茄子查爾酮合成酶SmCHS1蛋白及其編碼基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及茄子花青素合成途徑中的關鍵酶及其編碼基因，具體涉及一種茄子查 爾酮合成酶SmCHSI蛋白及其編碼基因，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 人體內由于新陳代謝活動不可避免的會產(chǎn)生大量自由基，花青素作為一種強還原 性物質，能夠清除人體內的自由基，延緩機體衰老?；ㄇ嗨氐暮铣赏緩绞穷慄S酮合成途徑的 一部分，也是目前研宄的非常廣泛而深入的植物次生代謝途徑，其在主要模式植物如擬南 芥、矮牽牛中已被詳細闡述?；ㄇ嗨氐纳锖铣芍饕譃槿齻€階段：第一階段由苯丙氨酸到 香豆酰CoA，這是許多次生代謝共有的步驟；第二階段由香豆酰CoA到二氫黃酮醇，這是類 黃酮代謝的關鍵步驟，它合成花青素和其他黃酮物質的前體；第三階段是各類花青素的合 成。
[0003] 查爾酮合成酶是催化類黃酮合成途徑中的第一個關鍵酶，它催化丙二酰CoA的3 個乙酸基和0 _香豆酰CoA的1個乙酸基發(fā)生縮合反應，產(chǎn)生查爾酮，形成類黃酮物質的基 本碳架結構。利用X射線衍射對紫花苜蓿CHS基因的蛋白晶體結構進行解析，發(fā)現(xiàn)該酶是 一個同源二聚體蛋白，由兩個功能獨立的亞基組成，分子量為43kDa。該酶具有4個高度保 守的氨基酸殘基催化位點（Cysl64,Phe215,His303,Asn336)，用來進行脫羧作用和縮合反 應。在擬南芥CHS基因的啟動子部位發(fā)現(xiàn)MYB結合元件和光信號敏感元件ACGT，因此，CHS 是一類MYB和光調控蛋白。利用基因工程技術對CHS基因的表達進行調控能夠明顯影響花 青素的合成。將反義CHS基因轉入矮牽牛中發(fā)現(xiàn)花色明顯變淡，由紫紅色變成粉紅色甚至 白色。
[0004] 目前已從很多植物中克隆得到CHS基因，如擬南芥、水稻、矮牽牛、葡萄、大豆等。 茄子是花青素含量最為豐富的蔬菜作物之一，但對于茄子CHS基因的克隆、表達模式及其 啟動子序列目前尚不清楚。目前，未有任何與茄子CHS1基因及其編碼蛋白的相關文獻報 道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于填補茄子CHS家族成員的克隆、表達模式分析以及茄子CHS蛋 白及其編碼基因的空白。本發(fā)明提供了一種茄子CHS1的cDNA、gDNA以及氨基酸序列；進一 步地，本發(fā)明提供了茄子SmCHSI基因的亞細胞定位，還提供了茄子SmCHSI基因在不同組織 器官及低溫下的表達模式。本發(fā)明還提供了SmCHSI基因的啟動子序列及其元件分析。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質，所述蛋白質包 括：
[0008] (a)由如SEQIDN0. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或
[0009] (b)在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有茄 子查爾酮合成酶活性的由（a)衍生的蛋白質；
[0010] 該蛋白質在茄子不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。
[0011] 優(yōu)選地，所述蛋白質包括SEQIDN0. 3所示氨基酸序列經(jīng)過1~50個氨基酸的缺 失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20個以內氨基酸而得到的序列。
[0012] 優(yōu)選地，所述蛋白質為SEQIDN0. 3所示氨基酸序列中1~10個氨基酸被性質相 似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0013] 第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼所述具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質的基 因的核酸序列，所述基因的gDNA序列如SEQIDN0. 2所示。
[0014] 優(yōu)選的，所述基因的cDNA序列包括：
[0015] (a)如SEQIDNO. 1第1~1170位所示的堿基序列；或
[0016] (b)與SEQIDNO. 1第1~1170位所示的堿基序列具有至少70%的同源性的堿 基序列；或
[0017] (C)能與SEQIDNO. 1第1~1170位所示的堿基序列進行雜交的堿基序列。
[0018] 優(yōu)選的，所述核酸序列包括SEQIDNO. 1第1~1170位所示的核酸序列中1~90 個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內核苷酸形成的堿 基序列。
[0019] 第三方面，本發(fā)明提供一對用于擴增所述基因的核酸序列的gDNA的引物，所述引 物的序列如SEQIDN0. 7和SEQIDN0. 8所示。
[0020] 第四方面，本發(fā)明提供一對用于擴增所述基因的核酸序列的cDNA的引物，所述引 物的序列如SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6所示。
[0021] 第五方面，本發(fā)明還提供一種所述基因的核酸序列的啟動子，所述啟動子包括SEQ IDNO. 4所示的堿基序列。
[0022] 在本發(fā)明中，"分離的DNA"、"純化的DNA"是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位 于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開， 而且已經(jīng)與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。
[0023] 在本發(fā)明中，術語"SmCHSl蛋白編碼序列"指編碼具有茄子SmCHSl蛋白活性的多 肽的核苷酸序列，如SEQIDN0.1所示的第1~1170位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并 序列是指，位于SEQIDNO. 1所示的第1~1170位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相 同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO. 1 所示的第1~1170位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO. 3 所示的氨基酸序列。該術語還包括與SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的 核苷酸序列。
[0024] 該術語還包括能編碼具有與天然的茄子SmCHSl相同功能的蛋白的SEQIDNO. 1 所示序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~90個核苷酸的缺失、 插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個以內核苷酸。
[0025] 在本發(fā)明中，術語"SmCHSl蛋白"指具有茄子SmCHSl蛋白活性的SEQIDN0. 3所 示序列的多肽。該術語還包括具有與茄子SmCHSl蛋白相同功能的、SEQIDNO. 3序列的變 異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~50個氨基酸的缺失、插入和/或取 代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內氨基酸。例如，在本領域中，用性能 相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括茄子SmCHSl蛋 白的活性片段和活性衍生物。
[0026] 本發(fā)明的茄子SmCHSl蛋白的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異 體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與茄子SmCHSl相關DNA雜交的DNA 所編碼的蛋白、以及利用茄子SmCHSl蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0027] 在本發(fā)明中，"茄子SmCHSl保守性變異多肽"指與SEQ ID N0. 3所示的氨基酸序列 相比，有至多10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異 多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
[0028]表1
【主權項】
1. 一種具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質，其特征在于，包括： (a) 由如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或 (b) 在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有茄子查 爾酮合成酶活性的由（a)衍生的蛋白質。
2. 根據(jù)權利要求1所述的具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質，其特征在于，所述蛋 白質包括SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列經(jīng)過1~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或 者在C末端和/或N末端添加1~20個以內氨基酸而得到的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質，其特征在于，所述 蛋白質為SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列中1~10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所 替換而形成的序列。
4. 一種編碼權利要求1所述的具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質的基因的核酸序 列，其特征在于，所述基因的gDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。
5. 根據(jù)權利要求4所述的編碼所述具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質的基因的核 酸序列，其特征在于，所述基因的cDNA序列包括： (a) 如SEQ ID NO. 1第1~1170位所示的堿基序列；或 (b) 與SEQ ID NO. 1第1~1170位所示的堿基序列具有至少70%的同源性的堿基序 列；或 (c) 能與SEQ ID NO. 1第1~1170位所示的堿基序列進行雜交的堿基序列。
6. 根據(jù)權利要求5所述的編碼所述具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質的基因的核 酸序列，其特征在于，包括SEQ ID NO. 1第1~1170位所示的核酸序列中1~90個核苷酸 的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內核苷酸形成的堿基序列。
7. -對用于擴增權利要求4所述基因的核酸序列的gDNA的引物，所述引物的序列如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
8. -對用于擴增權利要求4或5所述基因的核酸序列的cDNA的引物，所述引物的序列 如 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
9. 一種權利要求4所述的具有茄子查爾酮合成酶活性的蛋白質的基因的核酸序列的 啟動子，其特征在于，所述啟動子包括SEQ ID NO. 4中所示的堿基序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種茄子查爾酮合成酶SmCHS1蛋白及其編碼基因，所述蛋白包括：(a)由如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有茄子查爾酮合成酶活性的由(a)衍生的蛋白質；所述編碼基因的cDNA和gDNA分別具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示堿基序列；該基因在根、莖、葉、花、果皮、果肉均有表達，果皮中的表達量顯著高于其他組織。低溫脅迫下，其表達量在48h達到最大值，為未處理的11.29倍。本發(fā)明為今后利用基因工程技術改良植物品質，獲得高抗氧化性的藥物或食物提供理論依據(jù)，具有很大的應用價值。
【IPC分類】C12N15-11, C12N9-90, C12N15-61, C12N15-113
【公開號】CN104745560
【申請?zhí)枴緾N201510112332
【發(fā)明人】陳火英, 蔣明敏, 任麗, 高莉潔, 周騰夏
【申請人】上海交通大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月13日