯示擬南芥（Arabidopsisthaliana) ?酰胺酶與其他推定的植物《酰胺酶 的氨基酸序列比對。
[0027] 圖3顯示擬南芥（Arabidopsisthaliana) ?酰胺酶與其他推定的動物《酰胺酶 的氨基酸序列比對。
[0028] 圖4圖示植物鮮重值對2-氧代縮環(huán)戊酸單酰胺濃度的作圖。
[0029] 圖5顯示比較《酰胺酶轉(zhuǎn)基因和對照苜蓿植物的照片。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 定義
[0032] 除非另外定義，本文使用的所有術(shù)語、符號和其它科學(xué)術(shù)語旨在具有與本發(fā)明所 屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的相同含義。在一些情況中，本文出于闡明和/或便于引 用對具有常規(guī)理解含義的術(shù)語加以限定，本文中包括此類限定不應(yīng)理解為表示與本領(lǐng)域 常規(guī)理解的顯著差異。本文所述或所引用的技術(shù)和過程通常已充分了解并常采用本領(lǐng) 域技術(shù)人員的常規(guī)方法，例如，廣泛應(yīng)用的分子克隆方法描述在Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratoryManual(分子克隆：實驗室手冊）第三版（2001)紐約冷泉港的冷 泉港實驗室出版社（ColdSpringHarborLaboratoryPress);CurrentProtocolsin MolecularBiology(新編分子生物學(xué)實驗指南）（Ausbel等編，約翰韋利森公司（John Wiley&Sons，Inc)2001;TransgenicPlants